Способ культивирования -форм Советский патент 1980 года по МПК C12K3/00 

Изобретение относится к области микробиологии. Известен способ культивирования L-форм Эгоропета paWidium путем пассирования культур L-форм на пита тельных средах в присутствии постепенно возрастающих концентраций пенициллина и инкубированием посевов 1 . Однако при известном способе уда ется поддерживать культуры в L-форме лишь в нескольких пассажах (3-10 а потом L-формы перестают расти. Целью изобретения является длительное поддержание культуры в Lформе. Эта цель достигается тем, что проводят пассаж на жидкую питательную среду, после инкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют до появлени вторичного роста культуры, затем пересевают на жидкую питательную среду, причем пенициллин вводят в питательную среду в Кс1ждом тассаже при появлении первых признаков рос та. Кроме того, концентрацию пеницилдина от пассажа к пассажу повышают до 4000 ЕД/мп, Способ осуществляют следующим образом. L-Формы бледной тpeпoнe 1Ы любого штамма, индуцированные или портиндуцированные, засевают по 0,3 мл на среду Китта-Тароцци или на cpejiy Китта-Тароцци с нормальной лошадиной сывороткой, MgSO, и сахарозой, После посева среду заливают слоем стерильного расплавленного вазелина. Посевы инкубируют в термостате при 36-38°С (оптимальная 37°Q); ежедневно просматривают. При появлении первых призна:ков видимого роста, что выражается легким помутнением среды и наличием активных размножающихся трепонем при микроскопии препаратов раздавленная капля под фазовоконтрастным или темнопол ьным микроскопом, в среду добавляют водный раствор пенициллина так, чтобы концентрация антибиотика в среде (ЕД/мл) была такой же, как и L-индуцирующая, при которой были получены L-формы у данной культуры. Посевы после этого

снова выдерживают 4-7 дней в термостате. Через указанный срок культуру со среды Китта-Тароцци пересевают в столбик полужидкого агара на основе триптического перевара бычьего сердца или пептона Мартена с нормальной лошадиной сывороткой, норг мальной сывороткой морской свинки,f с MgSO и сахарозой. Все тщательно перемешивают. Посев инкубируют в термостате при Зб-38°С (оптимальная 37°С) и ежедневно просматривают.

При появлении первых признаков видимого роста, что выражается легким помутнением среды или появлением отдельных колоний в нижних двух третях столбика среды и наличием активных размножающихся трепонем при микроскопии препаратов, в среду вносят раствор пенициллина так,чтобы концентрация его в среде была в 1,5-2 раза больше предыдущей в среде Китта-Тароцци, Посев снова инкубируют при 36-38°С (оптимальная 37°С) . Добавление пенициллина вызывает процесс L-трансформации. В течение 15-20 дней бледная трепояема полностью превращается в Ь формы, Инкубацию посевов в термостате продолжают до реверсии L-форм, что выражается появлением на 26-60-й день после посева второй волны роста вторичного роста. Это .сопровождается увеличением и нарастанием интенсивности зон помутнения в столбике среды, а.по периферии L-колоний появляются нежные облачковидные ореолы. В препаратах, приготовленных из этих зон роста, под фазовоконтрастным микроскопом обнаруживается реверсия L-форм и появление спиралевидных трепонем. Культуру вторичного роста пересевают сразу же или в пределах одного месяца на среду Китта-Тароции или на среду Китта-Тароцци со всеми указанными выше компонентами и далее культивирование L-форм осуществляют в ofL же последовательности,как описано, в зависимости от поставленной задачи по длительности культивирования L-форм,

Концентрации пенициллина в процессе культивирования повышают до тех пор, пока культура дает после воздействия антибиотиком на полужидкой среде вторичный рост, Если достигают предельной концентрации пенициллина,, при которой вторичный рост не появл ется то посев со среды Китта-Тароцциповторяют и культивирование продолжают без дальнейшего повышения концентраций пенициллина. Предельные L-индуцируюцие концентрации пенициллина зависят от индивидуальных особенностей штамма, культуры, состояния популяций, условий выращивания. Способ воспроизводим

при концентрации пенициллина 5004000 ЕД/мл.

После добавления пенициллина в жидкую среду и инкубации в термостате культуру до пересева в полужидс кую среду можно хранить при комнатной температуре до года.

Предлагаемый способ может быть модифицирован следующим образом.

