ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЙ, АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/08 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностью.

Известен гепарин, обладающий антикоагулянтной активностью (Zaman S.M., Neiring P., Gandhi M.R., Gaines P.A. The pharmacokinetics and US usage of heparin in vascular intervention // Clin. Radiol. 1996. V 51. №2. P.113-116.) [1].

Однако он имеет следующие недостатки:

1) не обладает антитромбоцитарными свойствами,

2) не обладает фибринолитическим действием,

3) при передозировке высокомолекулярные фракции могут вызвать нежелательные побочные явления кровоточивости.

Известен препарат плазмина, оказывающий фибринолитическое действие (Gitabert J., Estelles A.» Grancella S., Espana F., Aznar J. Fibrinolytic system and reproductive process with special reference to fibrinolytic faiture in preeclampsia // Hum. Reprod. 1995. V.10. Suppl.2. P.121-131.) [2].

Он имеет следующие недостатки:

1) не имеет антикоагулянтных эффектов,

2) не имеет антитромботического действия,

3) не имеет фибриндеполимеризационной активности,

4) проявляет протеолитическое действие.

Известен препарат ацетилсалициловой кислоты; который обладает только антитромбоцитарным действием и слабой фибриндеполимеризационной активностью (МсКее S.A., Sane D.C., Deliargyris E.N. Aspirin resistance in cardiovascular disease: a review of prevalence mechanisms, and clinical significance // Thromb. Haemost (Schattauer). 2002. V.88. №5. P.711-715) [3].

Однако препарат имеет следующие недостатки:

1) не обнаруживает антикоагулянтной активности,

2) имеет побочные эффекты - кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Известны комплексные соединения гепарина со свертывающими белками крови - фибриногеном, тромбином. Эти вещества обладают фибриндеполимеризационной и антитромботической активностью (Kudrjashov B.A., Lyapina L.A. Non-enzymatic fibrinolysis and its role in the organism // In book: Thrombosis and thrombolysis. Editors Chazov E.I., Smirnov V.N. / Consultants Bureau (New York). 1986. P.33-65.) [4].

Однако они имеют следующие недостатки:

1) имеют слабую антикоагулянтную активность,

2) не проявляют антитромбоцитарного эффекта,

3) кратковременность действия в организме,

4) их нельзя использовать в клинике, так как при их распаде в кровотоке увеличится уровень свертывающих факторов - фибриногена, тромбина.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия средств на процессы свертывания крови.

Указанный технический результат достигается тем, что пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro рекомендуют в качестве средства с антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.

Пример 1. Синтез пентапептида Pro-Arg-Pro-Glv-Pro.

Синтез пептида осуществляли классическими методами пептидной химии с использованием природных L-аминокислот. Сначала получали трипептид Pro-Gly-Pro, а затем ступенчатым наращиванием пептидной цепи с N-конца получали пентапептид. Упаривание растворов проводили на вакуумном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol. Вещества обнаруживали в УФ-свете с помощью нингидрина, о-толидина в среде хлора. Удельное вращение определяли на поляриметре марки "А1-ЕПО". Элементный анализ (C, H, N) удовлетворительно совпал с теоретическим. Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все растворители соответствующим образом абсолютировали.

Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей: бутанол: уксусная кислота: вода (4:1:1) - (1); хлороформ: метанол: аммиак (6:4:1) - (2); ацетон: бензол: уксусная кислота (50:100:1) - (3); хлороформ: метанол (9:1) - (4); гексан: ацетон (3:2) - (5); бутанол: уксусная кислота: пиридин: вода (30:6:20:24) - (6); хлороформ: метанол (14:1) - (7).

Принятые сокращения:

