ШТАММ БАКТЕРИЙ SHIGELLA SONNEI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРА ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ КОЛИЦИНОВ ГРУППЫ Е (Е, Е, Е, Е) У ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е₃ (Е₃, E₄, Е₅, Е₆).

Существующие в мировой науке системы типирования основаны на выявлении колицинопродукции (col-факторов) с помощью универсальных индикаторов, а затем на типизации колицинов путем тестирования с индикаторами, чувствительными или резистентными к определенным колицинам или их сочетаниям. Известны несколько систем или схем колициногенотипирования энтеробактерий (4, 5, 6). В каждой из систем существует свой набор эталонных типовых культур-продуцентов колицинов и индикаторов к ним В России в разные годы использовали схемы Фредерика, Эббота и Шеннона, ряд авторских схем. За рубежом используется схема В.Горака.

Схема Фредерика (5) включает 17 типовых тест-культур, имеющих буквенное обозначение продуцируемых колицинов - группа Е (E₁, E₂, Е₃), I, В, D, K и т.д. Коллекция тест-культур имеется в ГИСК им. Тарасовича. Однако авторской коллекции индикаторов к этому набору ГИСК не имеет. Не зарегистрирована такая коллекция индикаторов в Каталоге штаммов Чехословацкой национальной коллекции типовых культур, имеющей международный статус (9). Набор индикаторов, позволявший идентифицировать ограниченное число типов колицинов, использовался рядом авторов (1-3). Коллекция под названием индикаторов Н.В.Давыдовой, имевшаяся в распоряжении лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ, позволяла диагностировать колицины группы Е (E₁, E₂), I, В, K, D, V и отдельные их сочетания.

В коллекции не было индикаторов для выявления колицина Е₃.

В схеме Эббота и Шеннона (4) колицины имеют условное цифровое обозначение (1а, 1в, 2, 3 и т.д. до 15). ГИСК им. Тарасовича располагает коллекцией типовых тест-культур 17 наименований и 15 индикаторов. Схема достаточно громоздка, типы колицинов обозначены условно цифрами, они до недавнего времени не были соотнесены с общепринятым буквенным обозначением типов колицинов. Система контроля индикаторов не была разработана.

Разработанная новая система типирования колицинов В.Горака методически хорошо обеспечена (6, 7, 8). Состав коллекции типов и индикаторов содержится в Чехословацком каталоге культур (9). Коллекция типов тест-культур, основанная первоначально на наборе Эббота и Шеннона, включает 67 наименований от 1а до 67 типов. Определены соответствующие схеме Фредерика буквенные аналоги колицинов. Число индикаторов включает свыше 60 наименований, что позволяет определять множество различных комбинаций колицинов у поликолициногенных штаммов, в том числе колицины Е₄, E₅, Е₆. Схема может быть использована только в специализированных исследовательских лабораториях, обеспечивающих поддержание многочисленной коллекции в рабочем состоянии.

Хабаровский НИИЭМ с 1971 г. ведет слежение за циркуляцией возбудителей дизентерии Зонне на территории Дальнего Востока, используя колициновый маркер шигелл. Для получения сопоставимых результатов пользуется единой методикой, усовершенствуя и дополняя ее, с применением ограниченного числа индикаторов. В основе методики - схема Фредерика. Для типизации колицинов используют группы индикаторов различного механизма действия.

1. Индикаторы, чувствительные к отдельным колицинам или их сочетаниям. Удобны для выявления множественных колицинов. Индикатор работает на определенный колицин в любом сочетании.

2. Индикаторы, резистентные к отдельным колицинам или их сочетаниям (отсутствие рецепторов фиксации у индикатора для соответствующего колицина - внешнее исключение действия колицина на индикатор). Непригодны без дополнительных индикаторов для типирования множественных колицинов: мутанты, резистентные к одному колицину, подавляются другими колицинами.

