ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИКОАГУЛЯНТНОЙ, ФИБРИНДЕПОЛИМЕРИЗАЦИОННОЙ, АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ И ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЯМИ Российский патент 2006 года по МПК A61K38/08 A61P7/02 

Изобретение относится к медицине, к средствам, обладающим антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностью.

Известен гепарин, обладающий антикоагулянтной активностью (Zaman S.М., Neiring P., Gandhi M.R., Gaines P.A. The pharmacokinetics and US usage of heparin in vascular intervention // Clin.Radiol. 1996. V.51. № 2. P.113-116).

Однако он имеет следующие недостатки:

1) не обладает антитромбоцитарными свойствами,

2) не обладает фибринолитическим действием,

3) при передозировке высокомолекулярные фракции могут вызвать нежелательные побочные явления кровоточивости.

Известен препарат плазмина, оказывающий фибринолитическое действие (Gitabert J., Estelles A., Grancella S., Espana F., Aznar J. Fibrinolytic system and reproductive process with special reference to fibrinolytic failure in preeclampsia // Hum. Reprod, 1995. V.10. Suppl.2. P.121-131).

Он имеет следующие недостатки:

1) не имеет антикоагулянтных эффектов,

2) не имеет антитромботического действия,

3) не имеет фибриндеполимеризационной активности,

4) проявляет протеолитическое действие.

Известен препарат ацетилсалициловой кислоты, который обладает антитромбоцитарным действием и слабой фибриндеполимеризационной активностью (МсКее S.A., Sane D.C., Deliargyris E.N. Aspirin resistance in cardiovascular disease: a review of prevalence mechanisms, and clinical significance // Thromb. Haemost. (Schattauer). 2002. V.88. № 5. P.711-715).

Однако препарат имеет следующие недостатки:

1) не обнаруживает антикоагулянтной активности,

2) имеет побочные эффекты - кровоточивость со стороны желудочно-кишечного тракта.

Известны комплексные соединения гепарина со свертывающими белками крови - фибриногеном, тромбином. Эти вещества обладают фибриндеполимеризационной и антитромботической активностью (Kudrjashov В.А., Lyapina L.A. Non-enzymatic fibrinolysis and its role in the organism // In book: Thrombosis and thrombolysis. Editors Chazov E.I., Smirnov V.N. / Consultants Bureau (New York). 1986. P.33-65).

Однако эти вещества имеют следующие недостатки:

1) имеют слабую антикоагулянтную активность,

2) не проявляют антитромбоцитарного эффекта,

3) кратковременность действия в организме,

4) их нельзя использовать в клинике, так как при их распаде в кровотоке увеличится уровень свертывающих факторов - фибриногена, тромбина.

Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является расширение спектра действия средств на процессы свертывания крови.

Указанный технический результат достигается тем. что пептид формулы:

Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro

рекомендуют в качестве средства с антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, фибринолитической и антитромботической активностями.

Пример 1. Синтез пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

Гептапептид синтезировали ступенчатым наращиванием пептидной цепи классическими методами пептидной химии в растворе. При синтезе применяли метод смешанных ангидридов и метод активированных эфиров. Для синтеза использовали производные L-аминокислот. Упаривание растворов проводили на роторном испарителе при 40°С. Температуры плавления, определенные на столике для плавления Boetiys, даны без исправления. Индивидуальность полученных соединений проверяли с помощью ТСХ на пластинках с силикагелем фирмы Silufol (Чехия). Вещества обнаруживали, опрыскивая пластинки раствором нингидрина и (или) о-толидина. Приведены хроматографические подвижности (Rf) в системах растворителей : ацетон : бензол : уксусная кислота (50:100:1) - (1); хлороформ : метанол (9:1) - (2); гексан: ацетон (3:2) - (3); бутанол : уксусная кислота: вода (4:1:1) - (4); бутанол: уксусная кислота : пиридин : вода (30:6:20:24) - (5); хлороформ : метанол : аммиак (6:4:1) - (6); бензол : этанол (8:2) - (7); этилацетат : ацетон : 50% уксусная кислота : вода (2:1:1) - (8); хлороформ : метанол (14:1) - (9): хлороформ : метанол : аммиак (8:1,75:0,25) - (10); хлороформ: метанол: аммиак (6,5:3,0:0,5) - (11).

Удельное вращение определяли на поляриметре "А1-ЕПО.

Элементный анализ на анализаторе "Carlo-Erba" модель 1106.

Проверку гомогенности пептида проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Все растворители абсолютировали соответствующим образом. Точки плавления не корректировали.

