СПОСОБ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЖИДКИХ СРЕД Российский патент 2006 года по МПК A23L3/00 A23L3/3463 A23C3/00 A23C3/08 A23C9/12 C02F1/28 C02F1/48 C02F3/34 

Изобретение относится к области процессов стерилизации жидких сред и может найти применение в микробиологической, пищевой и медицинской промышленности.

Известны способы стерилизации жидких сред, состоящие в удалении из жидкой среды зародышей нежелательных микроорганизмов, например бактерий, грибов и их спор, а также вирусов с помощью мембранной фильтрации [1, 2, 3]. При этом максимально сохраняются многие неустойчивые, но необходимые компоненты стерилизуемой среды. Наиболее близким к заявляемому является способ, описанный в [3]. Однако эти способы имеют следующие недостатки:

а) производительность метода относительна невысока,

б) производительность резко уменьшается с увеличением вязкости стерилизуемой жидкости, поэтому ограничен круг сред, которые можно стерилизовать таким методом,

в) невозможно стерилизовать среды с необходимыми включениями, по размеру сравнимыми с размерами пор мембраны,

г) невозможно отделять нежелательные микроорганизмы от культивируемых клеток, субклеточных структур или вирусов.

Задачей настоящего изобретения является создание высокопроизводительного способа стерилизации широкого круга жидких сред, например жидких сред с повышенной вязкостью, или жидких сред с включениями или культивируемыми клетками, субклеточными структурами или вирусами.

Поставленная задача в способе стерилизации жидких сред, состоящем в удалении зародышей роста нежелательных микроорганизмов, решена за счет того, что предварительно определяют весь спектр нежелательных для данной жидкой среды микроорганизмов, затем на магнитоуправляемые микроносители иммобилизуют специфические рецепторы, реагирующие с поверхностными структурами зародышей нежелательных микроорганизмов, получая магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы (МССК), смешивают жидкую среду с пропорциональным количеством магнитоуправляемых микроносителей, инкубируют указанную смесь в течение времени, достаточного для протекания реакции указанных поверхностных структур с указанными соответствующими специфическими рецепторами, и воздействием магнитного поля удаляют микроносители с иммобилизованными на них таким образом зародышами роста нежелательных микроорганизмов.

Указанную смесь предпочтительно инкубируют при перемешивании, которое может быть постоянным или периодическим.

Магнитоуправляемые сорбенты предпочтительно состоят из магнитозависимого сердечника и полимерной оболочки, к которой присоединены специфические рецепторы.

Специфические рецепторы могут быть выбраны из белков, нуклеиновых кислот, полисахаридов животной или растительной природы, электрически заряженных молекул, фрагментов или целых частиц микроскопических организмов (вирусов, бактерий, спор бактерий и грибов, пыльцы растений) или синтетических молекул органической природы.

Заявляемый способ представлен в следующих неограничивающих примерах.

Пример 1.

Свежее коровье молоко путем микробиологического анализа проверили на обсемененность бактериями и грибками и установили в молоке наличие следующих видов микроорганизмов: Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae Penicillium digitatum. Путем смешения аликвот по 100 мг магнитоуправляемых микроносителей со стрептавидином с аликвотами по 1 мг биотинилированных антител к поверхностным антигенам Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae Penicillium digitatum, получили магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы (МССК) на данные микроорганизмы. К 1 л молока добавили 700 мг смеси МССК и при температуре 20°С и в течение 30 мин перемешивали в закрытой стеклянной емкости на магнитной мешалке. За этот период происходило полное реагирование зародышей всех вышеперечисленных микроорганизмов с МССК. С помощью перистальтического насоса молоко прокачали через магнитную ловушку в стерильную емкость с герметически закрывающейся крышкой. В магнитной ловушке под воздействием магнитного поля произошло отделение всех МССК вместе с иммобилизованными на них зародышами вышеперечисленных микроорганизмов от молока. В качестве контрольной пробы 1 л молока смешали с 700 мг магнитоуправляемых носителей со стрептавидином и далее обработали таким же образом, как и опытную пробу молока. Обе пробы поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа. После инкубации сравнили опытную и контрольную пробы молока. Опытная проба осталась без изменений, что свидетельствовало о полном удалении зародышей нежелательных микроорганизмов, в тоже время контрольная проба приобрела слизеобразную консистенцию и неприятный гнилостный запах, что свидетельствовало о бурном размножении зародышей нежелательных микроорганизмов и порче молока.

