БАКТЕРИЯ, ПРИНАДЛЕЖАЩАЯ К РОДУ ESCHERICHIA, - ПРОДУЦЕНТ L-ЦИСТЕИНА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЦИСТЕИНА Российский патент 2006 года по МПК C12N1/21 C12P13/12 C12R1/19 

Область техники.

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-цистеина методом ферментации, и, более конкретно, к генам, полученным из бактерии Escherichia coli. Эти гены являются полезными для улучшения продукции L-цистеина.

Предшествующий уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию продуцируемой L-аминокислотой по принципу обратной связи (см., например, выложенную патентную заявку Японии №56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160).

Синтез L-цистеина из неорганической серы является основным механизмом, благодаря которому восстановленная сера включается в органические соединения микроорганизмов, таких как Salmonella и Escherichia coli. В этом процессе неорганический сульфат, самый распространенный источник утилизируемой серы аэробной биосферы, поступает внутрь клетки и восстанавливается до сульфида, который, в свою очередь, включается в L-цистеин с использованием механизма, аналогичного фиксации аммония в глутамин или глутамат. Функцию транспорта сульфата в клетку выполняет сульфатпермеаза, кодируемая генами cysTWA и sbp (sulphate binding protein - сульфат-связывающий белок). Два дополнительных механизма фиксации серы были описаны для S.typhimurium и Е.coli. Первый способ фиксации осуществляется благодаря реакции тиосульфата с О-ацетил-L-серином, катализируемой O-ацетилсерин(тиол)-лиазой-В, кодируемой геном cysM, с образованием тиосульфонат S-сульфоцистеина, который в дальнейшем восстанавливается до L-цистеина. При этом механизме транспорт тиосульфата в клетку осуществляется тиосульфатпермеазой, кодируемой генами cysPTWA. Кроме того, сульфид может включаться в О-ацетил-L-серин с помощью реакции, катализируемой O-ацетилсерин (тиол)-лиазой-А или В, кодируемых генами cysK и cysM, соответственно, с образованием L-цистеина. Второй механизм - это реакция взаимодействия О-сукцинил-L-гомосерина с сульфидом с образованием гомоцистеина, катализируемая цистатионин-γ-синтазой. (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).

Был опубликован процесс получения L-треонина путем ферментации микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, в котором экспрессия как минимум одного или более генов пути биосинтеза цистеина, выбранного (ых) из группы, включающей в себя гены cysG, cysB, cysZ, cysK, cysM, cysA, cysW, cysU, cysP, cysD, cysN, cysC, cysJ, cysl, cysH, cysE и sbp усилена (WO 03006666 A2).

Но в настоящее время нет данных, описывающих тот факт, что повышение экспрессии кластера генов cysPTWAM в клетках бактерии-продуцента L-цистеина, растущей на среде, содержащей тиосульфат, может приводить к улучшению продукции L-цистеина.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-цистеин, и предоставление способа получения L-цистеина с использованием указанных штаммов.

Данная цель была достигнута путем усиления экспрессии кластера генов cysPTWA, совместно с геном cysM, кодирующих систему транспорта в клетку сульфата/тиосульфата и O-ацетилсерин(тиол)-лиазу-В соответственно, что приводит к увеличению продукции L-цистеина у соответствующего штамма - продуцента L-цистеина в случае, когда указанный штамм культивируется в среде, содержащей тиосульфат. Таким образом, было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент L-цистеина, где указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия генов кластера cysPTWAM усилена.

2. Бактерия, в соответствии с п.1, в которой экспрессия генов кластера cysPTWAM усилена за счет увеличения количества копий генов кластера cysPTWAM или за счет модификации последовательности контроля экспрессии таким образом, что в результате такой модификации экспрессия этих генов усиливается.

3. Бактерия, в соответствии с п.2, в которой количество копий указанных генов увеличено в результате трансформации указанной бактерии многокопийным вектором, содержащим гены кластера cysPTWAM.

4. Бактерия, в соответствии с п.3, в которой природный промотор указанного кластера заменен на более сильный промотор.

5. Бактерия, в соответствии с п.4, в которой количество копий указанных генов увеличено путем интеграции дополнительных копий генов кластера cysPTWAM в хромосому указанной бактерии.

6. Бактерия, в соответствии с п.5, в которой гены кластера cysPTWAM получены из бактерии, принадлежащей роду Escherichia.

7. Бактерия, в соответствии с п.6, где бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что экспрессия открытой рамки считывания ydeD усилена.

