ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ПРОБИОТИКА МИКРОЦИКОЛА В5/98 Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и производству пробиотиков, в частности.

В настоящее время известно более 10 типов микроцинов, изучается их структура и механизмы действия, ведутся работы по генетическому контролю синтеза микроцинов и исследуется их роль в экологии кишечных бактерий. Широкий спектр антагонистической активности этих соединений дает основание полагать о перспективности применения их продуцентов для профилактики и лечения кишечных инфекций у молодняка животных и птицы. Однако пока предложен только один пробиотик ромакол, разработанный на основе генно-инженерного штамма Escherichia coli M17(p74), продуцирующего микроцин С51 [Соколова Н.А., Хмель И.А., Шегидевич Э.А. Использование ромакола в ветеринарии. Ветеринария. 2001. №11. С.46-49]. Препарат рекомендован для профилактики колибактериоза новорожденных телят, поросят и цыплят. Его применение более чем в два раза снижает заболеваемость телят септической формой колибактериоза, и испытание ромакола в свиноводстве показало, что он уменьшает заболеваемость поросят диареей в 2-5 раз и на 11-46% снижает падеж молодняка [Каврук Л.С., Кононенко А.Б., Бритова С.В. Направленное регулирование микробиоценоза в репродукторных помещениях свиноводческих ферм и неспецифическая профилактика бактериальных кишечных инфекций поросят. В кн.: Экологические проблемы патологии, фармакологии и терапии животных. Материалы Международного координационного совещания, 19-23 мая 1997. Воронеж, 1997. С.315-316]. Следует, однако, отметить, что продуцируемый штаммом E.coli М17(р74) микроцин С51 оказывает на клетки бактерий только бактериостатическое действие, что и является его существенным недостатком. Из других недостатков следует указать на то, что гены, детерминирующие продукцию микроцина и иммунность к нему, локализованы на плазмиде, которая в принципе может быть утрачена. Поэтому поиск новых продуцентов микроцинов, оказывающих бактерицидное действие на условно-патогенные и патогенные бактерии пищеварительного тракта животных и птицы, представляется необходимым.

Целью изобретения является получение нового штамма, продуцирующего микроцин типа В и оказывающего бактерицидное действие на чувствительные клетки энтеробактерий, обладающего широким спектром антагонистической активности против потенциальных кишечных патогенов, вызывающих заболевания у сельскохозяйственных животных и человека и несущего гены продукции микроцина и иммунности к нему в составе бактериальной хромосомы.

Новый штамм Escherichia coli S 5/98 выделен с использованием традиционных микробиологических методов из фекалий взрослой свиньи. Штамм депонирован во ВКПМ под № В-8564 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки штамма представлены палочками с закругленными концами, отрицательно окрашивающимися по Граму. В мазках располагаются в виде отдельных клеток и беспорядочными скоплениями. Спор и капсул не образуют.

На среде Эндо формируются темно-красные с характерным металлическим блеском колонии.

На четвертном триптозном агаре (1/4 часть питательных ингредиентов от официальной прописи) вырастают округлые, выпуклые, с ровным краем, до 2 мм в диаметре, блестящие, полупрозрачные, серо-белые колонии.

На питательном бульоне с глюкозой помутнение и серо-белый осадок на дне пробирки.

Физиолого-биохимические признаки.

Оптимум температуры 37-39°С. Растет при 15°С и 45°С. Погибает после 30 мин экспозиции при 60°С.

Штамм толерантен к фенолу (0,6%), этанолу (2%), хорошо растет в среде с 20% желчи. Продуцирует газ из глюкозы, не образует сероводорода, дает положительную реакцию с метиловым красным и отрицательную Фогеса-Проскуера. Растет на цитратном агаре Симмонса, но не использует ацетат и малонат в качестве источника энергии; фенилаланин и мочевину не гидролизует.