Вос - трет-бутилоксикарбонил

ДМФА - диметилформамид

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид ТЭА - триэтиламин

ДЦМ - дигиклогексилмочевина

ОБТ - оксибензотриазол

OBzl - бензиловый эфир

OEt - этиловый эфир

ТГФ - тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФА - трифторацетат

ТФУ - трифторуксусная кислота

I. Boc-Pro-Gly-OEt. Вос-Pro 8,3 г (38,45 ммоль) растворяли в 50 мл CH₂Cl₂, охлаждали до +5°С, добавляли 38,45 ммоль (5,38 мл) ТЭА. Реакционную смесь охлаждали до -25÷-30°С. При этой температуре из пипетки прибавляли 38,45 ммоль (4,84 мл) изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты. Температуру реакционной смеси удерживали в интервале -18÷-20°С 20 минут. Одновременно готовили раствор 5,9 г (42,3 ммоль) избыток 1,1 HCl-H-Gly-OEt в 75 мл хлороформа, содержащего 5,92 мл ТЭА. Раствор охлаждали до -25°С и после образования смешенного ангидрида в первой колбе ее содержимое приливали сразу же к раствору эфира. Реакционную смесь выдерживали при температуре -10°С 1 час и затем при температуре +4°С 12 часов при перемешивании на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, добавляли 250 мл этилацетата, раствор этилацетата промывали 3 раза по 25 мл 0,1н. HCl, 3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход - 10,2 г (30,3 ммоль), 78,83%.

Rf - 0,5(3); 0,862 (4).

II. Boc-Pro-Gly-N₂H₃. Boc-Pro-Gly-OEt 10,2 г (30,3 ммоль) растворяли в 80 мл абсолютного метанола, добавляли 4-кратный избыток гидразин-гидрата 5,88 мл (121,2 ммоль). Перемешивали 12 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали, два раза упаривали с эфиром, остаток заливали эфиром (5 мл) и оставляли в холодильнике на ночь (для лучшей кристаллизации добавляли затравку). Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре эфиром, сушили в эксикаторе.

Выход - 6,9 г (20,79 ммоль), 68,62%

Т.пл. 98-100°С

Rf - 0,284 (3); 0,474 (4); 0,189 (5).

III. Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

К охлажденному до -20°С раствору Вос-Pro-Gly-N₂Н₃ 4,7 г (14,6 ммоль) в 40 мл ДМФА добавляли 58,4 ммоль (4-кратный избыток) раствора хлористого водорода в этилацетате и сразу же 1,73 мл (14,6 ммоль) трет-буталнитрита, реакционную смесь перемешивали 30 минут при -5°С. Реакционную смесь охлаждали до -40°С и добавляли охлажденный до -10°С раствор 8,2 мл (58,4 ммоль) ТЭА в 4 мл ДМФА; когда температура реакционной смеси повышалась до -20°С, добавляли 3,7 г (15,3 ммоль) избыток 1,05 HCl-H-Pro-OBzl в 20 мл ДМФА и 2,14 мл ТЭА. Выдерживали при 4°С 24 часа, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в 200 мл этилацетата и промывали 2 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 10% раствором KHSO₄, 3 раза по 20 мл Н₂О, 3 раза по 20 мл 5% раствором NaHCO₃, 3 раза по 20 мл Н₂О. Этилацетатный слой высушивали над MgSO₄. Упаривали, остаток заливали небольшим количеством эфира (10 мл). Оставляли в холодильнике. Для лучшей кристаллизации продукта добавляли затравку. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре небольшим количеством эфира.

Сушили в эксикаторе.

Выход - 5,358 г (11,65 ммоль), 79,92%

Rf - 0,326 (3); 0,947 (4); 0,390 (5)

Т.пл. 125-126°С

[α]_D ²²=-101,2° (с=0,85; СН₃ОН)

Элементный анализ: С 62,89(62,73); N 9,21(9,14); Н 7,52(7,24).

IV. ТФА-Н-Pro-Gly-Pro-OBzl. 5,358 г (11,65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход - 4,63 г (9,7 ммоль), 98%

Rf - 0,043 (3); 0,247 (4); 0,018 (5).

V. Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 3,09 г (9,7 ммоль) Boc-Arg(NO₂) растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА-H-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ, упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали раствор 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl,3 раза по 25 мл Н₂О, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, фильтровали и упаривали. Остаток высушивали в вакууме над P₂O₅/KOH и парафином.

Выход 4,76 г (7,9 ммоль), 85%

Rf - 0,44(1); 0,8 (6)

Т пл. 108-110°С.

VI. TFA-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. 4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂О₅/KOH и парафином. Выход количественный.

Rf - 0,16(1); 0,27 (6).

VII. Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl. Boc-Pro 1,7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2 суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Вос-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (67,8%)

Rf - 0,42 (1); 0,72 (6); 0,31 (7)

Т пл. 147-148°C.