8. Способ получения L-цистеина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с пунктами с 1 по 7, в питательной среде, содержащей тиосульфат, и выделения L-цистеина из культуральной жидкости.

9. Способ в соответствии с п.8, в котором у указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-цистеина.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.

Бактерией, согласно настоящему изобретению, является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент L-цистеина, в которой усилена экспрессия генов кластера cysPTWAM, приводящая к повышению продукции L-цистеина. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia - продуцент L-цистеина, модифицированная таким образом, что экспрессия генов кластера cysPTWAM указанной бактерией усилена.

Термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-цистеина» означает бактерию, способную накапливать L-цистеин в среде, когда такая бактерия согласно настоящему изобретению культивируется, в питательной среде. Способность к продукции L-цистеина может быть придана или усилена селекцией. Используемый здесь термин «бактерия, обладающая способностью к продукции L-цистеина» также означает бактерию, способную производить и накапливать в культуральной среде L-цистеин в количествах, больших, чем природный или родительский штаммы, и, прежде всего, означает, что микроорганизм способен производить и накапливать в среде L-цистеин в концентрациях не меньше, чем 0,5 г/л, более предпочтительно не меньше, чем 1,0 г/л.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).

Термин "модифицирована таким образом, что экспрессия гена(ов) усилена" означает, что уровень экспрессии гена(ов) повысился, по сравнению с не модифицированным, например, природным штаммом. В качестве примера можно привести случай, когда увеличено количество экспрессируемого(ых) гена(ов) в пересчете на клетку или случай, когда повышен уровень экспрессии гена(ов). Количество копий экспрессируемого гена можно измерить, например, с помощью рестрикции хромосомной ДНК, и последующей гибридизацией по Саузерну, с использованием сконструированного на основе нуклеотидной последовательности гена, зонда, флюоресцентной гибридизациии in situ (FISH) и так далее. Уровень экспрессии генов измеряется с помощью различных методов, включая гибридизацию по Нозерну, количественную обратную транскрипцию - ПЦР (RT-PCR) и подобные им. Далее, в качестве примера природного штамма, который является эталоном для сравнения, может быть упомянут штамм Escherichia coli К-12. В результате увеличения экспрессии гена(ов) появляется эффект увеличения накопления L-цистеина в питательной среде.

Увеличение экспрессии генов кластера cysPTWAM в бактериальной клетке может быть достигнуто путем увеличения количества копий генов кластера cysPTWAM или модификацией нуклеотидной последовательности контроля экспрессии указанных генов таким образом, что в результате модификации экспрессия этих генов усиливается.

В качестве генов кластера cysPTWAM, могут быть использованы гены, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia и гены, полученные из другой бактерии, такой как Salmonella. Среди вышеуказанных генов предпочтительны гены, полученные из бактерии, принадлежащей к роду Escherichia.

Нуклеотидная последовательность генов кластера cysPTWAM из Escherichia coli уже определена: для гена cysP - нуклеотиды с 2540532 по 2541548 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 16130350 в базе данных GenBank, (SEQ ID NO: 1), для гена cysT(cysU) - нуклеотиды с 2539699 по 2540532 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi:16130349 в базе данных GenBank, (SEQ ID NO: 3), для гена cysW - нуклеотиды с 2538824 по 2539699 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi: 16132224 в базе данных GenBank, (SEQ ID NO: 5), для гена cysA - нуклеотиды с 2537737 по 2538834 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi16130348: в базе данных GenBank, (SEQ ID NO: 7), для гена cysM - нуклеотиды с 2536692 по 2537603 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1, gi:16130347 в базе данных GenBank, (SEQ ID NO: 9). Кластер генов cysPTWAM располагается на хромосоме штамма Е.coli К-12 между локусом d2420 и локусом b2426. Таким образом, эти гены могут быть получены с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием затравок, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности указанного гена. Гены из других микроорганизмов, кодирующие транспортную систему сульфата/тиосульфата, могут быть получены таким же образом.

