СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОБЕГОВ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА IN VITRO Российский патент 2006 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, а также и для фундаментальных исследований в области физиологии растений.

Известен способ получения побегов рапса in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде с получением проростков, приготовление эксплантов в виде цельных семядолей из полученных проростков, инкубацию приготовленных эксплантов на агаризованной питательной среде с получением побегов (Ралдугина Г.Н., Соболькова Г.Н. Факторы, влияющие на органогенез у семядольных эксплантов рапса // Физиология растений, 1995, т.42, N6, с.916-922).

Однако известно, что попытки достичь получения побегов на эксплантах семядолей льна-долгунца не имели успеха (Dedicova В., Hricova A., Samaj J., Obert В., Bobak M., Pretova A. Shoots and embryo-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyl segments // J. Plant Physiology, 2000, v.157, p.327-334).

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа - прототипом является известный способ получения побегов льна in vitro, включающий инкубацию семян в темноте на агаризованной питательной среде с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин и нафтилуксусную кислоту, с получением побегов (Каляева Н.М., Захарченко Н.С., Бурьянов Я.И. Особенности регенерации льна-долгунца (Linum usitatissimum L.) // Биотехнология, 2000, №6, с.34-40).

В этом способе для инкубации семян используют агаризованную безгормональную среду Мурасиге-Скуга (МС). (Murashige Т., Scoog P., 1962. A reserved medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiology plantarum, v.15, p.473-497). Семена инкубируют на этой среде 14 суток в темноте с получением проростков. Из полученных проростков готовят экспланты в виде сегментов гипокотилей. Для получения побегов экспланты инкубируют на свету на среде МС, дополненной регуляторами роста: 6-бензиламинопурином - 1 мг/л и нафтилуксусной кислотой 0,01-0,1 мг/л.

Однако образование побегов на сегментах гипокотиля происходит по всей поверхности экспланта, преимущественно из эпидермальных клеток. Это снижает эффективность использования известного способа при проведении генетической трансформации при помощи Agrobacterium tumefacience, так как для агробактериальной трансформации необходимо образование побегов вокруг раневой поверхности. При использовании сегментов гипокотиля для увеличения числа побегов, образующихся вокруг раневой поверхности, при проведении генетической трансформации, часть эпидермиса необходимо удалять тонкими полосками вдоль экспланта, что значительно увеличивает трудоемкость способа.

Задачей настоящего изобретения является повышение выхода побегов вокруг раневой поверхности, получаемых из эксплантов льна-долгунца, при высокой общей частоте побегообразования и высоком качестве получаемых побегов, при упрощении способа и снижении его трудоемкости.

Задача решается новым способом получения побегов льна-долгунца in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде в темноте с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин, с получением побегов, причем семена инкубируют в темноте в течение 1-3 суток, а затем продолжают инкубацию на свету - 3-7 суток на агаризованной питательной среде, содержащей, мг/л:

KNO₃900-1000NH₄NO₃800-850MgSO₄×7H₂O180-190Сахароза4500-5500Агар6950-7050

экспланты готовят в виде цельных семядолей, их дополнительно инкубируют в темноте в течение 20-70 часов на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, дополненной, мг/л:

Нафтилуксусная кислота1,9-2,1Кинетин3,9-4,12,4-дихлорфеноксиуксусная кислота0,098-0,11Агар6950-7050

с получением подготовленных эксплантов, а для получения побегов полученные подготовленные экспланты инкубируют на свету на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга при содержании, мг/л:

ZnSO₄×4H₂O9-10Н₃BO₄17-19Тиамин-HCl9,5-10,56-бензиламинопурин1-2Агар6950-7050

до получения побегов.

Заявленные пределы определяются следующим образом: ниже и выше заявленных пределов способ показывает плохие результаты. Ниже приведены примеры №1-6 реализации способа. В примерах использованы следующие варианты сред.

Среда №1а для инкубации семян, содержащая, мг/л:

KNO₃900NH₄NO₃800MgSO₄×7H₂O180Сахароза4500Агар6950ВодаОстальное

Среда №1б для инкубации семян, содержащая, мг/л:

KNO₃1000NH₄NO₃850MgSO₄×7H₂O190Сахароза5500Агар7050ВодаОстальное

Среда №2а для дополнительной подготовки эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, дополненная, мг/л:

Нафтилуксусная кислота1,9Кинетин3,92,4-дихлорфеноксиуксусная кислота0,098Агар6950

Среда №2б для дополнительной подготовки эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, дополненная, мг/л:

Нафтилуксусная кислота2,1Кинетин4,12,4-дихлорфеноксиуксусная кислота0,11Агар7050

Среда №3а для инкубации подготовленных эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, при содержании, мг/л:

ZnSO₄×4H₂O9Н₃BO₄17Тиамин-HCl9,56-бензиламинопурин1Агар6950

Среда №3б для инкубации подготовленных эксплантов, агаризованная модифицированная питательная среда МС, при содержании, мг/л:

ZnSO₄×4Н₂О10Н₃BO₄19Тиамин-HCl10,56-бензиламинопурин2Агар7050

Пример 1. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 2. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 3. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 4. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 5. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 20 часов на агаризованной питательной среде №2а, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 6. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, которые дополнительно инкубируют в темноте в течение 70 часов на агаризованной питательной среде №2б, а подготовленные экспланты затем инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов. Ниже приведены примеры №7-12, показывающие, что без дополнительной подготовки эксплантов способ показывает плохие результаты.

