СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ УГЛЕВОДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ЛЕКТИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/04 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской и промышленной микробиологии и может быть использовано для определения лектиновых рецепторов холерных вибрионов разных биоваров и сероваров, например, в применении к биотехнологиям и медицинским исследованиям, а именно клеточной биологии особо опасных инфекций, серологической диагностики, иммунологии.

Известен способ выявления лектинов (см. Roth J. the lectins: molecular probes in cell biology and membrane reseach. - Exp. Pathol. (Iena), suppl.3, 1978. - 186 pp.), заключающийся в использовании реакции гемагглютинации в различных вариантах и модификациях, результаты которой регистрируются субъективными и объективными способами.

Однако возможности данного способа ограничены информацией о лектиновых рецепторах, участвующих только в гемагглютинации, в виду того, что некоторые лектиновые рецепторы не участвуют в гемагглютинации, а участвуют в гемолизе, поэтому в реакции гемагглютинации выявлять их не удается.

За прототип выбран способ определения углеводной специфичности лектинов (см. книгу М.Д.Луцик, Е.Н.Панасюк и др. "Лектины", Львов, 1981 г., стр.19), заключающийся в подавлении активности лектина углеводами путем смешивания 0,05 мл 0,6 молярного раствора каждого углевода и 0,05 мл раствора лектина с титром 1:4; после 15-минутной инкубации при комнатной температуре к смеси добавляют 0,05 мл 2%-ной суспензии эритроцитов, которые инкубируют и центрифугируют с последующим тестированием, при этом по отсутствию агглютинации эритроцитов определяют наличие углеводных рецепторов.

Недостатком способа является то, что углеводную специфичность лектиновых рецепторов микроорганизмов не всегда возможно выявлять в реакции гемагглютинации, так как микроорганизмы вызывают не агглютинацию, а лизис эритроцитов или других клеток.

Выявление лектиновых рецепторов микроорганизмов и гемолизинов в реакции цитолиза (гемолиза) не изучено.

Это обстоятельство снижает биотехнологические возможности прототипа в применении лектинов, а именно выявлении лектиновых рецепторов для изучения микроорганизмов серологической диагностики и иммунологии, например, холерных вибрионов.

Техническим результатом заявляемого способа является повышение вероятности выявления лектиновых рецепторов и их углеводной специфичности у холерных вибрионов разных биоваров и сероваров.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе выявления углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, включающем обнаружение лектиновых рецепторов в реакции агглютинации эритроцитов, углеводную специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов выявляют по реакции ингибиции гемолиза углеводами, для этого сухую навеску углевода смешивают с раствором эритроцитов животного с получением 1% раствора углеводов в 1% суспензии эритроцитов, инкубируют полученную взвесь в течение 30-40 минут при температуре 37°С, вносят односуточную бульонную культуру исследуемого холерного вибриона и проводят инкубацию в течение 2-х часов при температуре 37°С, а затем по реакции торможения гемолиза углеводами наблюдают положительный или отрицательный результат ее по выпадению осадка эритроцитов в форме пуговицы или ее отсутствие.

Способ осуществляется следующим образом.

В качестве ингибиторов используют 1% растворы разных сахаров, например, глюкозу, маннозу, фруктозу и т.д., последние инкубируют с эритроцитами исследуемого вида животного, например барана, кролика, по отношению к которым у определенного вида микроорганизмов (холерных вибрионов, токсинов) идет гемолиз.

В качестве модели применяют гемолиз эритроцитов барана по Грейгу холерными вибрионами и изучают наличие и специфичность лектиновых рецепторов по ингибиции гемолиза углеводами для выявления лектиновых рецепторов и их специфичности.

Для этого готовят сухую навеску углевода и смешивают ее с раствором эритроцитов таким образом, чтобы получился 1% раствор сахара в 1% суспензии эритроцитов. После этого 1 мл взвеси инкубируют 30-40 мин при температуре 37°С. Затем во взвесь добавляют 1 мл односуточной бульонной культуры исследуемых микроорганизмов, а именно холерных вибрионов, и проводят инкубацию в термостате в течение 2-х часов при температуре 37°С.

По результатам реакции гемолиза делают тестирование.

Результат положительной реакции торможения гемолиза углеводами (+) - ингибиция гемолиза по отношению к контролю (гемолизу), наблюдаем частичное или полное оседание эритроцитов. Следовательно, торможение гемолиза каким-либо углеводом (будь-то сахароза, галактоза, манноза, фруктоза и т.п.) имеет место, то делают вывод о том, что у микроорганизма или токсина в гемолизе эритроцитов принимают участие лектиновые рецепторы определенной углеводной специфичности.