Пример 2.

Пробу такого же молока, как в Примере 1, в объеме 500 л поместили в герметически закрытый ферментер. Путем смешения аликвот по 20 г магнитоуправляемых микроносителей со стрептавидином с аликвотами по 1 г биотинилированных антител к поверхностным антигенам Escherichia coli, Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Streptococcus thermophilus, Saccharomyces cerevisiae Penicillium digitatum, получили магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы (МССК) на данные микроорганизмы. К 500 л молока в ферментере добавили 14 г смеси МССК и при температуре 20°С перемешивали в течение 30 мин с помощью мешалки. Из ферментера молоко в стерильных условиях расфасовали в полиэтиленовые пакеты. Молоко, обработанное таким способом, не изменило своих органолептических свойств при хранении в течение 2-х месяцев при 4°С.

Пример 3

Свежеприготовленное пастеризованное пиво в объеме 1 л инокулировали культурой Lactobacillus brevis с конечной концентрацией приблизительно 10⁷ клеток/мл. Путем смешения 100 мг магнитоуправляемых микроносителей со стрептавидином с 1 мг биотинилированных антител к поверхностному полипептиду httA Lactobacillus brevis получили магнитоуправляемый специфически сорбирующий комплекс (МССК) на данный микроорганизм. К 500 мл инокулированного пива добавили весь объем полученных МССК на Lactobacillus brevis и при температуре 20°С перемешивали в течение 30 мин с помощью мешалки. С помощью перистальтического насоса пиво прокачали через магнитную ловушку в стерильную емкость с герметически закрывающейся крышкой. В магнитной ловушке под воздействием магнитного поля произошло отделение всех МССК вместе с иммобилизованными на них зародышами Lactobacillus brevis от пива. В качестве контрольной пробы к 500 мл инокулированного пива добавили 100 мг магнитоуправляемых носителей со стрептавидином и далее обработали таким же образом, как и опытную пробу пива. Обе пробы поставили в термостат при температуре 37°С на 24 часа. После инкубации сравнили опытную и контрольную пробы пива. Опытная проба осталась без изменений, что свидетельствовало о полном удалении зародышей нежелательных микроорганизмов, в тоже время контрольная проба приобрела неприятный кислый запах, что свидетельствовало о бурном размножении зародышей нежелательных микроорганизмов и порче пива.

Пример 4

1 л апельсинового сока, приобретенного в продуктовом магазине, обработали с целью пастеризации при 65°С в течение 15 мин и затем инокулировали культурой Escherichia coli с конечной концентрацией приблизительно 10⁷ клеток/мл. Путем смешения 100 мг магнитоуправляемых микроносителей со стрептавидином с 1 мг биотинилированных антител к Escherichia coli получили магнитоуправляемый специфически сорбирующий комплекс (МССК) на данный микроорганизм. Далее условия эксперимента были, как в примере 3. В результате эксперимента опытная проба осталась без изменений, что свидетельствовало о полном удалении зародышей нежелательных микроорганизмов, в тоже время контрольная проба приобрела неприятный запах, что свидетельствовало о бурном размножении зародышей Escherichia coli и порче сока.