VIII. Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 4,07 г (6,5 ммоль) растворяли в 100 мл металона, добавляли 1 мл 1 н. соляной кислоты и 0,85 г катализатора -10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм. в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола эфиром.

Выход - 3,02 г 5,8 ммоль (89%)

Rf - 0,125 (1), 0,57 (2), 0,37 (6).

IX. Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. 3,02 г (5,8 ммоль) Boc-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro суспензировали в 10 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром.

Полученный осадок растворяли в 7,5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^- - форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат.

Элюировали пептид 200 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход - 2,27 г (75%)

Rf - 0,2 (2); 0,1 (6)

Т пл. 180-185°С

[α]_D ²⁰=-105° (с=0,4; СН₃СООН).

Аминокислотный состав по отношению к аргинину: Pro 2,78 (3); Gly 1,1 (1).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Supercosil ABZ+Plus размер 4,6×250 мм; скорость потока 1 мл/мин; Элюент А: NH₄Н₂PO₄+Н₃PO₄ (50 mM. рН 2,8); элюент В: МеОН

Градиент: 0-20 мин (0-40%В); время выхода 10,13 мин.

Пример 2.

Берут 1 мг препарата формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl в дозе 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 1000 об/мин в течение 5 мин для получения богатой тромбоцитами плазмы (для анализа агрегации тромбоцитов), затем дополнительно центрифугируют кровь в течение 10 мин при 2000 об/мин и получают плазму, бедную тромбоцитами.

В результате анализа параметров гемостаза обнаруживают следующее.

В богатой тромбоцитами плазме агрегация тромбоцитов в опытных пробах составляла 93%, в то время как в контроле - 100%. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение общей фибринолитической активности в 1,6 раза, антикоагулянтной активности в 1,4 раза, фибриндеполимеризационной активности в 1,8 раз по сравнению с контролем (физиологическим раствором).

Пример 3.

Берут 1 мг препарата пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора NaCl и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения берут кровь из v.jugularis и проводят ее центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. Затем в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина вызывают образование тромба и определяют через 1 час антитромботический эффект препарата.

В бедной тромбоцитами плазме обнаруживаю г увеличение общей фибринолитической активности за счет увеличения активности активатора плазминогена в 2 раза, антикоагулянтной активности в 1,5 раза, фибриндеполимеризационной активности в 2 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Препарат селанка проявлял высокий антитромботический эффект превышающий антитромботические свойства плазмы крови здоровых крыс в 5,6 раза: если в контроле вес тромбов составлял 1,4 мг, то в опыте - лишь 0,27 мг.

Таким образом, новый пептид Pro-Arg-Pro-Gly-Pro обладает широким спектром действия на процесс свертывания крови.

В таблице представлены данные, свидетельствующие о преимуществах заявленного пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro по сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетрапептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

ТаблицаАктивностиPro-Arg-Pro-Gly-ProКомплекс фибриноген-гепарин (прототип)Pro-Gly-Pro (прототип)Gly-Pro-Gly-Gly (прототип)In vitro Антикоагулянтная145-160%140%122-140%118%Фибринолитическая (суммарная)36-56 мм²30-36 мм²36-42 мм²24 мм²Антитромбоцитарная65%-83%75%In vivo Внутривенное введ.    Антикоагулянтная активность125%135%173%100%Фибринолитическая неферментативная активность170%140%173%100%Активность тканевого активатора плазмино-гена190%103%220%100%Агрегация тромбоцитов83%-83%100%Интраназальное введение    Антитромботическая активность(по весу тромбов)19%-19%100%Фибринолитическая суммарная активность150%-150%100%Антикоагулянтная активность125%-151%-Фибриндеполимеризационая активность150%-150%-

Таким образом, из таблицы видно, что заявленный пептид Pro-Arg-Pro-Gly-Pro имеет преимущества перед препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной активности в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтная, фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активности заявленного пептида Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают те же активности эталонного комплекса фибриноген-гепарин и тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают подобное действие тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly и соответствуют эффекту Pro-Gly-Pro. Комплекс фибриноген-гепарин при интраназальном введении не активен.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антитромботического, антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного и фибринолитического средства, содержащего пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 1 табл.

Пептид формулы Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, обладающий антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.