При появлении вторичного роста Q на полужидкой среде эту же культуру можно снова превратить в Ь-фор№а повторным добавлением пенициллина S том же количестве, что и для индукции L-форм до вторичного роста, с продолжением инкубации посевов в 5 термостате. Реверсия L-форм прекращается после добавления пенициллина, трепонемы снова превращаются в L-формы, а через определенное время L-формы снова реверсируют и появля0 ется третья волна роста. Культура в этом состоянии также может быть пересеяна на среду Китта-Тароцци, и далее культивируют, как описано.

Способ может быть также использо5 ван и для первичного получения L-форм из исходной культуры.

Пример 1. L-Формы бледной трепонемы штамма Ставрополь- , полученные на 0,3%-ном агаре ,на ос0 нове триптического перевара бычьего сердца под воздействием 500 ЕД/мл пенициллина, засевают по 0,3 мл на среду Китта-Тароцци с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 0,05%

5 MgSO , 10% сахарозы (объем среды / 9 мл). Посевы заливают расплавленным вазелином (слоем 1,5-2 см). Инкубацию осуществляют в термостате при 37°С, посевы ежедневно просмат0 ривают. На 3-й день после посева в пробирке обнаружено легкое помутнение среды. Под фазовоконтрастным микроскопом при-микроскопии препарата раздавленная капля (увеличеj ние 40 10) обнаруживают хорошо подвижные, поперечно делящиеся трепонемы по 50-60 в поле зрения.. Готовят раствор пенициллина на дистиллированной воде концентрации 5000 ЕД/мл,

Q который вносят в среду по 1 мл, т.е. создают в питательной среде концентрацию пенициллина 500 ЕД/мл. Посевы

продолжают инкубировать в термостате при 37°С в течение недели. После внесения пенициллина через два дня

в теле трепонем появляются зернагранулы, в последующие пять дней образуются цисты и шаровидные формы, отмечают незначительный зернистый распад, в то же время сохраняются

