СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ТКАНЯМ ПЕЧЕНИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/49 G01N33/556 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, а именно к иммунологическим методам исследования, и может быть использовано для определения антител к тканям печени в сыворотке крови больного животного.

Известен способ приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающий получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота экстракцией в изотоническом растворе натрия хлорида при соотношении 1:9 соответственно и его осветление пятикратным замораживанием и оттаиванием с последующим центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 минут, подготовку эритроцитов с проведением процессов отмывания в изотоническом растворе натрия хлорида, суспензирования до 10% концентрации, смешивания в соотношении 1:1 с 0,2% раствором акролеина на изотоническом растворе натрия хлорида и выдержки в течение 50-60 минут при комнатной температуре, танизации и их сенсибилизацию путем смешивания с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспензированием в консерванте до концентрации 1,5-2% (И.М.Карпуть, Л.М.Пивовар, А.Г.Ульянов, И.З.Севрюк, В.М.Щеглов. Рекомендации по диагностике и профилактике аутоиммунных заболеваний у животных. - Минск: 1987. - С.6-10).

В известном способе все процессы отмывания эритроцитов проводятся изотоническим раствором натрия хлорида, что не обеспечивает постоянство рН внеклеточной и внутриклеточной жидкости. Концентрация приготовленного антигена не обеспечивает должной сенсибилизации эритроцитов. При фиксации эритроцитов используется акролеин, который ядовит, его пары сильно раздражают слизистую оболочку глаз и дыхательных путей, к тому же это дорогостоящий препарат. Концентрация готового препарата составляет 1,5-2%, что не обеспечивает необходимой чувствительности диагностикума.

Задача изобретения - разработка способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, обладающего высокой чувствительностью и специфичностью, а также исключающего использование акролеина в процессе приготовления препарата.

Технический результат от использования изобретения - упрощение технологии приготовления диагностикума и повышение его чувствительности.

Технический результат достигается тем, что в способе приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающем получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота путем экстракции ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделения центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 часов при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 часа при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50% концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1% раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в 0,25% растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола.

Пример осуществления способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени включает этапы: 1) получение антигена из ткани печени, 2) получение и подготовка эритроцитов, 3) фиксация эритроцитов, 4) танизация эритроцитов, 5) сенсибилизация эритроцитов.

На этапе приготовления водно-солевого тканевого антигена используют печень здорового крупного рогатого скота. 50-100 г ткани печени, забранной не позже 5 ч с момента наступления смерти животного, разрезают на кусочки массой 0,2-0,5 г и промывают проточной водой в течение 6 ч при соотношении ткань печени : вода, равным 1:8-1:10, с 8-10 кратной заменой раствора. Кусочки печени в течение 2 ч промывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида в том же соотношении при четырехкратной замене раствора. Объем ткани измеряют в стерильном мерном цилиндре и определяют уровнем жидкости, к одной ее части добавляют 4 части изотонического раствора натрия хлорида. Полученную однородную смесь для экстракции отстаивают при температуре 4°С в течение 18-20 часов. Ее центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В этом случае концентрация приготовленного антигена обеспечивает необходимую сенсибилизацию эритроцитов. Надосадочная жидкость - водно-солевая вытяжка ткани - является антигеном. Антиген осветляют четырехкратным замораживанием и оттаиванием с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут.

Использовали эритроциты крупного рогатого скота. Свежесобранную кровь, полученную из яремной вены, дефибринируют в колбе со стеклянными бусами в течение 20-25 мин. Кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок эритроцитов 3-5 раз отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, что обеспечивает достаточную буферную емкость раствора и способствует сохранению эритроцитов. Осадок эритроцитов после последнего центрифугирования принимают за 100%.

С целью получения стабильного гемадсорбента эритроциты подвергают обработке формальдегидом. Их суспензируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем 0,3% формальдегида, и выдерживают 4 часа при температуре 37°С. После фиксации эритроциты 3-5 раз отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида.

К одному объему отмытой 3%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов прибавляют 1 объем танина в разведении 1:20000 (танизированные эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на поверхности белки). Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 20-30 минут или в водяной бане 10-15 минут при той же температуре. После этого 2-кратно отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендируют до 50%-ной концентрации.

Сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50%-ной концентрации, пяти объемов раствора антигена и пяти объемов 0,1%-ного раствора треххлористого хрома с последующей экспозицией в течение пятнадцати минут при комнатной температуре, постоянно перемешивая.

После сенсибилизации эритроциты трехкратно отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в консерванте. В качестве консерванта используется 0,25%-ный раствор химически чистого глицерина, приготовленный на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% химически чистого фенола.

Технический результат от применения способа приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени подтвержден апробацией эритроцитарного диагностикума приготовленного предлагаемым способом. Сыворотка крови 20 коров симментальской породы с клиническими признаками гепатоза, принадлежащих опытной станции ВГАУ, исследовалась в РНГА диагностикумом, приготовленным известным способом, и параллельно диагностикумом, приготовленным предлагаемым способом. Данные исследований представлены в таблице.

№Титр антител к тканям печени№Титр антител к тканям печенип/пСогласно заявленному способуИзвестным способомп/пСогласно заявленному способуИзвестным способом11:321:32111:641:3221:641:32121:641:3231:641:32131:321:3241:321:32141:321:1651:321:16151:321:1661:321:16161:641:3271:321:32171:321:1681:321:32181:321:3291:641:32191:321:16101:321:16201:321:16

Из таблицы видно, что диагностикум, который приготовлен согласно заявленному способу, имеет повышенную чувствительность, это отразилось на выявлении более низкого уровня антител в сыворотке крови (при более высоком титре) в 70% случаев.

Таким образом, способ приготовления эритроцитарного диагностикума по указанной выше схеме позволяет эффективно выявлять титр антител к тканям печени в сыворотке крови животного и сократить затраты на его изготовление.

Способ получения антигена из ткани печени крупного рогатого скота включает экстракцию ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделение центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, при этом экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 часов при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 часа при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50% концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1% раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3% концентрации в 0,25% растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола. 1 табл.

Способ приготовления эритроцитарного диагностикума для определения антител к тканям печени, включающий получение антигена из ткани печени крупного рогатого скота путем экстракции ткани в изотоническом растворе натрия хлорида, отделения центрифугированием надосадочной жидкости, содержащей антиген, ее осветление замораживанием и оттаиванием, подготовку эритроцитов, выделенных центрифугированием из крови крупного рогатого скота, путем отмывания осадка эритроцитов в изотоническом растворе натрия хлорида, суспендирования и выдержки эритроцитов в растворе фиксатора, танизации и сенсибилизации эритроцитов смешиванием с раствором антигена с последующим отмыванием в изотоническом растворе натрия хлорида и ресуспендированием в консерванте до концентрации готового продукта, отличающийся тем, что экстракцию ткани печени осуществляют при соотношении ткани печени и изотонического раствора натрия хлорида 1:4 в течение 18-20 ч при 4°С, осадок эритроцитов отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида, затем суспендируют до 20% концентрации в фосфатно-буферном растворе, содержащем в качестве фиксатора 0,3% формальдегида, выдерживают 4 ч при 37°С, сенсибилизацию осуществляют смешиванием одного объема танизированных эритроцитов 50%-ной концентрации с 5 объемами раствора антигена и 5 объемами 0,1%-ного раствора треххлористого хрома, отмывают в забуференном фосфатами изотоническом растворе натрия хлорида при рН 7,2 и ресуспендируют до 3%-ной концентрации в 0,25%-ном растворе глицерина, приготовленного на изотоническом растворе натрия хлорида с добавлением 0,3% фенола.