АВИРУЛЕНТНЫЙ ТЕСТ-ШТАММ БАКТЕРИЙ Vibrio cholerae БИОВАРА eltor СЕРОВАРА Ogawa (ctxA-, tcpA-, toxR-, zot-), ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ, ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И УЧЕБНОМ ПРОЦЕССЕ Российский патент 2005 года по МПК C12N1/20 C12Q1/68 G01N33/53 C12N1/20 C12R1/63 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в генетических исследованиях, в частности ПЦР диагностике и генно-инженерном конструировании, в производстве диагностических тест-систем, в создании препаратов для иммунопрофилактики холеры, в процессе обучения специалистов по особо опасным инфекциям.

Известен авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae серовара 0139 (KM 115), не содержащий ctxAB генов, используемый для иммунологических и генетических исследований (патент РФ N 2149898, МПК С 12 N 1/00, 1/20 // (С 12 N 1/20, С 12 R 1:63)).

Штамм не содержит ctxAB оперона, детерминирующего выработку холерного эн-торотоксина, вызывает гемолиз эритроцитов барана и является авирулентным для кроликов-сосунков.

Однако указанный штамм не относится к холерным вибрионам 01 серовара, биовара эльтор.

Наиболее близким по своему таксономическому положению является штамм Vibrio cholerae биовара eltor серовара Огава 156, используемый в качестве эталона при изучении холерогенности (АС СССР N 1168598, МПК C 12 Q 1/20, C 12 R 1:63), который стабильно вызывает холерогенный эффект на биомодели (кролики-сосунки) и способствует повышению точности идентификации холерных вибрионов.

Отличительными признаками известного штамма Vibrio cholerae биовара eitor серовара Ogawa является высокая вирулентность и токсичность для человека и кроликов-сосунков, способность вырабатывать холерный энтеротоксин. Сведения о наличии генов патогенности отсутствуют.

Задача изобретения - тест-штамм Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa, стабильно сохраняющий авирулентные и атоксигенные свойства.

Заявляемый штамм Vibrio cholerae биовара eitor серовара Ogawa выделен из природного источника - воды открытого водоема на территории Туркменистана.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий при Российском научно-исследовательском институте «Микроб» (ГКПБ «М») под номером КМ 26.

Штамм Vibrio cholerae биовара eitor серовара Ogawa KM 26 характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки

Грамотрицательные, подвижные, слегка изогнутые палочки, с одним полярно расположенным жгутиком, спор и капсулу не образуют. На агаре Мартена и Хоттингера (рН 7,6-7,8) через 18 часов роста при 37°С формируют, круглые, полупрозрачные колонии с голубоватым оттенком, с ровным краем, в бульоне и 1% пептонной воде - равномерное помутнение, на поверхности нежная пленка.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб. Оптимальная температура роста 37°С. Оптимум рН 7,6-7,8. Продуцирует индофенолоксидазу, относится к 1 группе Хейберга, окисляет и ферментирует глюкозу до кислоты без газа, не разлагает арабинозу, дульцит, лактозу, крахмал, декарбоксилирует лизин, не обладает дигидролазой аргинина, не растет в присутствии 7-10% NaCl, лизирует эритроциты барана в пробе Грейга, агглютинирует 2,5% эритроциты морской свинки, растет на среде с 30 ед. полимиксина В, лизируется цельным классическим фагом С, не ли-зируется фагами эльтор и ХДФ - 3,4,5.

Штамм Vibrio cholerae биовар eltor серовар Ogawa KM 26 агглютинируется в развернутой реакции агглютинации с холерными диагностическими сыворотками «О» и «Огава», не агглютинируется холерными диагностическими сыворотками «Инаба» и «RO», не способен синтезировать холерный энтеротоксин и вызывать холерогенную реакцию при заражении животных микроорганизмом, выращенном в различных условиях, включая ферментатор.

Особые свойства штамма

Штамм Vibrio cholerae биовара eitor серовара Ogawa КМ 26 не содержит:

ctxA-гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного токсина (по данным ПЦР с праймерами, комплементарными нуклеотидной последовательности ctxA-гена, и гибридизации с СТ-зондом);

tcpA-гена, кодирующего синтез основной субъединицы токсинкорегулируемых пилей адгезии (по данным ПЦР с праймерами, разработанными на основе последовательности tcpA-гена);

toxR-гена, отвечающего за синтез регуляторного белка ToxR, координирующего экспрессию ctx АВ и tср-генов (по данным ПЦР с праймерами на toxR-ген),

zot-гена, кодирующего синтез токсина зонального поглощения (по данным ПЦР с праймерами на последовательность zot-rena).