Пример 7. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 8. Семена льна-долгунца сорта Белоснежка инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 9. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 10. Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 11. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 1 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 3 суток на агаризованной питательной среде №1а, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3а до получения побегов.

Пример 12. Семена льна-долгунца сорта Ленок инкубируют in vitro в течение 3 суток в темноте с последующей инкубацией на свету в течение 7 суток на агаризованной питательной среде №1б, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде цельных семядолей, затем экспланты инкубируют на свету на агаризованной питательной среде №3б до получения побегов.

Пример 13 (по прототипу). Семена льна-долгунца сорта А-29 инкубируют in vitro в темноте течение 14 суток на агаризованной питательной среде МС, с получением проростков, из которых готовят экспланты в виде 4-6 мм сегментов гипокотилей, затем экспланты до получения побегов инкубируют на свету на агаризованной питательной среде МС дополненной 6-бензиламинопурином - 1 мг/л и нафтилуксусной кислотой 0,05 мг/л.

Результаты, плученные по примерам 1-13, приведены в таблице.

Таблица СортНомер примераОбщая частота побегообразования, * %Частота побегообразования вокруг раневой поверхности, ** %Пример по изобретениюБелоснежка1919126464А-29312412447272Ленок5818165757Пример без дополнительной инкубации на среде №2 для подготовки эксплантовБелоснежка7212181111А-2993131101212Ленок1199121010Пример по прототипуА-2913954* Общая частота побегообразования определяется следующим образом: отношение количества образовавшихся побегов к общему количеству эксплантов, умноженное на 100%.** Частота побегообразования вокруг раневой поверхности определяется следующим образом: отношение количества образовавшихся побегов вокруг раневой поверхности к общему количеству эксплантов, умноженное на 100%.

Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что способ согласно изобретению позволяет в 18-30 раз повысить частоту побегообразования вокруг раневой поверхности, что имеет существенное значение при использовании этого способа при проведении генетической трансформации при помощи Agrobacterium tumefacience, так как перенос генов осуществляется в клетки вокруг раневой поверхности. Снижается трудоемкость способа за счет исключения операции по специальной обработке для увеличения раневой поверхности путем удаления части эпидермиса. Способ согласно изобретению прост в использовании и высокотехнологичен.

В результате способа согласно изобретению общая частота побегообразования зависит от генотипа, однако для всех сортов при реализации способа согласно изобретению были получены высокие значения общей частоты побегообразования, получаемые побеги высокого качества, все результаты стабильны и воспроизводимы.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения побегов льна-долгунца. Проводят инкубацию семян на агаризованной питательной среде с модифицированным составом в темноте с целью получения проростков. Из полученных проростков приготовляют экспланты и инкубируют их на свету в течение 20-70 часов на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга. Далее получают побеги путем инкубации эксплантов на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга. Изобретение позволяет получить высокие значения общей частоты побегообразования, а также побеги высокого качества. 1 табл.

Способ получения побегов льна-долгунца in vitro, включающий инкубацию семян на агаризованной питательной среде в темноте с получением проростков, приготовление эксплантов из полученных проростков, инкубацию эксплантов на свету на агаризованной питательной среде, содержащей 6-бензиламинопурин с получением побегов, отличающийся тем, что семена инкубируют в темноте в течение 1-3 суток, а затем продолжают инкубацию на свету 3-7 суток на агаризованной питательной среде, содержащей, мг/л:

KNO₃945-955NH₄NO₃823-827MgSO₄×7H₂O183-187Сахароза4950-5050Агар6950-7050

экспланты готовят в виде цельных семядолей, их дополнительно инкубируют в темноте в течение 20-70 ч на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, дополненной, мг/л:

Нафтилуксусная кислота1,9-2,1Кинетин3,9-4,12,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота0,098-0,11Агар6950-7050

с получением подготовленных эксплантов, а для получения побегов полученные подготовленные экспланты инкубируют на свету на агаризованной модифицированной питательной среде Мурасиге-Скуга, при содержании, мг/л:

ZnSO₄×4H₂O9-10Н₃BO₄17-19Тиамин-HCl9,5-10,56-Бензиламинопурин1-2Агар6950-7050

до получения побегов.