Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI ВКПМ NB-4065 для идентификации R-фактора Советский патент 1988 года по МПК C12N15/00 

й

со со

Изобретение относится к области микробиологии. Целью изобретения является создание штамма для эпидемиологического надзора за R-плазмидами у энтеробактерий. Цель достигается с помощью трансформации штамма плазми- дои pKMR 334, выделенной из клинического штамма Shigella sonnei. Использование штамма позволяет расширить имеющийся арсенал тест-плазмид для определения групп несовместимости R-фак- тора, у энтеробактерий.

IND

со

Изобретение относится к микробио- логии и может быть исцользовано в лях наблюдения за распространенностью R-плазмид группы 1 пс Z у патогенных энтеробактерий, явившихся возбудителями вспышек и спорадических случаев острых кишечных заболеваний, а также для изучения биологии и совершенство - вания классификации вновь выявляем1 1х Ю R-факторов.

Целью изобретения является созда -. ние штамма для эпидемиологического надзора за R-плазмидами у патогеншэ1х энтеробактерий.15

Цель изобретения достигается с мощью плазмиды рКМК 334, выделенной из штамма Shigella sonnei, полученного от больного дизентерией, и для безопасности работы введенная в стан-20 дартный лабораторный шт амм E.coli К12 С600 . Штамм E.coli К12 СбОО: Rif (рКШ.334) депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов иститута ВНИИгенетика и. может 25 быть использован для изучения групп несовместимости вновь обнаруживаемых R-факторов. Это позволит осуществлять эпидемиологический надзор за плазми- дами 1 ПС Z, изучать биологию и тику R-плазмид и совершенствовать их кла ссифик ацию.

Характеристика штамма. Морфологические признаки. Клетки E.coli К12 С 600 Rif (pKMR 334) име-з5 ют вид прямых грамотрицательнь1х Псшо- чек величиной 1,4-3,, мкм, слабо подвижны, перитрихи, спор и капсул не образуют.

Культуральные признаки. На мясо- 40 пептонном агаре Е. coli К12С600 Rif (pKMR334) дает слегка выпуклые колонии, полупрозрачные, диаметром 1-3 мм на среде Эндо - круглые неокрашенные колонии, на кровяном агаре - круг- 45 лые гладкие колонии без зоны гемолиза, на минимальном агаре с добавлением лейцина, треонина, тиамина - круглые гладкие полупрозрачные колонии размером 1-3 мм (штамм-ауксоторф по jg лейцину, треонину, тиамину). На мясо- пептонном бульоне E.coli К12 СбОО Rif (pKMR 334) образует равномерное помутнение и осадок.

Физиологические признаки. Е. coli - К12 Сбое Rif (pKMR 334) не образует оксидазу, глюкозу расщепляет с образованием кислоты и газа, не расщепляет

лакт озу, ферментирует мальтозу, ман- нит, арабинозу, маннозу, сорбит, ксилозу, не ферментирует сахарозу, дуль- цит, инозит. Дает положительную реакцию с метиловым красным, не образует ацетилметилкарбинол в анаэробных условиях, восстанавливает нитраты в нитриты, не усваивает цитрат в качестве единственного источника углерода, не обладает уреазной активностью.

Генетические особенности. Штамм E.coli К12 C6GO (pKMR 334) имеет хромосомную устойчивость к рифампици- ну (200 мкг/мл). Плазмида детерминирует устойчивость штамма к тетрациклину (100 мкг/мл), стрептомицину (200 мкг/мл) и сульфаниламидам (3000 мкг/мл).

Штамм E.coli К12 СбОО Rif (рКЖ 334) используют в. качестве донора в конъюгационном скреш:ивании. В качестве реципиента используют штамм E.coli К12 153 met pro Nal . Устойчивость к тетрациклину, стрептомицину и сульфаниламидам у трансконъ- югантов соответствует таковой у донор ного штамма. Частота переноса pKMR 334 в бесплазмидный штамм составляет 1,510 при 20-часовой конъюгации. При. -5-минутной конъюгации передачи плазмиды в бесплазмидный штамм Не происходит.

Пример 1. Плазмидную ДНК из штамма E.coli К12 СбОО Rif (pKMR 334 вьщеляют по методу Birnboim, Doly. Молекулярный, вес определяют по элект- рофоретической подвижности ДНК плазмиды pKMR 334 в 0,8%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере (рН 8,3) в сравнении с подвижностью молекул ДНК известного молекулярного веса. Молекулярный вес pKMR 334 составляет 62 Мегадальтона. Трансформацию клеток стандартного штамма E.coli К12 802 met ДНК pKMR 334 проводят по методу Cosloy, Oishi. Антибиотикорезистент- ность трансформантов соответствует таковой у исходного штам1-1а E.coli

К12 СбОО (pKMR 334V, После , трансформации свойства плазмиды не

изменяются.

Изучают основные молекулярно-биолси гические и генетические свойства плазмид;ы pKMR 334. Она не наделяет клетку-хозяина колициногенными, гемолитическими свойствами, не кодирует синтез антигенов колонизации, не способна ингибировать F-опосредаванную

314

конъюгацию (Fin), не кодирует R-M- систем, не наделяет клетку чувствительностью к донорспецифическим фагам , fl, fd, Qp, I Ke, I fl, PR4.

Для определения 1 по-групповой принадлежности штамм E.coli К12 С600 Rif (pKMR 334) используют в конъюгационных скрещиваниях с представителями различных групп несов- местимости. Оказалось, что pKMR 334 несовместима с р1Е545 (1 пс Z). Учитывая этот факт, а также то, что плазмида pKMR 334 выделена из S.son- nei и отличается этим от других из- вестных плазмид группы 1 пс Z и отличается от них молекулярным весом, можно считать плазмиду pKMR 334 ,, новым представителем группы н есовмес- тимости Z.

Пример 2. Выделяют штамм дизентерийной бактерии с типичными свойствами, устойчивыми к канамицину и хлорамфениколу. Эту устойчивость определяют конъюгативной R-плазмидой. Для эпидемиологического анализа выясняют, в каких районах циркулирует тот же самый штамм возбудителя, В качестве эпидемиологической метки выбирают присутствующую в штамме R- плазмиду. Чтобы решить поставленную эпидемиологическим анализом задачу, нужно определить 1пс-принадлежность этой плаэмиды, так как именно это свойство является важнейшей характе- ристикой плазмиды. Проверить ее совместимость с имеющейся в коллекции прототипных плазмид р1Е545 как пред23

ставителем группы Iпс Z не пред- ставляется возможным из-за того, что и р1Е545 и исследуемая плазмида устойчивы к канамицину. Невозможно создать селективные условия для отбора клонов при проверке стабильности сосуществования обеих плазмид в одном штамме. Используется штамм с плазмидой pKMR 334 как представитель группы I ПС Z в качестве реципиента в конъюгационном скрещивании, в который передается исследуемая плазмида. Отбор трансконъюгантов ведут на среде с канамицином (маркер донорной миды) и рифамицином (маркер хромосомный реципиента). После проверки фенотипа трансконъюгантов оказалось, что клетки устойчивы как к канамицину (маркер исследуемой плазмиды), так. и к тетрациклину и стрептомицину (маркер резидентной плазмиды). Стабильное их сосуществование сохраняетг ся на протяжении последующих генераций. Это позволяет сделать вьшод, что они совместимы и исследуемая плазмида не относится к группе 1 пс Z. Такой вывод, в свою очередь, позволил исключить сразу несколько районов из числа возможных источников инфекции и вовремя скорректировать дальнейшую расшифровку вспышки.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ № В-4065 для идентификации R- фактора.