3. Индикаторы, иммунные к действию определенного колицина вследствие носительства одноименной col-плазмиды (внутреннее исключение действия одноименного колицина типируемого штамма на индикатор, обеспеченное иммунитетом индикатора). Наиболее специфичны.

Типирующие способности индикаторов (спектр) определяют по их взаимодействию с набором тест-культур продуцентов колицинов.

Идентификация колицинов группы Е (Е₃, E₄, E₅, Е₆) затруднена вследствие отсутствия в отечественных коллекциях индикаторов различного механизма действия. Нет четких представлений и о классификации этой группы колицинов. В дальнейшем эта группа колицинов обозначена символом Е₃.

Цель изобретения - получение штамма, обладающего чувствительностью к колицинам гр. Е₃ (ч. Е₃), что позволяет выполнять колициногенотипирование энтеробактерий - их дифференцировку по типам продуцируемых колицинов.

Цель достигается тем, что путем генетикоселекционных приемов разработан штамм Shigella sonnei, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆) - мутант типового штамма Sh.sonnei P₉ Фредерика, используемый в качестве чувствительного индикатора для типирования колицинов группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆) у энтеробактерий.

Штамм Sh.sonnei, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, E₄, E₅, Е₆), хранится в коллекции индикаторных культур для типирования колицинов в лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24.

Культурально-морфологические признаки.

г - неподвижные палочки, спор и капсул не образуют. На МПА - рост S и переходных форм колоний сероватого цвета, умеренно выпуклых, без запаха. На среде Эндо - бесцветные, S и переходная форма.

На МПБ - равномерная муть. Пленок не образует. Оптимум роста +37° в течение 18-24 часов.

Биохимические признаки.

а) характеристики, позволяющие отнести штамм микроорганизма, чувствительного к колицину Е₃ (ч. Е₃), к семейству Enterobacteriacea, роду Shigella.

нитратный бульон+метил, рот+оксидаза-Фогес-Проскауэра-мочевина-индол-цитрат Симмонса-ацетат натрия-малонат натрия-подвижность-фенил-аланин-  сероводород-  

б) отношение к углеводам, аминокислотам:

глюкоза+дульцит-лактоза-сорбит-маннит+инозит-сахароза-лизин-рамноза-орнитин+ксилоза-аргинин-мальтоза-  

Штамм хранится в столбике 0,6% полужидкого агара под слоем вазелинового масла при комнатной t° в течение 1 года без пересева или на МПА (чашки Петри или пробирки) в холодильнике с пересевом 1 раз в 15 дней.

Индикаторные свойства штамма ч.Е₃ установлены при испытании его с набором стандартных тест-штаммов продуцентов колицинов из коллекции Фредерика и Горака (таблицы 1, 2).

В основе методики -

а) выявление колициногенной активности штаммов-продуцентов с помощью универсального индикатора Е.coli K₁₂;

б) типирование колицинов - т.е. выявление среди колициногенных штаммов продукции колицинов гр. Е₃ с помощью специфических штаммов - индикаторов.

Эти два этапа выполняются одновременно.

Определение колициногенной активности и колициногенотипирование проводят двуслойным методом отсроченного антагонизма Фредерика (5).

Односуточные тест-штаммы продуценты колицинов засевают уколом петли в слой 1,5% МПА (агар-агар+бульон Хоттингера, либо коммерческий питательный агар+мясо-пептонный бульон), разлитого в чашки Петри. На одну чашку одновременно засевают 8-9 испытуемых культур. Каждый штамм засевают параллельно на несколько чашек, соответственно числу используемых индикаторов, при этом колицины, продуцируемые штаммами, диффундируют в среду. После двухсуточной инкубации при 37° выросшие колонии стерилизуют парами хлороформа в течение 2-х часов. Для этого хлороформ (0,5 мл) наносят на квадраты фильтровальной бумаги, размещенные в крышках чашек Петри, затем чашки с засеянной средой закрывают для экспозиции. При этом крышки с хлороформом располагаются снизу, а чашки со средой накрывают их сверху. Через 2 часа пары хлороформа удаляют, оставляя чашки открытыми в течение 30 мин. Фильтровальную бумагу также удаляют, а поверхность агара засевают культурой индикатора. Одну чашку - универсальным индикатором Е.coli K₁₂, вторую - индикатором, чувствительным к колицинам гр. Е₃, третью - индикатором, чувствительным к колицину E₁ (для контроля).