Примером генов кластера cysPTWAM, полученных из Escherichia coli, являются следующие ДНК:

- ген cysP, кодирующий следующий белок (А) или (В):

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:2, и который обладает активностью периплазматического тиосульфат-связывающего белка;

- ген cysT, кодирующий следующий белок (С) или (D):

(C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:4;

(D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:4, и который обладает активностью пермеазы сульфат/тиосульфат транспортной системы, вместе с белками (Е) или (F), и (G) или (Н);

- ген cysW, кодирующий следующий белок (Е) или (F):

(Е) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:6;

(F) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:6, и который обладает активностью пермеазы сульфат/тиосульфат транспортной системы, вместе с белками (С) или (D), и (G) или (Н);

- ген cysA, кодирующий следующий белок (G) или (Н):

(G) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:8;

(Н) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:8, и который обладает активностью пермеазы сульфат/тиосульфат транспортной системы, вместе с белками (С) или (D), и (Е) или (F);

- ген cysM, кодирующий следующий белок (I) или (J):

(I) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:10;

(J) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:8, и который обладает активностью O-ацетилсерин(тиол)-лиазы-В.

Термин "активность пермеазы сульфат/тиосульфат транспортной системы" означает активность белка, транспортирующего тиосульфат в клетку из внешней среды. Термин "активность O-ацетилсерин(тиол)-лиазы-В" означает каталитическую активность реакции между О-ацетил-L-серином и тиосульфатом с образованием S-сульфоцистеина. Наличие указанных активностей может быть определено, к примеру, методом комплементации, с использованием бактерий, имеющих мутации в соответствующих генах.

ДНК, кодирующая вышеуказанные белки согласно настоящему изобретению включает в себя ДНК, кодирующую белок, который может содержать делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность в одной или более позициях белков (А), (С), (Е), (G) и (I), при условии, что они не вызывают потерю активности указанного белка. Несмотря на то, что количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 30, предпочтительно от 2 до 20, и более предпочтительно от 2 до 10 для белка, состоящего примерно из 300 аминокислотных остатков. ДНК, кодирующая практически такие же белки, как и белки, описанные в пунктах (А), (С), (Е), (G) и (I) могут быть получены, например, модификацией нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, описанный в пункте (А), (С), (Е), (G) или (I) с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.

ДНК, содержащая кластер генов cysPTWAM, включает в себя варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, в виду природного разнообразия.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺ pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным ему.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, с помощью традиционных методов, для того, чтобы усилить экспрессию генов в бактериальной клетке.

Кроме того, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора взамен природного. Термин "природный промотор" означает существующую в природном организме область ДНК, расположенную перед открытой рамкой считывания (ORF - opened reading frame) гена и способствующую экспрессии этого гена. Общая трансляция генов кластера cysPTWA свидетельствует о том, что эти гены экспрессируются как одна транскрипционная единица с промотора, расположенного прямо перед геном cysP. В хромосоме Е.coli ген cysM отделяют от гена cysA всего 174 п.о., и этот ген также может являться частью оперона cysPTWA, который на хромосоме транскрибируется против часовой стрелки (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Сила промотора определяется частотой акта инициации синтеза РНК. Методы оценки силы промотора и примеры сильных промоторов описаны у Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994).

Усиление трансляции может быть достигнуто путем введения в ДНК согласно настоящему изобретению более эффективной последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательности) вместо природной SD последовательности, где под SD последовательностью подразумевается область находящейся на цепи перед старт кодоном мРНК, взаимодействующая с 16SPHK рибосомы (Shine J. and Dalgamo L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, 71,4, 1342-6). Термин "природная SD последовательность" означает SD последовательность, существующую в природном организме. SD последовательность гена ϕ10 из фага Т7 может служить примером эффективной SD последовательности (Olins P.O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235).

Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением количества копий генов в клетке. Также возможно увеличить количество копий генов кластера cysPTWAM путем комбинирования интеграции одного или нескольких генов указанного кластера с введением одного или нескольких генов кластера на многокопийном векторе.

Методы получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения ДНК плазмид, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, отбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и другие подобные методы являются обычными методами, хорошо известными для специалиста в указанной области техники. Перечисленные методы описаны в Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) или подобных изданиях.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-цистеина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-цистеина.

В качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии, обладающие способностью к продукции L-цистеина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы E.coli JM15 и E.coli MG1655, трансформированные различными аллелями cysE, кодирующими устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи сериновую ацетилтрансферазу (патент США 6,218,168, патентная заявка России 2003121601 соответственно), штамм E.coli W3110, обладающий генами, кодирующими белок, способный к экскреции токсичных для клетки соединений (патент США 5972663), штаммы Е.coli, содержащие цистеиновую десульфогидразу со сниженной активностью (патентная заявка Японии JP 11155571А2), штамм E.coli W3110, с повышенной активностью позитивного регулятора транскрипции цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (заявка РСТ WO 0127307 A1), и подобные им штаммы.