Принятые сокращения:

Arg - аргинин

Gly - глицин

Lys - лизин

Pro - пролин

Boc - трет-бутилоксикарбонил

Z - бензилоксикарбонильная группа (КБЗ)

OBzl - бензиловый эфир

OPfp - пентафторфениловый эфир

ДМФА - диметилформамид

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид

ДЦМ - дициклогексилмочевина

ТГФ - тетрагидрофуран

ТФУ - трифторуксусная кислота

ТФА - трифторацетат

ТЭА - триэтиламин

ЭА - этилацетат

ТСХ - тонкослойная хроматография

PivCl - пивалоил хлорид

I. Получение Boc-Pro-Gly-OH.

1. 10.75 г (50 ммоль) Вос-Pro растворяли в 150 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли 7,7 мл (50 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли 6,8 мл (55 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl) перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С. охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор Gly.

Одновременно приготавливали раствор Gly.

2. Gly 4,5 г (60 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 35 мл воды и 60 мл ацетонитрила, прибавляли 8,4 мл (60 ммоль) триэтиламина, охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали на роторном испарителе. К остатку добавляли ˜50 мл воды. Водный раствор подкисляли 3-кратным избытком NaHSO₄ (24,84 г)до рН 3, экстрагировали 5 раз по 100 мл этилацетатом. Объединенный раствор этилацетата промывали H₂О (50 мл). 10% раствором KHSO₄ (50 мл), Н₂О (50 мл), насыщенным раствором NaCl (50 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли сухой эфир. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, Р₂О₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 5,97 г (21,74 ммоль); (43,5%).

Т.пл. 70°С.

Rf - 0,863 (1); 0,903 (2); 0,746 (7); 0,847 (8).

II. Получение Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. 5.97 г (21,74 ммоль) Boc-Pro-Gly-OH растворяли в 100 мл ацетонитрила, охлаждали до -5°С, к раствору прибавляли избыток 1,1 (3,35 мл; 23,9 ммоль) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -20°С перемешивая на магнитной мешалке. К охлажденному раствору прибавляли избыток 1,1 (2,34 мл; 23,9 ммоль) пивалоил хлорида (PivCl), перемешивали на магнитной мешалке 20 минут при -10°С, охлаждали до -30°С и прибавляли предварительно охлажденный раствор HCl·Pro-OBzl.

Одновременно приготавливали раствор HCl·Pro-OBzl.

2. HCl·Pro-OBzl 6,3 г (26,1 ммоль, избыток 1,2) растворяли в 50 мл ацетонитрила. прибавляли 4,0 мл (28,71 ммоль; избыток 1,1) триэтиламина (ТЭА), охлаждали до -10°С и через 20 минут прибавляли к раствору в первой колбе. Реакционную смесь выдерживали 1 час при -10°С и 2 часа при 18-20°С, перемешивая на магнитной мешалке. Реакционную смесь упаривали. К упаренному остатку прибавляли 300 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали H₂O (3 раза по 25 мл). 10% раствором KHSO₄ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), 5% раствором NaHCO₃ (3 раза по 25 мл), Н₂О (3 раза по 25 мл), насыщенным раствором NaCl (1 раз 25 мл). Этилацетатный раствор сушили над MgSO₄. Высушенный этилацетат отфильтровывали и упаривали. К остатку добавляли ˜ 100 мл сухого эфира. При добавлении эфира в колбе выпадает продукт, который отфильтровывали, промывая его на фильтре сухим эфиром. Полученное вещество высушивали под вакуумом в эксикаторе над КОН, P₂O₅ и парафином, несколько раз меняя осушители.

Выход: 8,12 г (17,66 ммоль); (81,23%).

Т.пл. 125-126°С.

Rf - 0,326 (1); 0,947 (2); 0,390 (3): 0,620 (7).

III. Получение ТФА-Pro-Gly-Pro-OBzl.

5,358 г (11.65 ммоль) Boc-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 29,13 мл хлористого метилена, добавляли 29,13 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход - 4,63 г (9,7 ммоль) 98%,

Rf - 0,043 (1); 0,247(2); 0,018 (3),

IV. Получение Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

3.09 г Boc-Arg(NO₂)-OH 9,7 ммоль растворяли в 50 мл ТГФ и 10 мл ДМФА, добавляли 2,07 г (10,67 ммоль) ДЦГК, охлаждали до 0°С, перемешивали в течение 40 минут и добавляли раствор ТФА-Pro-Gly-Pro-OBzl в 50 мл ТГФ и 4,46 мл (9,7 ммоль) ТЭА. Перемешивали реакционную смесь в течение трех суток. Отфильтровывали осадок ДЦМ. упаривали раствор в вакууме, к остатку приливали 200 мл гексана, при этом отделялся целевой продукт в виде масла, которое растворяли в 500 мл этилацетата и промывали 3 раза по 25 мл 0,1 н. HCl. 3 раза по 25 мл Н₂O, 1 раз насыщенным раствором NaCl. Органический слой высушивали над MgSO₄, отфильтровывали и упаривали. Остаток растворяли в ЭА и высаживали сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме над Р₂О₅/КОН и парафином, меняя несколько раз осушитель.