Для этого 0,1 мл суточной или 6-часовой бульонной культуры индикаторного штамма вносят в пробирку с 3-4 мл расплавленного и охлажденного до 45 полужидкого 0,6% агара и после перемешивания содержимое пробирки выливают (наслаивают) на поверхность первого агарового слоя. Через 18-20 часов инкубирования посевов в термостате проводят учет результатов опыта. Определяют наличие или отсутствие зон подавления роста индикаторных культур под действием колицинов, величину зон и их характер, получая дополнительную информацию о сходстве или различиях типов колицинов.

Наличие зон подавления роста универсального индикатора Е.coli K₁₂ означает, что тест-штаммы действительно продуцируют колицины и можно приступить к оценке действия типирующих индикаторов.

При испытании индикаторного штамма с набором культур-продуцентов колицинов Фредерика (табл.3) установлено, что индикаторный штамм действительно выявляет только колицин Е₃ типового штамма Са 38 Фредерика (знак «плюс» в схеме). Индикатор остается инертным к воздействию колицинов, продуцируемых остальными тест-штаммами этой коллекции.

Взятый для контроля индикатор, чувствительный к колицину Е₁, выявляет только колицин Е₁ (синоним S₅) и не выявляет колицин Е₃.

Как следует из таблицы 4, все тест-культуры Горака, кроме типа 7, продуцируют колицины, выявляемые универсальным индикаторным штаммом Е.coli K₁₂. Испытуемый индикаторный штамм ч. Е₃ выявляет все колицины группы Е₃ (E₄, Е₅, Е₆) как одиночные, так и в сочетаниях с другими колицинами (без дифференциации на подтипы). Чувствительный индикатор действует строго специфично, выявляя только колицины группы Е₃ и оставаясь инертным ко всем другим колицинам.

Таким образом, сравнение предлагаемого штамма Sh.sonnei ч. Е₃ с известными индикаторами (ч. E₁) показывает, что штамм Sh.sonnei ч.Е₃ чувствителен только к колицинам Е₃ (Е₃, E₄, Е₅, Е₆) типовых штаммов коллекции Фредерика и Горака и позволяет выявлять единичные колицины группы Е₃ или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. При этом не дифференцирует их на типы Е₃, E₄, Е₅, Е₆.

Пример конкретного использования индикаторного штамма ч. Е₃.

Для индикации колицинов Е₃ у энтеробактерий - одиночных или в сочетании с другими колицинами, индикаторный штамм ч. Е₃ используют как самостоятельно, так и в комплексе с другими индикаторными штаммами.

Испытуемые штаммы энтеробактерий (Sh. sonnei №1 и №2) засевают уколом в среду для накопления колицина [метод отсроченного антагонизма Фредерика (5)]. Наличие колициногенной активности устанавливается с помощью универсального индикатора Е.coli K₁₂. Для установления типа колицинов применили два типирующих индикатора - чувствительный к колицинам группы Е₃ (предмет изобретения) и чувствительный к колицину E₁.

Как следует из таблицы 5, оба штамма продуцируют колицины (знак + на универсальном индикаторе Е.coli K₁₂).

Штамм Sh.sonnei №1 продуцирует колицины Е₃, так как специфический чувствительный индикатор реагирует на «свой» колицин зоной задержки роста (знак + в таблице). Индикатор ч. E₁ остается инертным. У штамма Sh.sonnei №2, напротив, колицин гр. Е₃ не выявлен, т.к. индикатор ч. Е₃ остается инертным; выявлен колицин Е₁.