Ранее было показано, что ген ydeD, кодирующий мембранный протеин, не участвующий в пути биосинтеза ни одной из L-аминокислот, может повысить продукцию L-цистеина в случае, когда дополнительные копии указанного гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента (патент США 5972663). Таким образом, желательно, чтобы бактерия-продуцент L-цистеина была бы в дальнейшем модифицирована таким образом, чтобы экспрессия открытой рамки считывания ydeD была усилена.

Бактерия согласно настоящему изобретению может иметь повышенную экспрессию генов биосинтеза L-цистеина. Такие гены, позитивно влияющие на биосинтез L-цистеина, включают в себя ген cysE, кодирующий устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи сериновую ацетилтрансферазу, и подобные гены.

Способ согласно настоящему изобретению включает в себя способ продукции L-цистеина, включающий стадии культивирования бактерий, согласно настоящему изобретению, в питательной среде с целью продукции и накопления L-цистеина в питательной среде, и выделения L-цистеина из культуральной жидкости.

В способе согласно настоящему изобретению выращивание бактерии, накопление и выделение L-цистеина из культуральной жидкости может быть осуществлено способом, подобным способу, традиционно используемому для продукции аминокислот методом ферментации с использованием бактерий. Питательная среда для выращивания может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что она содержит источники углерода, азота и серы, минеральные соединения и, если необходимо, питательные добавки в количестве, необходимом для роста бактерии. Источники углерода включают в себя различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от способности к их усвоению используемыми бактериями, могут быть использованы спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источников азота используются аммиак, различные соли аммония, такие как сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и микробный ферментализат. В качестве источников серы, согласно настоящему изобретению, используются тиосульфаты. В качестве минеральных соединений используются однозамещенный фосфат калия, хлорид натрия, хлорид кальция, соли магния, соли железа, соли марганца, и подобные им.

При необходимости в среду могут быть добавлены и некоторые другие соединения. Например, если для роста микроорганизмам требуется метионин (метиониновая ауксотрофность) достаточное количество метионина может быть добавлено в среду культивирования.

Выращивание проводят предпочтительно в аэробных условиях, таких как взбалтывание и аэрация с перемешиванием, при температуре от 20°С до 42°С, предпочтительно от 34°С до 40°С. Значение рН обычно находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно в пределах от 6.5 до 7.2. рН среды может быть скорректировано аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания нерастворимые компоненты, такие как клетки, могут быть удалены из питательной среды методом центрифугирования или фильтрации на мембране, после чего целевая L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионного обмена, концентрации или кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения.

Настоящее изобретение будет детальнее разъяснено со ссылкой на следующие примеры. В примерах все аминокислоты имеют L-конфигурацию, если не указано другое. В качестве матрицы для всех описанных ниже ПЦР была использована хромосомная ДНК штамма Е.coli MG1655 (ВКПМ В-6195).

Пример 1. Конструирование плазмиды содержащей ген ydeD, мутантный ген cysE и мутантный ген serA5.

Ранее было показано, что тон ydeD кодирует трансмембранный белок, положительно влияющий на продукцию цистеина (патент США 5972663). Поэтому ген ydeD был амплифицирован с помощью ПЦР и клонирован. Затем мутантный ген cysEX, кодирующий устойчивую к ингибированию цистеином по принципу обратной связи сериновую ацетилтрансферазу, описанную в патенте США 6218168, был амплифицирован с помощью ПЦР и клонирован.

Также мутантный ген serA5 кодирующий фосфоглицератдегидрогеназу, устойчивую к ингибированию серином по принципу обратной связи, описанную в патенте США 6180373, был амплифицирован с помощью ПЦР и клонирован. Амплификация мутантного гена serA5 необходима для повышения внутриклеточной концентрации серина, являющегося предшественником L-цистеина.

В завершение, с помощью ПЦР был амплифицирован и клонирован промотор Р_ompA, при этом использовались праймеры, приведенные в списке последовательностей под номерами SEQ ID No.11 (праймер PrOMPAF) и No. 12 (праймер PrOMPAR). Праймер PrOMPAF содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы SalI. Этот сайт SalI был также введен в прямые праймеры, использованные для амплификации генов ydeD, cysEX и serAS. Таким образом, сайт SalI был использован для объединения промотора РотрА и каждого из указанных генов. Праймер PrOMPAR содержит на 5'-конце сайт узнавания рестриктазы PaeI. Эти рестрикционные сайты были введены для последующего объединения всех генов на одной плазмиде, используемой для трансформации.