Сбраживает с образованием кислоты арабинозу, лактозу, мальтозу, маннит, глюкозу, ксилозу, трегалозу, сорбит и не ферментирует сахарозу, инозит, дульцит и салицин.

Штамм чувствителен к оксациллину, левомицетину, стрептомицину, гентамицину, рифампицину, неомицину, эритромицину, тетрациклину, канамицину, ванкомицину, клиндамицину, кларитромицину, ампикацину, а также к налидиксовой кислоте и фузидину.

Штамм продуцирует микроцин В 5/98.

Микроцин В 5/98 имеет молекулярную массу менее 10 кДа. Его продукция снижается или отсутствует при культивировании продуцента на богатых питательных средах и возрастает на обедненных (минимальных) питательных средах. Он инактивируется субтилизином Е, металлопротеиназой из Вас.mesentericus, протолихетремом и проназой, но устойчив к термолизину и трипсину.

Плазмиды у штамма не обнаружены, т.е. гены, детерминирующие продукцию микроцина и иммунность к нему, локализованы на бактериальной хромосоме.

Штамм обладает широким спектром антагонистической активности и подавляет 69-99% эшерихий и 42,6-80% сальмонелл дикого типа, изолированных из кишечника скота, свиней, цыплят и кошек. Активен против колициногенных штаммов кишечной палочки. Среди сальмонелл ингибирует виды Salmonella give, S. bovis morbipicans 988, S. dublin 42, S. london 1446, S. gaminare, S. derby, S. amager 2399, S. rostock, S. readiry, S. enteritidis 41997. Проявляет антагонизм против бактерий рода Klebsiella.

Штамм не патогенен для мышей и кроликов, не оказывает токсического и аллергенного действия на организм животных.

Пример. Для приготовления пробиотика готовят питательный бульон или ГРМ-бульон, к которому добавляют 0,2% глюкозы. рН среды доводят до 6,8-7,2, разливают по пробиркам, колбам или термостойким бутылям и стерилизуют при 0,5 атм - 30 мин.

В качестве посевного материала используют суточную культуру E.coli S 5/98, которую добавляют из расчета 5-10% к объему среды. Посевы инкубируют при 38±1°С в течение 24 ч, затем микробную биомассу отделяют от культуральной жидкости (сепарирование, фильтрование или центрифугирование) и суспензируют ее в защитной среде (1/20 часть от первоначального объема), содержащей фосфаты, сахарозу и обезжиренное молоко, доводят суспензию биомассы в защитной среде до сметанообразной консистенции добавлением сухого обезжиренного обрата, тщательно перемешивают, охлаждают до +2-4°С и проводят L-высушивание в вакуумной сушилке непосредственно из жидкого состояния.

Высушенную массу измельчают, стандартизуют добавлением наполнителей (крахмал, сахароза, лактоза, сухой обрат) и фасуют в полиэтиленовые пакеты.

Полученный пробиотик обладает высокой антагонистической активностью по отношению к ряду патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (эшерихий, сальмонелл, клебсиелл), стимулирует размножение в кишечном микробиоценозе бифидо- и лактофлоры, т.е. поддерживает в пищеварительном тракте оптимальный микробный баланс и повышает неспецифическую резистентность животных.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Escherichia coli S 5/98, продуцирующий микроцин В 5/98 с широким спектром антагонистической активности против бактерий родов Escherichia, Salmonella, Klebsiella выделен из фекалий взрослой свиньи. Штамм подавляет 69-99% эшерихий и 42,6-80% сальмонелл дикого типа, активен против колициногенных штаммов кишечной палочки и 10 различных видов сальмонелл. Штамм не патоген, токсичных, токсигенных и аллергенных свойств не проявляет. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под № В-8564. Штамм используют для приготовления пробиотика микроцикола В 5/98 в жидкой и сухой форме. Использование изобретения оказывает регулирующее влияние на кишечную микрофлору и повышает неспецифическую резистентность животных.

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-8564, используемый для производства пробиотика.