Пример 5

Культуру ткани в объеме 200 мл с культивируемыми гемопоэтическими стволовыми клетками инокулировали культурой Escherichia coli с конечной концентрацией приблизительно 10⁷ клеток/мл. Далее условия эксперимента были, как в примерах 3 и 4. В результате эксперимента в опытной пробе происходило нормальное размножение гемопоэтических стволовых клеток, что свидетельствовало о полном удалении зародышей нежелательных микроорганизмов, в тоже время контрольная проба приобрела неприятный запах, что свидетельствовало о бурном размножении зародышей Escherichia coli, а также зафиксирована полная гибель гемопоэтических стволовых клеток

Пример 6

Культуру штамма Brevibacterium flavum 194, продуцента аминокислоты аргинина засеяли в лабораторный ферментер объемом 5 л с водной средой следующего состава, %:

Сахароза2MgSO₄·7H₂O0,05(NH₄)₂SO₄1,0КН₂PO₄0,2KCl0,5FeCl₂0,002MnSO₄0,002СаСО₃1,0,

а также дестиобиотин - 500 мкг/л, тиамин - 300 мкг/л, пролин - 200 мкг/мл. Состав водной подпитки был следующий: сахароза - 60%, пролин - 100 мкг/мл. Культуральную жидкость после 30 часов ферментирования при 30°С дополнительно инокулировали суспензией клеток Escherichia coli ATCC25922, подавляющих рост Brevibacterium flavum, из расчета конечного содержания Escherichia coli 10⁷ клеток/мл. Смешали 2 г магнитоуправляемых микроносителей со стрептавидином с 20 мг биотинилированных антител к поверхностным антигенам Escherichia coli, и получили магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы (МССК) на Escherichia coli. Весь объем полученных МССК добавили в ферментер и продолжали ферментирование, периодически (через каждый час) пропуская весь объем культуральной жидкости через магнитный сепаратор. При этом все МССК с иммобилизованными на них клетками Escherichia coli удаляли из культуральной жидкости, регенерировали МССК инкубацией с 10% NaCl, отделяли от клеток Escherichia coli с помощью магнита и вновь возвращали регенерированные МССК в ферментер. На протяжении еще 48 часов не наблюдали подавления роста Brevibacterium flavum и продукции аргинина.

Источники информации

1. Патент Российской Федерации №2143814, опубл. 10.01.2000.

2. Патент Российской Федерации №2188700, опубл. 10.09.2002.

3. Патент Российской Федерации №2179061, опубл. 10.02.2002 (прототип).

Изобретение относится к области процессов стерилизации жидких сред и может найти применение в микробиологической, пищевой и медицинской промышленности. Предлагаемый способ предусматривает определение всего спектра нежелательных для данной жидкой среды микроорганизмов. Затем на магнитоуправляемые микроносители иммобилизуют специфические рецепторы, реагирующие с поверхностными структурами зародышей нежелательных микроорганизмов, получая таким образом магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы (МССК), которые смешивают с жидкой средой в пропорциональном количестве. Инкубируют указанную смесь в течение времени, достаточного для протекания реакции указанных поверхностных структур с указанными соответствующими специфическими рецепторами, и воздействием магнитного поля удаляют микроносители с иммобилизованными на них таким образом зародышами. Предлагаемый способ имеет высокую производительность и обладает направленностью процесса стерилизации. 3 з.п. ф-лы.

1. Способ стерилизации жидких сред, состоящий в удалении зародышей роста нежелательных микроорганизмов, отличающийся тем, что предварительно определяют весь спектр нежелательных для данной жидкой среды микроорганизмов, затем на магнитоуправляемые микроносители иммобилизуют специфические рецепторы, реагирующие с поверхностными структурами зародышей нежелательных микроорганизмов, получая магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы, смешивают жидкую среду с пропорциональным количеством магнитоуправляемых специфически сорбирующих комплексов, инкубируют указанную смесь в течение времени, достаточного для протекания реакции указанных поверхностных структур с указанными соответствующими специфическими рецепторами, и воздействием магнитного поля удаляют микроносители с иммобилизованными на них таким образом зародышами.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанную смесь инкубируют при постоянном или периодическом перемешивании.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что магнитоуправляемые специфически сорбирующие комплексы состоят из магнитозависимого сердечника и полимерной оболочки, к которой присоединены специфические рецепторы.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что специфическими рецепторами являются белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды животной или растительной природы, электрически заряженные молекулы, фрагменты или целые частицы микроскопических организмов (вирусов, бактерий, спор бактерий и грибов, пыльцы растений) или синтетические молекулы органической природы.