Затем все три гена, каждый из которых находился под промотором Р_ompA, были клонированы на вектор pACYC184. Таким образом была получена плазмида pACYC-DES.

Пример 2. Клонирование генов cysPTWA из Е.coli.

Гены cysPTWA, кодирующие белки системы транспорта сульфата/тиосульфата в клетку, были амплифицированы с использованием праймеров, приведенных в списке последовательностей под номерами SEQ ID No.13 (праймер Mz025) и No.14 (праймер Mz026), для последующего клонирования. Праймер Mz025 представляет собой нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, расположенной, начиная с 315 п.о. перед старт-кодоном гена cysP с введенным на 5'-конец праймера сайтом узнавания рестриктазы PaeI. Праймер Mz026 представляет собой нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности, начиная с 13 п.о. после стоп-код она гена cysA, с введенным на 5'-конец праймера сайтом узнавания рестриктазы SalI. Полученный ПЦР фрагмент, содержащий кластер генов cysPTWA под собственным промотором, был обработан смесью рестриктаз PaeI и SalI, и вставлен в вектор pMW119, также предварительно обработанный теми же рестриктазами. Таким образом была получена плазмида pMW-PTWA.

Пример 3. Клонирование гена cysM из Е.coli.

Ген cysM, кодирующий O-ацетилсерин(тиол)-лиазу-В был клонирован с помощью ПЦР, с использованием праймеров, приведенных в списке последовательностей под номерами SEQ ID No.15 (праймер cysMF) и No.16 (праймер cysMR). Праймер cysMF содержит сайт рестрикции SalI, введенный в 5'-конец. Праймер cysMR содержит сайт рестрикции XbaI, введенный в 5'-конец.

Промотор P_cysK был получен с помощью ПЦР с использованием праймеров, приведенных в списке последовательностей под номерами SEQ ID No.17 (праймер PcyskF) и No.18 (праймер PcysKR). Нуклеотидная последовательность праймера PcysKF комплементарна последовательности, начиная с 6 п.о. перед старт кодоном гена cysK с введенным на 5'-конце сайтом рестрикции SalI. Нуклеотидная последовательность праймера PcysKR комплементарна нуклеотидной последовательности, начиная с 301 п.о. перед старт-кодоном гена cysK с введенным на 5'-конце сайтом рестрикции PaeI. Затем два полученных продукта ПЦР объединили путем обработки полученной смеси рестриктазой SalI, с последующим лигированием и клонированием в интегративный вектор pMW119int. Вектор pMW119int был сконструирован на основе коммерчески доступного вектора pMW119 путем введения сайтов фазмиды Mu attR и attL, необходимых для последующей Mu-интеграции. Таким образом была получена плазмида pMW-P_cysK-cysM.

Пример 4. Конструирование штамма Е.coli с повышенной активностью системы деградации L-цистеина.

Ранее гены tnaA и metC были описаны как гены, кодирующие белки основного пути деградации цистеина (патентная заявка Японии JP 2002271463). Таким образом, был сконструирован штамм Е.coli MG1655 с неактивной системой деградации L-цистеина (tnaA^-, metC^-).

Сначала была получена мутация в гене metC путем обработки нитрозогуанидином (NTG) с последующей многократной процедурой пенициллинового обогащения. Был отобран мутант, способный расти на цистатионине и не растущий на гомосерине. Затем в полученный штамм metC^- стандартной процедурой Р1 трансдукции (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) был перенесен разрушенный ген tnaA из штамма VKPM В-7427 (tnаА300::Тn10(Тс^R).

Таким образом был получен штамм Е.coli МТ.

Пример 5. Эффект влияния усиленной экспрессии генов кластера cysPTWAMua. продукцию L-цистеина.

Штамм Е.coli MT использовался в качестве родительского штамма для оценки эффекта влияния усиленной экспрессии генов кластера cysPTWAM на продукцию L-цистеина.

Сначала ген cysM интегрировали в хромосому штамма МТ с использованием плазмиды pMW-P_cysK-cysM по стандартной процедуре Mu-интеграции.

Затем плазмиды pACYC-DES и pMW-PTWA были последовательно введены в полученные трансдуктанты MTintCYSM с образованием штаммов MTintCYSM/pACYC-DES и MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA.