Заявляемый штамм Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa KM 26 может быть использован:

1. В производстве ПЦР тест-системы для выявления ДНК возбудителя холеры (ctxA+) в качестве отрицательного контроля на этапах проверки готовой продукции.

2. Как авирулентный тест-штамм при дифференциации вирулентных штаммов Vibrio cholerae биовара eltor путем внутрикишечного заражения кроликов-сосунков.

3. В иммунологических и генетических исследованиях при разработке новых живых генно-инженерных рекомбинантных препаратов для иммунопрофилактики холеры.

4. При проведении демонстрационных занятий на курсах по подготовке и усовершенствованию специалистов по особо опасным инфекциям на базе противочумных институтов, семинаров для практических врачей на базах противочумных станций и отделов особо опасных инфекций при санэпидстанциях.

5. Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa КМ 26 может быть использован в качестве контроля выпускаемых холерных агглютинирующих сывороток «Огава».

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, отражающий использование штамма в качестве отрицательного контроля при производстве тест-систем, для подтверждения специфической активности и специфичности выпускаемых тест-систем.

Производственный штамм Vibrio cholerae биовара classica 569B и штамм для контроля Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa КМ 26 (158) хранятся в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" РосНИПЧИ «Микроб». Контрольный штамм холерных вибрионов КМ 26 обладает типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, находится в S-форме, не имеет ctxA-гена.

Для получения микробной взвеси тест-штаммов ампулу с лиофилизированной культурой холерных вибрионов вскрывают стерильно и вносят в нее 0,5 мл 0,14 М раствора NaCl (pH 7,2). После растворения в течение 1-3 мин микробную взвесь в объеме 0,1 мл засевают в 1% пептонную воду (pH 7,6), инкубируют в течение 3-6 ч при температуре 37°С. Затем производят высев с помощью биологической петли №2 на агар Хоттингера pH 7,6, инкубируют при 37°С в течение 18-20 ч.

Получение ДНК из штамма. Взвесь микробных клеток Vibrio cholerae биовара classica 569B и Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa КМ 26, выросших на агаре Хоттингера, готовят в 2 мл 0,14 М раствора NaCl (pH 7,2) по отраслевому стандартному образцу мутности 5 единиц ГИСК им. Л.А.Тарасевича (ОСО 42-28-86П), что соответствует 1,1×10⁹ м.к./мл вибрионов. Затем делают 10-кратные разведения штамма V. cholerae 569В в 5 мл 0,14 М раствора натрия хлорида (pH 7,2) до концентрации 1×10³, 1×10², 1×10 м.к./мл и Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa KM 26 до - 10⁷ м.к./мл.

Для обеззараживания к 5 мл бактериальных взвесей тест-штаммов добавляют по 0,5 мл 0,1% раствора натрия мертиалата до конечной концентрации 0,01%, прогревают при температуре 56°С в течение 40 мин. Затем по 1 мл бактериальной взвеси из всех разведений отдельными пипетками переносят в микропробирки объемом 1,5 мл и центрифугируют при 8000 g в течение 15 мин при температуре 20-25°С. Осадок ресуспендируют в 50 мкл стерильной деионизованной воды, прогревают при температуре 100°С в течение 10 мин, охлаждают в течение 2-3 мин и центрифугируют при 8000 g в течение 1 мин при температуре 20-25°С. Супернатант в количестве 10 мкл используют для проведения ПЦР. Реакцию амплификации проводят согласно инструкции, прилагаемой к тест-системе. Результаты учитывают по окраске ДНК в геле при просмотре под ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. При наличии в пробе ДНК-матриц Vibrio cholerae биовар eltor серовар Ogawa KM 26 специфичные полосы должны отсутствовать, а в присутствии ДНК-матриц Vibrio cholerae 569B должны быть видны фрагменты величиной 564 п.н. «Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции» должна выявлять в ПЦР 1000 м.к./мл Vibrio cholerae, обладающих ctxA-геном и не должна реагировать со штаммами, не содержащими ctxA-ген.

В результате использования тест-штамма Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa КМ 26 подтверждается специфическая активность и специфичность тест-системы. Аналогичным способом тест-штамм холерных вибрионов КМ 26 может быть использован в производстве мультиплексной ПЦР тест-системы (tcp, tox R, zot гены).

Пример 2. Использование тест-штамма при дифференциации вирулентных штаммов путем внутрикишечного заражения биомоделей.