ЛИТЕРАТУРА

1. Давыдова Н.В. Селекция индикаторных штаммов для типирования колицино генных культур E.coli. Сообщение I. Получение резистентных к определенным колицинам и их сочетаниям мутантов для типирования колициногенных культур E.coli. // Журн. микробиол. - 1965. - №7. - с.12-16.

2. Давыдова Н.В., Кудлай Д.Г., Петровская В.Г. Селекция индикаторных штаммов для типирования колициногенных культур E.coli. Сообщение II. Использование колициногенных рекомбинантов для дифференциации колицинов с групповой специфичностью. // Журн. микробиол. - 1965. - №8. - с.96-99.

3. Давыдова Н.В., Кудлай Д.Г. Селекция индикаторных штаммов для типирования колициногенных культур E.coli. Сообщение III. Использование моно- и дичувствительных культур для типирования штаммов с множественной колициногенностью. // Журн. микробиол. - 1966. - № 7. - с.91-93.

4. Abbott J.A., Shannon R. A method for typining Sh.sonnei using colicin production as a marker // J. Clin. Path. - 1958. - n.11. - p.71-77.

5. Fredericq P. Colicins. // Ann. Rev. Microbiol. - 1957. n.11. - p.7-22.

6. Horak V. Typing of Shigella Sonnei Colicins by means of specific Indicators // Zbl. Bakt. Hyg. - 1975. - Abt. 1. Orig. - A 233 - p.58-63.

7. Horak V. Colicin typing of Shigella Sonnei by means of specific indicator strains. An enlarged scheme // Zbl. Bakterial., Parasitenk., Infectionskrankn und Hyg. - 1980, Abt. 1 Orig. - A246. - n.2. - p.191-196.

8. Horak V. Fifty four Shigella Sonnei colicin types and their typing by specific indicator strains. // Folia microbiol. - 1985. - n.30. - p.76-79.

9. Catalogue of Pathogenic Microorganisms. The Czechoslovak National Collection of Type Cultures. Fifth Edition. Prague, 1990. - 125 p.

Таблица 1
Перечень индикаторных штаммов и тест-культур продуцентов колицинов, использованных в работеИндикаторыНаименованиеСпектр чувствительности1. Универсальный индикаторный штамма) Ко всем колицинам ФредерикаЕ.coli K₁₂б) Ко всем колицинам ГоракаПолучен из ГИСКа в 1970 г.(кроме т.7)2. Sh.sonnei P₉, чувствительный ка) Колицины схемы Фредерика.колицинам группы Е₃ (Е₃, Е₄, E₅, Е₆).Е₃ (штамм Е.coli Са 38)Предмет изобретения.б) Колицины схемы Горака Е₄ (т.т.3,9) Е₅ (т.т.32, 33) Е₆ (т.т.9а, 12, 14, 18, 24, 28, 30, 36)3. Е.Coli,а) Колицины схемы Фредерикачувствительный к колицину E₁E₁, Ia (штамм Е.coli Са 62)ПрототипS₅ (штамм Р₁₄) б) Колицины схемы Горака E₁ (т.т.6, 11, 13, 18, 20, 24, 25, 27, 30, 31, 34,35, 37)Продуценты колицинов1. Набор тест-культур продуцентов15 типовколицинов Фредерика.А, В, С...Получен из ГИСКа в 1970 г. 2. Набор тест-культур продуцентов38 типовколицинов В.Горака.от 1a до 37 типаПолучен от д-ра Идиной М.С., Ленинградский НИИЭМ им. Пастера, 1987 г. 