Оба штамма MTintCYSM/pACYC-DES и MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA выращивались ночь на качалке при 34°С в 2 мл питательного бульона с добавками 100 мг/л ампициллина и 25 мкг/мл стрептомицина. 0.2 мл полученных культур были инокулированы в 2 мл ферментационной среды, содержащей хлорамфеникол (30 мг/л) и ампициллин (100 мг/л) в пробирках 20×200 мм, и выращивались при 34°С в течение 42 часов на качалке при 250 об/мин. Использовался следующий состав ферментационной среды: 15.0 г/л (NH₄)₂SO₄, 1.5 г/л КН₂PO₄,1.0 г/л MgSO₄,20,0 г/л СаСО₃, 0.1 мг/л тиамина, 1% L-бульона, 4% глюкозы, 300 мг/л L-метионина и различные концентрации Na₂S₂O₃.

После выращивания количество накопленного в среде L-цистеина определяли с помощью метода, описанного Gaitonde, М.К. (Biochem. J., 104:2, 627-33 (1967)). Полученные данные представлены в Таблице 1.

Таблица 1ШтаммыКонцентрация тиосульфата, г/лКонцентрация L-цистеина, г/лMTintCYSM/pACYC-DES2.53.15.03.47.03.810.02.8MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA2.54.15.05.67.06.210.05.5

Для ферментации в мини-ферментерах по одной петле каждого из штаммов MTintCYSM/pACYC-DES и MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA, выращенных на L-агаре, перенесли в L-бульон и выращивали при 34°С со взбалтыванием (140 об/мин) до достижения оптической плотности OD₅₄₀≈2.0. Затем 25 мл посевной культуры внесли 250 мл ферментационной среды и выращивали при 34°С со взбалтыванием (1500 об/мин) в течение 48 часов.

Состав среды для ферментации в мини-ферментерах (г/л):

Триптон2.0Дрожжевой экстракт1.0(NH₄)₂SO₄5.0КН₂PCO₄1.5NaCl0.5MgSO₄·7H₂O0.3CaCl₂·2H₂O0.015FeSCO₄·7H₂O0.075Цитрат натрия·2Н₂O1.0Глюкоза100.0Метионин0.45

В среду для ферментации, начиная с 6 часа от начала ферментации, подавался тиосульфат со скоростью 0.4 г/л·ч.

После выращивания количество накопленного в ферментационной среде L-цистеина определялось, как описано выше. Полученные данные представлены в Таблице 2.

Таблица 2.ШтаммыКонцентрация L-цистеина, г/лMTintCYSM/pACYC-DES13.9MTintCYSM/pACYC-DES/pMW-PTWA6.6

Как видно из Таблиц 1 и 2, усиленная экспрессия генов кластера cysPTWAM приводит к повышению продукции цистеина у штамма МТ.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения L-цистеина с использованием бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, в котором продукция L-аминокислоты указанной бактерией увеличена за счет усиления экспрессии генов кластера cysPTWAM. Согласно данному способу бактерию выращивают в питательной среде, содержащей тиосульфат, и затем полученный и накопленный L-цистеин выделяют из культуральной среды. Заявленное изобретение позволяет получать L-цистеин с высокой степенью эффективности. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, - продуцент L-цистеина, модифицированная таким образом, что экспрессия генов кластера cysPTWAM усилена.2. Бактерия по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия генов кластера cysPTWAM усилена за счет увеличения количества копий генов кластера cysPTWAM или за счет модификации последовательности контроля экспрессии таким образом, что в результате такой модификации экспрессия этих генов усиливается.3. Бактерия по п.2, отличающаяся тем, что количество копий указанных генов увеличено в результате трансформации указанной бактерии многокопийным вектором, содержащим гены кластера cysPTWAM.4. Бактерия по п.3, отличающаяся тем, что природный промотор указанного кластера заменен на более сильный промотор.5. Бактерия по п.4, отличающаяся тем, что количество копий указанных генов увеличено путем интеграции дополнительных копий генов кластера cysPTWAM в хромосому указанной бактерии.6. Бактерия по п.5, отличающаяся тем, что гены кластера cysPTWAM получены из бактерии, принадлежащей роду Escherichia.7. Бактерия по п.6, отличающаяся тем, что бактерия дополнительно модифицирована таким образом, что экспрессия открытой рамки считывания ydeD усилена.8. Способ получения L-цистеина, включающий стадии выращивания бактерии по любому из пп.1-7, в питательной среде, содержащей тиосульфат, и выделения L-цистеина из культуральной жидкости.9. Способ по п.8, отличающийся тем, что у указанной бактерии усилена экспрессия генов биосинтеза L-цистеина.