СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к экспресс-методам диагностики миксоматоза.

Известны различные способы диагностики миксоматоза кроликов, в том числе обнаружение антигенов в пораженной коже с помощью флуоресцирующих антител, выявление антител, циркулирующих иммунных комплексов с использованием реакций связывания комплемента, реакции иммунодиффузии, реакции нейтрализации и иммуноферментного анализа (Гуненко В.В. и др. О диагностике и профилактике миксоматоза кроликов. Ветеринария, 1987, т.12, с.44-45). Недостатками известных способов являются трудоемкость, наличие дорогостоящего оборудования, невозможность определения наличия вируса в первые дни после заражения.

Целью изобретения является сокращение сроков обнаружения в организме животного возбудителя миксоматоза. Обнаружение возможно начиная с трех-шести часов после заражения.

Достижение поставленной цели основано на феномене немедленной активации, повышенной чувствительности и перенапряжении иммунокомпетентных клеток крови - лейкоцитов - на повторное воздействие вне организма того же антигена, который до этого внедрился в организм.

Способ диагностики миксоматоза кроликов осуществляется следующим образом. У исследуемого животного берут пробу крови. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносят 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняют в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.

Пробирки инкубируют в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови переносят в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрашивают генцианвиолетом. Подсчитывают число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитывают показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.

РСЛЛ считают положительной при показателе 10% и выше.

В случае сильного лейкоцитоза, когда затруднительно провести подсчет лейкоцитов, исследуемые контрольные и опытные пробы крови, дополнительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.

Пример 1.

Для определения рабочей дозы антигена (вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82") отобрали десять здоровых кроликов. Кровь от каждого кролика разделили на три пробы. В три пробирки с 0,05 мл 3%-ного раствора цитрата натрия внесли по 0,1 мл исследуемой крови. Затем в первую пробирку внесли 0,05 мл антигена - вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении четыре иммунизирующих дозы препарата на один мл физиологического раствора, во вторую - 0,05 мл вакцины в разведении две иммунизирующих дозы на один мл физиологического раствора, в третью - 0,05 мл вакцины в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.

Пробирки инкубировали в течение двух часов при температуре +37°, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольных и опытных пробирок по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Далее подсчитали число лейкоцитов во всех пробирках в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.

РСЛЛ для здоровых кроликов должна быть ниже 10%. Результаты представлены в табл. 1.

Как видно из таблицы 1 РСЛЛ во всех пробах не превышала 10%, поэтому рациональнее в качестве рабочей дозы антигена взять разведение вакцины против миксоматоза кроликов, сухой живой культуральной из штамма "В-82" из расчета одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора.

Пример 2.

Для ретроспективной диагностики миксоматоза в неблагополучном хозяйстве исследовали кровь кроликов.

На основании результатов клинического состояния кроликов были сформированы 4 группы животных по 5 голов в каждой (табл.2).

Первая группа - кролики-вирусоносители, со скрытой формой миксоматоза - находились в контакте с больными, но без клинических изменений. У отдельных были заметны бесшерстные участки, свидетельствующие об миксомных узлах в прошлом.

Во вторую группу - клинически больные миксоматозом - отобрали больных кроликов с отеками век, оснований ушных раковин, аногенетальной области, спины, с узелковыми ограниченными образованиями в коже ушей, головы и век.

Кролики третьей группы были вакцинированы с целью установления динамики лизиса лейкоцитов с момента внедрения миксоматозного антигена в организм животного, и для выявления особенностей реакции лизиса лейкоцитов у вакцинированных по сравнению с вирусоносителями.

Кролики четвертой группы - клинически здоровы и не инфицированы вирусом миксоматоза, служат контролем.

У животных всех групп определяли показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов. Для этого у животных брали пробы крови. Каждую пробу делили на опытную и контрольную. В опытную пробирку, содержащую 0,05 мл 3,8%-ного раствора цитрата натрия, вносили 0,1 мл исследуемой крови и рабочую дозу антигена - 0,05 мл вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" в разведении одна иммунизирующая доза на один мл физиологического раствора. Контрольную пробирку заполняли в том же объеме, но физиологический раствор - без антигена.

Пробирки инкубировали в термостате в течение двух часов при температуре +37°С, встряхивая через каждые 30 минут. Затем для разрушения эритроцитов из контрольной и опытной пробирки по 0,02 мл крови перенесли в пробирки с 0,4 мл 3%-ного раствора уксусной кислоты и подкрасили генцианвиолетом. Подсчитали число лейкоцитов в обеих пробах в камере Горяева и рассчитали показатель реакции специфического лизиса лейкоцитов (в процентах) по формуле:

где Лк и Ло - абсолютное количество лейкоцитов в контрольной и опытной пробе.

РСЛЛ считали положительной при показателе 10% и выше.

Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2
Показатели РСЛЛ у кроликов, больных миксоматозом, вакцинированных и здоровыхГруппы подопытных кроликовРСЛЛ, в %Продолжительность наблюдений в суткахСнижение % лизиса в среднем в сутки (%)в начале исследованияв конце исследования1. Скрытая форма, вирусоносители.30-4229-38100,252. Клинически больные миксоматозом62-7760-71100,403. Вакцинированные противомиксоматозной вакциной29-3621-28100,804. Интактные контрольные4-94-9100

Как видно из таблицы 2, скорость снижения процента лизиса лейкоцитов у вакцинированных кроликов в 3,2 раза больше, чем у кроликов-вирусоносителей со скрытой формой миксоматоза, и 2 раза больше, чем у клинически больных. У больных с клинической формой миксоматоза процент лизиса лейкоцитов за весь период наблюдений был очень высокий, достигал 60-77%.

В группе вакцинированных кроликов обнаруживали резкое увеличение процента лизиса лейкоцитов на третьи сутки. Это свидетельство того, что вакцины против миксоматоза кроликов сухой живой культуральной из штамма "В-82" вызывает состояние сенсибилизации лейкоцитов крови (ответственных за иммунитет) до образования в организме специфических антител.

Лизис лейкоцитов у интактных кроликов за весь период опыта не превышал 10%, т.е. находился в пределах нормы.

Исследование РСЛЛ позволяет диагнозцировать бессимптомное течение миксоматоза.

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использован для экспресс-диагностики миксоматоза кроликов. Сущность способа состоит в том, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего провести ускоренную диагностику на ранней стадии заболевания, а также выявить бессимптомное течение миксоматоза. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ диагностики миксоматоза кроликов, отличающийся тем, что проводят реакцию специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) с использованием противомиксоматозной вакцины из штамма В-82, рассчитывают показатель РСЛЛ и при его значении 10% и более диагностируют миксоматоз.2. Способ диагностики миксоматоза кроликов по п.1, отличающийся тем, что при лейкоцитозе пробы крови перед подсчетом лейкоцитов разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1 или 1:2.