Выход - 4,76 г (7,9 ммоль) 85%.

Т.пл. 108-110°С.

Rf - 0,44 (4); 0,8 (5).

[α]_D ²²=-77,8° (с=0,5; СН₃СООН).

V. Получение TFA·Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

4,76 г (7,9 ммоль) Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 20 мл хлористого метилена, добавляли 20 мл ТФУ. выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом. два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂O₅/КОН и парафином.

Выход количественный.

Rf - 0,16 (4); 0,27 (5).

VI. Получение Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Boc-Pro 1.7 г (7,9 ммоль) растворяли в 20 мл ТГФ, добавляли 1,07 г (7,9 ммоль) ОБТ, охлаждали до 0°С и добавляли 1,8 г ДЦГК в 50 мл ТГФ. Через 40 мин к реакционной смеси добавляли раствор TFA·Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl (7,9 ммоль) в 50 мл ТГФ и 1,1 мл (7,9 ммоль) ТЭА. Перемешивали 2 часа при 0°С и 2-е суток при комнатной температуре, затем отфильтровывали ДЦМ, упаривали в вакууме, растворяли в 500 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход 4,07 г (6,5 ммоль) 67,8%.

Тпл. 147-148°С.

Rf - 0,42 (4); 0,72 (5); 0,31 (9).

VII. Получение TFA·Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Boc-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 4,07 г (5,3 ммоль) растворяли в 14 мл хлористого метилена, добавляли 14 мл ТФУ, выдерживали 45 минут при комнатной температуре, два раза упаривали с абс. этанолом, два раза с бензолом, два раза с эфиром, растворяли в бензоле и заливали гексаном. Гексан сливали, а полученное масло сушили в эксикаторе над Р₂О₅/КОН и парафином.

Выход - 3,94 г (5,2 ммоль) 97%.

Rf - 0,246(2); 0,095 (4): 0,202(10).

VIII. Получение Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

1. К Boc-Lys(Z)-OH 3,8 г (10 ммоль) в 25 мл абс. ЭА добавляли 2,26 г ДЦГК и 1,87 г пентафторфенола в 50 мл ТГФ, охлаждали до 0°С, Реакционную смесь перемешивали 2 часа при 0°С. отфильтровывали ДЦМ, раствор упаривали в вакууме, добавляли 25 мл абс. эфира и 75 мл гексана, постепенно при охлаждении отделялся осадок, который отфильтровывали и высушивали в вакууме.

Выход - 2,8 г (87%).

Т.пл. 117-120°С.

Rf - 0,84(4): 0,91 (9).

2. К TFA·Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl 2,27 г (5,2 ммоль), растворенного в 50 мл ТГФ и охлажденного до 0°С, прибавляли при перемешивании 0,75 мл ТЭА и затем в течение 2 часов четырьмя порциями Boc-Lys(Z)-OPfp 2,8 г (5,2 ммоль). Перемешивали 24 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь упаривали в вакууме, остаток растворяли в 300 мл ЭА и обрабатывали аналогично Boc-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl.

Выход - 3 г (3 ммоль) 58%.

Т.пл. 130-132°С.

Rf - 0,38(4); 0,75(5).

[α]_D ²²=-86,2° (c=0,5 CH₃COOH).

IX. Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl.

3 г (3 ммоль) Boc-Lys(Z)-Pro-Arg(NO₂)-Pro-Gly-Pro-OBzl растворяли в 100 мл метанола, добавляли 0,5 мл 1н. соляной кислоты и 3 г катализатора - 10% окись палладия на нейтральной окиси алюминия, гидрировали в токе сухого водорода при комнатной температуре и давлении 1 атм в течение 6 часов. Затем катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре метанолом. Объединенный фильтрат упаривали досуха. Остаток высаждали из абс. метанола сухим эфиром. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме.

Выход - 2,67 г (2.67 ммоль) 89%.

X. Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro.

2,67 г (2,67 ммоль) Boc-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OBzl суспензировали в 5 мл 2 н. соляной кислоты в диоксане и выдерживали при комнатной температуре в течение 45 мин. Затем добавляли сухой эфир, выпавший осадок промывали декантацией сухим эфиром. Переосаждали из абсолютного метанола эфиром. Полученный осадок растворяли в 5 мл 30% этанола и наносили на колонку с Амберлистом А-21 (АсО^- - форма) для обмена хлористоводородной соли на ацетат. Элюировали пептид 100 мл 30% этанола, упаривали в вакууме досуха и высаждали из метанола абс. эфиром.