отдельные спиралевидные формы. На

седьмой день после внесения пенициллина делают пересев по 0,3 мл культуральной жидкости на 0,3-ный агар на основе триптического перевара бычьего сердца с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 2% сыворотки морской сви ки, 0,05% MgSO и 10% сахарозы (объем среды 9 мл), Посевы инкубиру ют в термостате при и ежедневн просматривают. На седьмой день в столбике среды появляется облачкови ный рост и рост отдельных кгшоний. При микроскопии препаратов раздав ленная капля , приготовленных из зон роста или из отдельных колоний, обнаруживают трепонемы и реверсирую щие L-элементы, Внесением в среду в этот же день 1 мл водного раствор пенициллина концентрации 10000 ЕД/м создают концентрацию его в среде 1000 ЕД/мл.В течение 15-20 дней при микроскопии посевов наблюдают превращение трепонем в L-формы с образо ванием L-микроколоний с последующим ростом L-колоний, Культура бледной трепонемы полностью превратилась в L-формы, а на 30-й день после посева (23-й день после внесения пенициллина) в столбике среды отмечают увеличение интенсивности помутнения и зон роста за счет появления нежно го облачковидного роста по периферии зон роста и L-колоний, т.е. регистрируют вторичный рост. Микроско пией культуры выявлена реверсия L-форм с -превращением их в трепонемы. Культуру на следующий день снова пересевают на среду Китта-Тароцци с указанными компонентами. После пересева в эту же культуру вторичного роста снова вносят пенициллин из расчета 1000 ЕД/мл среды. Культу ра вторичного роста снова вся превращается в L-формы бледной трепоне мы с последующей реверсией и появле нием третьей волны роста на 90-й день. С посевом на среду Китта-Тароцци далее поступают так, как описано, т.е. инкубируют в термостате, при появлении первых признаков роста вносят пенициллин, выдерживают 4-7 дней в термостате, пересевают на полужидкий агар, инкубируют в термостате, при появлении первых признаков видимого роста вносят пенициллин, получают на этом этапе L-формы, продолжают инкубировать в термостате до появления вторичного роста, снова делают пересев на среду Китта-Тароцци и т.д. По мере необходимости получают L-формы и повторным воздействием пенициллина на культуры вторичного роста с дальнейшим пересевом культур третьей волны роста на среду Китта-Тароцци и т.д. Данная культура и ее структуры пассируют предложенным способом более 30 раз. Пример 2. Культуру L-форм бледной трепонемы штамма Ставрополь -vni получают воздействием 31 ЕД/мл пенициллина и десятикр.атно пассируют на 0,3%-ном агаре на основе триптического перевара бычьего сердца с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 1,5-2% нормгшьной сыворотки морской свинки, 0,05% MgSO и 10% сахарозы с постепенно повышаемыми концентрациями пенициллина от 31 до 500 ЕД/мл. После этого культуру L-форм десятого пассажа в количестве 0,3 мл пересевают на среду КиттаТароцци, заливают вазелином, инкубируют в термостате при 37°С. На 4-й день при появлении первых признаков видимого роста в среду вносят пенициллин из расчета 500 ЕД на 1 мл среды, трепонемы в течение 2-5 дней превращаются в цисты, сферические и зернистые формы. Посевы оставляют на хранение при комнатной температуре. Через год при микроскопии посевов обнаруживают цисты, зерна-гранулы. Культуры пересевают по 0,3 мл в столбик 0,3%-ного агара на основе триптического перевара бычьего сердца с 20% нормальной лошадиной сыворотки, 2% нормальной сыворотки морской свинки, 0,05% MgSO, 10% сахарозы. Инкубацию проводят в термостате при З7с. На 6-10-й день появляется рост большого количества очень мелких, еле видимых простым глазом колоний, которые состоят только из L-форм, В течение 10-15 -дней колонии увеличиваются в размерах и превращаются в L-колонии бледной трепонемы. Превращение в L-формы происходит при отсутствии L-индуцирующего агента в среде. Как noKasaJiH контроли, L-колонии у пассируемой L-культуры бледной трепонемы образуются не спонтанно, а вследствие воздействия пенициллина на культуру перед ее длительным хранением, L-индуцирующее действие пенициллина проявляется через год в субкультуре, В предшествующей культуре на среде Китта-Тароцци L-формы под воздействием пенициллина тотчас не образовывались, так как L-формы бледной трепонемы на жидкой питательной среде не образуются, но воздействие пенициллина таким образом сказалось на культуре, что она при пересеве ее через год на среду, оптимальную для образования L-форм, стала расти в виде L-форм, Бледная трепрнема превратилась в L-формы в результате феномена L-постиндукции, т,е, индукции L-форм, наступившей спустя длительное время .(через год) .в культуре поколения, следующего за предществующим, подвергшимся воздействию пенициллином в условиях, не оптимальных для превращения бледной трепонемы в L-формы. Постиндуцированные L-формы бледной трепонемы пересеяны на среду Китта-Тароцци с 20% нормальной лоша диной сыворотки, 0,05% MgSO и 10% сахарозы, среду заливают вазелином инкубируют в термостате при , На 4-й день появляются первые признаки видимого роста, морфология культуры обычная. В среду добавляют пенициллин из расчета 500 ЕД/мл сре да и посевы инкубируют в термостате 7 дней. На 7-й. день в культуре обна руживают цисты, зерна, шаровидные элементы. Культуру пересевают на 0,3%-ный агар на основе пептона мартена с. 20% нормальной лошадиной сыворотки, 2% номальнрй сыворотки морской свинки, 0,05%MgSO,, 10% сахарозы. Посевы инкубируют в термостате при 37°С. На 14-й день появ ляются первые признаки видимого рос та в виде легкого помутнения среды и отдельных колоний. При микроскопии обнаруживают трепонемы и реверсирующие L-элементы, в культуру, вносят пенициллин из расчета 1000 ЕД/мл среда, В течение 15-20 дней после внесения антибиотика под .микроскопом наблюдают интенсивный процесс L-трансформации, в результа те которого вся культура превращает ся в L-формы. L-Формы продолжают ин кубировать в термостате при 37°С и на 60-й день после посева обнаруживают вторичный рост, обусловленный реверсией L-формы, .Культуру вторичного роста снова пересевают на среду Китта-Тароцци с 0,05% MgSO . и 10% сахарозы и далее пассируют, как описано, более 30 раз. Формула изобретения .. 1, Способ культивирования L-форм Dreponemo paeeidum путем пассирования культур L-форм на питательных средах в присутствии постепенно возраста;о1дах концентраций пенициллина и инкубированием посевов, отличающийся тем, что, с целью длительного поддержания культуры в L-форме, проводят пассаж на жидкую питательную среду, после инкубирования пересевают на полужидкую питательную среду, посев инкубируют до появления вторичного роста культуры затем пересевают на жидкую питательную среду, причем пенициллин вводят в питательную среду в каждом пассажу при появлении первых признаков роста. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрацию пенициллина от пассажа к пассажу повышают до 4000 ЕД/мл. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Антибиотики, 11, 1974, с. 998-1003.