Результат отрицательной реакции (-) - наличие гемолиза (лаковая кровь), как в контроле. Это показатель того, что исследуемые углеводы не подавляют гемолиз, следовательно, лектиновые рецепторы, узнающие данные углеводы отсутствуют или не участвуют в гемолитической активности.

Пример 1.

В качестве ингибитора берут галактозу и готовят ее сухую навеску. Затем готовят 1% раствор галактозы в 1% суспензии эритроцитов в объеме 1 мл. Полученную взвесь инкубируют 30-40 минут при температуре 37°С. После этого проводят тестирование на выявление лектиновых рецепторов. Для этого 1 мл суточной бульонной культуры атоксигенных холерных вибрионов смешивают с заранее приготовленной взвесью эритроцитов барана и галактозы. Проводят в термостате инкубирование при температуре 37°С в течение 2-х часов - время, необходимое для реакции гемолиза без углевода.

По истечении времени инкубации в термостате вместо гемолиза, который в данном случае должен иметь место, наблюдается его ингибиция - пуговица на дне пробирки. Делается вывод о том, что реакция положительна (+), т.к. в гемолизе эритроцитов барана у холерных вибрионов принимает участие галактозоспецифичный лектин.

Пример 2.

В качестве исследуемых эритроцитов, которые тоже лизируются холерными вибрионами, используют эритроциты кролика. Ингибитором служит также галактоза. Однако в данном случае галактоза не ингибирует гемолиз. Следовательно, галактозоспецифичные лектиновые рецепторы не участвуют в лизисе эритроцитов кролика холерных вибрионов в отличие от эритроцитов барана, реакция является отрицательной (-).

Пример 3.

Отличается от примера 1 тем, что в качестве ингибитора гемолиза эритроцитов барана у холерного вибриона берется глюкоза. Гемолиз в этом случае имеет место, так как лектиновый рецептор, узнающий глюкозу, не принимает участие в этом процессе, реакция отрицательная (-).

Из проведенных экспериментов специалистами Ростовского РНИПЧИ было обнаружено, что благодаря реакции торможения гемолиза углеводами у микроорганизмов, а именно холерных вибрионов, стало доступным выявлять новые лектиновые рецепторы углеводов в гемолизе эритроцитов. Причем информация о выявленных лектиновых рецепторах дает возможность применять ее для разработки методов диагностики препаратов при их выявлении.

Использование предложенного способа выявления углеводной специфичности лектиновых рецепторов путем ингибиции гемолиза углеводами позволяет использовать его в разработках методов диагностики различных инфекционных заболеваний, у которых гемолизины являются ведущими факторами патогенности.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и биотехнологии и может быть использовано для определения лектиновых рецепторов холерных вибрионов разных биоваров и сероваров, например, в применении к биотехнологиям и медицинским исследованиям, а именно клеточной биологии особо опасных и других инфекций, серологической диагностики иммунологии. Углеводную специфичность лектиновых рецепторов холерных вибрионов выявляют по реакции ингибиции гемолиза углеводами, для этого сухую навеску углевода смешивают с раствором эритроцитов животного с получением 1% раствора углеводов в 1% суспензии эритроцитов, инкубируют полученную взвесь в течение 30-40 минут при температуре 37°С. Вносят односуточную бульонную культуру исследуемого холерного вибриона и проводят инкубацию в течение 2-х часов при температуре 37°С. Затем по реакции торможения гемолиза углеводами наблюдают положительный или отрицательный результат ее по выпадению осадка эритроцитов в форме "пуговицы" или ее отсутствие. Изобретение обеспечивает повышение выявления углеводной специфичности лектиновых рецепторов у холерных вибрионов разных биоваров и сероваров.

Способ выявления углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, включающий обнаружение рецепторов в реакции агглютинации эритроцитов, а их специфичность определяют в ингибиции, отличающийся тем, что постановку ингибиции гемолиза углеводами осуществляют путем смешивания сухой навески углевода с растворами эритроцитов животного с получением 1%-ного раствора углеводов в 1%-ной суспензии эритроцитов, инкубируют полученную взвесь в течение 30-40 мин при температуре 37°С, вносят односуточную бульонную культуру исследуемого холерного вибриона и проводят инкубацию в течение 2 ч при температуре 37°С, а затем по реакции торможения гемолиза углеводами наблюдают положительный или отрицательный результат по выпадению осадка эритроцитов в форме «пуговицы» или ее отсутствия.