Выход - 1,54 г (2 ммоль) 75%.

Т.пл. - 151°С.

Rf - 0,24(6).

[α]_D ²²=-65,0° (с=0,5 СН₃COOH).

Результаты ВЭЖХ: Колонка Zorbax ODS d=4,6 мм; t=35°C, скорость потока 1 мл/мин; A=50 мМ NH₄H₂PO₄ (pH 2,5); B=A+MeOH (1:1), 10-60% В (за 25 мин). Время выхода 16,5 мин.

Пример 2.

Берут 1 мг препарата формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, растворяют в 2,5 мл физиологического раствора и вводят внутривенно в v.jugularis 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл (200 мкг) на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl в дозе 0,5 мл на 200 г массы тела. Через 10 мин берут кровь и центрифугируют ее при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы.

В результате анализа параметров гемостаза обнаруживают следующее. В бедной тромбоцитами плазме обнаружено увеличение общей фибринолитической активности - в 1,2 раза, антикоагулянтной активности - в 1,2 раза, фибриндеполимеризационной активности - в 1,3 раз по сравнению с контролем (физиологическим раствором).

Пример 3.

Берут 1 мг препарата пептида формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. растворяют в 2,5 мл физиологического раствора NaCl и вводят интраназально в течение 5 дней через каждые 24 часа 5-ти лабораторным крысам по 0,5 мл на 200 г массы тела. Контрольным животным тем же способом вводят 0,85% раствор NaCl. Через 5 дней после последнего введения берут кровь из v.jugularis и проводят ее центрифугирование при 2000 об/мин в течение 10 мин для получения плазмы, бедной тромбоцитами. Затем в изолированном зажимами участке v.jugularis (стаз) с помощью тромбина вызывают образование тромба и определяют через 1 час антитромботический эффект препарата.

В плазме обнаружено увеличение антикоагулянтной активности - в 1,3 раза, общей фибринолитической активности за счет увеличения активности активатора плазминогена - в 1,9 раза, фибриндеполимеризационной активности -130-160% в 1,5 раза по сравнению с контролем (физиологическим раствором). Препарат проявлял антитромботический эффект, превышающий антитромботические свойства плазмы крови здоровых крыс в 1,45 раза: если в контроле вес тромбов составлял 1,4 мг, то в опыте - 0,9 мг.

Таким образом, новый пептид Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro обладает широким спектром действия на процесс свертывания крови.

В таблице представлены данные, свидетельствующие о преимуществах заявленного пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro по сравнению с эталонными препаратами комплекса гепарин-фибриноген и три- и тетра-пептидами (Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly).

ТаблицаАктивностиLys-Pro-Arg-Pro-Gly-ProКомплекс фиброген-гепарин (прототип)Pro-Gly-Pro (прототип)Gly-Pro-Gly-Gly (прототип)In vitro
Антикоагулянтная 
130-160% 
140% 
122-140% 
118%Фибринолитическая (суммарная)30-36 мм²30-36 мм²36-42 мм²24 мм²Антитромбоцитарная70%-83%75%In vivo    Внутривенное введение.    Антикоагулянтная активность120%135%173%100%Фибринолитическая неферментативная активность120%140%173%100%Активность тканевого активатора плазминогена130%103%220%100%Агрегация тромбоцитов108%-83%100%Интраназальное введение    Антитромботическая активность(по весу тромбов)39%-19%100%Фибринолитическая суммарная активность190%-150%100%Антикоагулянтная активность130%-151%-Фибриндеполимеризационная активность150%-150%-

Таким образом, из таблицы видно, что заявленный пептид Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro имеет преимущества перед препаратами комплекса фибриноген-гепарин и пептидами Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly по степени увеличения антикоагулянтной, фибринолитической и антитромбоцитарной активности в условиях in vitro; при внутривенном введении антикоагулянтная, фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активности заявленного пептида превышают те же активности эталонного тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly; при интраназальном введении антитромботические эффекты пептида Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro превышают подобное действие тетрапептида Gly-Pro-Gly-Gly. Комплекс фибриноген-гепарин при интраназальном введении неактивен.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается антикоагулянтного, фибриндеполимеризационного, антитромбического и фибринолитического средства, содержащего пептид формулы Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro. Заявленное средство обладает высокой активностью и эффективностью по сравнению с известными средствами. 1 табл.

Пептид формулы: Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, обладающий антикоагулянтной, фибриндеполимеризационной, антитромботической и фибринолитической активностями.