Таблица 2
Перечень колициногенотипов-продуцентов колицинов группы Е₃ из схем Фредерика и ГоракаКолицины группы Е₃Продуценты колициновКолицины, продуцируемые тест-штаммамиСхема ФредерикаЕ₃Е.coli Ca 38Е₃IвСхема ГоракаЕ₄3
9XIaE₄
E₄IaЕ₅32
33E₅Ia
E₅JsЕ₆9а
12
14
18
24
28
30
36Е₆Ia
Е₆
Е₆Iв
Е₁Е₆Х
E₁Е₆Ia
Е₂E₆
E₁Е₆
KE₆

Таблица 3
Характеристика спектра чувствительности универсального индикатора Е.coli K₁₂ и штамма, чувствительного к колицинам гр. Е (Е₃) по отношению к колицинам тест-штаммов ФредерикаНаименование тест-штаммовТип продуцируемого колицинаИндикаторы ^хУниверсальный Е.coli К₁₂Заявляемый чувств. Е₃Прототип чувств. E₁1. E.coli Ca 18В+--2. E.coli K-235K+--3. E.coli Ca 46D+--4. Е.coli Са 57С+--5. E.coli Ca 38Е₃+I++-6. E.coli Ca 53I+--7. E.coli Ca 42F+--8. Paracoli Ca 62F+I+-+9. E.coli Ca 7V+--10. E.coli Ca-23D+--11. Sh.dispar P₁₅S₄+ слабо--12. Sh.dispar P₁₄S₅+-+13. E.freundii Ca 31А+--14. Sh boydii P₁S_I+--15. Sh. sonnei P₉E₂+I+--^X + наличие зоны торможения роста индикаторного штамма (чувствительность к действию колицина);
- отсутствие зоны (устойчивость к действию колицина).

Таблица 4
Характеристика индикаторных способностей универсального индикатора Е.coli K₁₂ и штамма Sh.sonnei, чувствительного к колицинам гр.Е₃ по отношению к продуцентам колицинов коллекции Горака (E₄, E₅, Е₆)КолициныИндикаторыКолицино-генотип по ГоракуПродуцируемый колицин по ФредерикуE.coli K₁₂Заявляемый чувств. Е₃Прототип чувств. E₁1аК+--1вKIa+--2Ia+--3XIaE₄++ сл.-3аD+--4Ib+--5KIb+--6E₁+-+7Js---8E₂+--9E₄Ia++-9аЕ₆Ia++-10KIaE₂+--11E₁+-+12Е₆++-13E₁Ia+-+14Е₆Ib++-16Bm+--17BmIb+--18E₁E₆X+++19E₂Ia+--20E₁Ib+-+21E₂Ib+--22E₂mB+--23E₂IaBm+--24E₁E₆Ia+++25E₁Bm+-+27E₁E₂+-+28Е₂Е₆++-29BmIa+--30E₁E₆+++31E₁E₂Ia+-+32E₅Ia++-33E₅Js(7)++-34E₁D+-+35KE₁+-+36KE₆++-37mE₁+-+

Таблица 5
Применение индикаторного штамма ч. Е₃ для типирования колицинов у «диких» штаммов шигеллИспытуемые «дикие» штаммы шигеллИндикаторы для выявления колициновТип колицинаE.coli K₁₂ч. E₁ч. Е₃Sh.sonnei № 1+-+Е₃Sh.sonnei № 2++-E₁

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к поиску индикаторного штамма для идентификации колицинов группы Е₃ (Е₃, Е₄, E₅, Е₆). Получен штамм, обладающий чувствительностью к колицинам группы Е₃ (r.Е₃), пригодный для колициногенотипирования энтеробактерий - их дифференцировки по типам продуцируемых колицинов. Штамм Shigella sonnei получен путем генетико-селекционных приемов, чувствительный к колицинам группы Е₃ (Е₃, Е₄, Е₅, Е₆) - мутант типового штамма Sh.sonnei P₉ Фредерика. Штамм депонирован в коллекции Хабаровского НИИЭМ под №24. Использование штамма Sh.sonnei №24 позволяет выявлять единичные колицины группы Е₃ или их комбинации с другими колицинами у энтеробактерий. 5 табл.

Штамм бактерий Shigella sonnei, депонированный в коллекции лаборатории кишечных инфекций Хабаровского НИИЭМ под №24, используемый в качестве индикатора для типирования колицинов группы Е₃ (Е₃, Е₄, Е₅, Е₆) у энтеробактерий.