Штамм Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa КМ 26 при внутрикишечном заражении кроликов-сосунков в дозах 1×10⁵, 1×10⁷ м.к./мл не вызывает их гибели, а при вскрытии биопробных животных отсутствуют изменения, характерные для холерогенного симптомокомплекса, что свидетельствует о неспособности штамма продуцировать холерный токсин. При гистологическом изучении органов и слизистой кишечника отсутствует выраженный отек подслизистой оболочки, отмечается умеренная активность АПУД-системы без количественных изменений. Количественные показатели бокаловидных клеток, межэпителиальных лимфоцитов и лимфоцитов покровного эпителия не отличаются от интактных животных. Заражение крольчат-сосунков вирулентным штаммом холерных вибрионов (569В) вызывало их гибель при внутрикишечном заражении в дозе 1×10⁵ м.к./мл с выраженным симптомокомплексом и видимьми макроскопическими изменениями внутренних органов, что подтверждает способность этого штамма вырабатывать холерный энтеротоксин.

Пример 3. Использование штамма в иммунологических и генетических исследованиях.

Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eitor серовара Огава КМ 26, не содержащий генов ctxA, tcpA, toxR, zot может быть использован в качестве основы при конструировании рекомбинантных живых препаратов для иммунопрофилактики холеры как соответствующий "Критериям оценки вакцинных штаммов холерного вибриона" (Методические указания, утвержденные Госкомсанэпиднадзором РФ, 1995 г., раздел 1.).

Пример 4. Использование штамма при проведении демонстрационных занятий на курсах по подготовке и усовершенствованию специалистов по особо опасным инфекциям.

Авирулентный штамм Vibrio cholerae биовара eltor серовара Огава КМ 26 агглютинируется холерными сыворотками "О" и "Огава", стабильно сохраняет S-форму, обладает типичными биохимическими свойствами, что очень важно для обучения специалистов.

Использование авирулентного тест-штамма Vibrio cholerae биовара eltor серовара Огава КМ 26 позволяет значительно повысить качество подготовки специалистов по особо опасным инфекциям, поскольку позволяет избежать непредвиденных ситуаций, которые могут возникать при работе с вирулентными штаммами холерных вибрионов. Аналогичного штамма для учебных целей в настоящее время нет.

Пример 5. Использование штамма в качестве контроля выпускаемых контрольных сывороток «Огава».

Стабильность антигенной структуры позволяет использовать штамм в качестве контроля в производстве сывороток холерных агглютинирующих «Огава». Длительное хранение штамма Vibrio cholerae биовара eltor серовара Огава КМ 26 в лиофилизированном состоянии при плюс 4°С не влияет на антигенную стабильность.

При проверке 80 штаммов холерных вибрионов серовара Огава с помощью производственных диагностических агглютинирующих сывороток «Огава» 34 культуры (42,5%) агглютинировались только этой сывороткой, а 46 штаммов (57,5%) агглютинирова-лись сывороткой «Огава» до титра, сывороткой «Инаба» в разведениях 1:10-1:50. Тест-штамм Vibrio cholerae биовара eitor серовара Огава KM 26 при трех повторностях с различными сериями сывороток в течение 3 лет (срок наблюдения) агглютинировался только сывороткой «Огава», что свидетельствует о стабильной антигенной структуре.

Таким образом, заявляемый штамм обладает авирулентными, атоксигенными свойствами, не содержит ctxA, tcpA, toxR, zot генов. Свойства штамма стабильны и не меняются при длительном хранении, что позволяет использовать его в производстве ПЦТ тест-систем, в том числе мультиплексных ПЦТ тест-систем, генетических, иммунологических исследованиях. Примеры наглядно отражают особенности заявляемого штамма. Использование штамма в генетических, иммунологических исследованиях позволяет повысить качество медицинских иммунобиологических препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в генетических, иммунологических исследованиях и учебном процессе. Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eitor серовара Ogawa (ctxA^-, tcpA^-, toxR^-, zot^-), выделен из природного источника - воды открытого водоема на территории Туркменистана, депонирован в ГКПБ «М» под номером КМ 26, не содержит ctxA, tcpA, toxR, zot генов и обладает стабильными авирулентными, атоксигенными свойствами при длительном хранении. Указанные свойства штамма позволяют использовать заявленное изобретение при разработке новых препаратов для иммунопрофилактики холеры, в том числе полученных с использованием генно-инженерных методов, Кроме того, изобретение может использоваться при проведении различных демонстрационных занятий.

Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA^-, tcpA^-, toxR^-, zot^-), депонированный в ГКПБ «М» под номером КМ 26, используемый в иммунологических и генетических исследованиях.