СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к методам иммунологических исследований.

Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови (см. Методические указания по тестированию естественной резистентности телят, Москва, ВАСХНИЛ, 1980 г., с.60-63) включающий внесение мясопептонного бульона в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки неразведенную исследуемую сыворотку крови, внесение во все пробирки взвеси тест-микроба, смешивание и измерение с помощью фотоэлектроколориметра Ланге оптической плотности содержимого в пробирках, инкубирование в течение 2 часов при температуре 37°С, дополнительное измерение оптической плотности и определение бактерицидной активности сыворотки крови по формуле:

где БАСК (%) - бактерицидная активность сыворотки крови; Д_о - оптическая плотность опытной пробирки; Д_к - оптическая плотность контрольной пробирки.

Также известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови (см. Методические рекомендации «Иммунологические методы исследования в ветеринарии», Краснодар, 2001 г., с.52) включающий приготовление смеси микробной культуры Е.Coli, внесение ее в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки исследуемой сыворотки крови, внесение во все пробирки 24-часовой культуры Е.Coli, смешивание и измерение оптической плотности содержимого в пробирках при длине волны, равной 460 мкм, инкубирование в течение 3 часов при температуре 37°С, дополнительное измерение оптической плотности и определение бактерицидной активности сыворотки крови по формуле:

где БАСК (%) - бактерицидная активность сыворотки крови; Д_o - оптическая плотность опытной пробирки; Д_к - оптическая плотность контрольной пробирки.

Недостатком известных технических решений является то, что недостаточная интенсивность роста микроорганизмов влияет на точность определения бактерицидной активности сыворотки крови.

Техническим решения задачи является повышение точности определения бактерицидной активности за счет повышения интенсивности роста микроорганизмов.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающем приготовление смеси микробной культуры Е.Coli, внесение ее в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки исследуемой сыворотки крови, внесение во все пробирки 24-часовой культуры Е.Coli, смешивание роста, в качестве которого использована предварительно инактивированная при температуре 56°С сыворотка крови кролика, которую получают путем нагревания крови кролика в водяной бане в течение 2 часов при температуре 38°С и центрифугируют в течение 15 минут при 2500-3500 об/мин.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в качестве стимулятора роста использована сыворотка крови кролика, которая увеличивает интенсивность роста микроорганизмов, что обеспечивает повышение точности способа.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, позволяющая решить поставленную задачу, что указывает на изобретательский уровень предложения.

Поскольку предлагаемый способ можно использовать в иммунологических методах исследования в ветеринарии, то можно утверждать о промышленной применимости предложения.

Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови осуществляется следующим образом.

Предварительно готовят микробные культуры Е.Coli путем смыва суточной агаровой культуры E.Coli, которую доводят до 2 млрд микробных тел в 1 мл стерильного физиологического раствора на фотоэлектроколориметре, по красной шкале эссенция должна быть 0,3. Затем 0,001 мл 2-миллиардной микробной взвеси вносят в 4,5 мл в мясо-пептонный бульон и оставляют в термостате на 24 часа. Для получения сыворотки крови кролика пробирки с кровью кролика помещают в водяную баню и выдерживают в течение 2 часов при температуре 38°С. После инкубации в водяной бане пробирки с кровью центрифугируют в течение 15 минут при 2500-3500 об/мин, что обеспечивает эффективную очистку полученной сыворотки крови от форменных элементов и пластин.

Для определения бактерицидной активности сыворотки крови приготовленную смесь микробной культуры E.Coli в количестве 4,5 мл вносят в опытные и контрольные пробирки. Количество опытных пробирок берется по числу исследуемых проб сывороток крови. Для получения более достоверных результатов, независимо от числа исследуемых проб, целесообразно брать 5-6 параллельных контролей. Затем добавляют в опытные пробирки по 0,5 мл исследуемой сыворотки крови, а в контрольные - для получения объема аналогичного объему в опытной пробирке, также добавляют по 0,5 мл стимулятора роста, доводя рН до 7.2, в качестве которого использована предварительно инактивированная при температуре 56°С сыворотка крови кролика. Далее во все пробирки вносят по 0,1 мл 24-часовую культуру E.Coli, смешивают содержимое в пробирках. Отбирают из каждой пробирки по 2 мл и измеряют оптическую плотность при длине волны, равной 460 мкм содержимого контрольных и опытных пробирок. Оставшуюся в пробирках смесь инкубируют в течение 3 часов при температуре 37°С и затем дополнительно измеряют оптическую плотность. В пробирках, куда добавляют исследуемую сыворотку крови, микробы подвергаются бактерицидному и бактериостатическому воздействию и оптическая плотность в зависимости от этого взаимодействия изменяется, в результате по изменению оптической плотности и определяют бактерицидную активность сыворотки крови по формуле:

где БАСК (%) - бактерицидная активность сыворотки крови; Д_о - оптическая плотность опытной пробирки; Д_к - оптическая плотность контрольной пробирки.

Пример конкретного осуществления способа определения бактерицидной активности сыворотки крови.

Эксперименты по определению бактерицидной активности сыворотки крови проводились по телятам и крысам.

1. а) При изучении бактерицидной активности сыворотки крови телят по предлагаемому способу оптическая плотность в опытных пробирках до инкубации составила 0,093, после инкубации 0,247. Оптическая плотность в контрольных пробирках до инкубации составила 0,108, после инкубации 1,060. Следовательно, бактерицидная активность сыворотки крови телят равна:

2. При изучении бактерицидной активности сыворотки крови крыс по предлагаемому способу оптическая плотность в опытных пробирках до инкубации составила 0,226, после инкубации 0,248. Оптическая плотность в контрольных пробирках до инкубации составила 0,01, после инкубации 0,329. Следовательно бактерицидная активность сыворотки крови телят равна:

Аналогичные измерения проводили с этими же животными с помощью способа-прототипа. Точность определения бактерицидной активности сыворотки крови предлагаемым способом составила 1,5%.

Изобретение относится к области ветеринарной медицины. Способ определения включает приготовление смеси микробной культуры E.Coli, внесение ее в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки исследуемой сыворотки крови, внесение во все пробирки 24-часовой культуры E.Coli, смешивание и измерение оптической плотности содержимого в пробирках при длине волны, равной 460 мкм, инкубирование в течение 3-х часов при температуре 37°С, дополнительное измерение оптической плотности и определение бактерицидной активности сыворотки крови по формуле. В способе использована предварительно инактивированная при температуре 56°С сыворотка крови кролика, которую получают путем нагревания крови кролика в водяной бане в течение 2-х часов при температуре 38°С и центрифугируют в течение 15 минут при 2500-3500 об/мин. Изобретение обеспечивает повышение точности определения бактерицидной активности сыворотки крови. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающий приготовление смеси микробной культуры E.Coli, внесение ее в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки исследуемой сыворотки крови, внесение во все пробирки 24-часовой культуры E.Coli, смешивание и измерение оптической плотности содержимого в пробирках при длине волны 460 мкм, инкубирование в течение 3 ч при температуре 37°С, дополнительное измерение оптической плотности и определение бактерицидной активности сыворотки крови по формуле

где БАСК (%)-бактерицидная активность сыворотки крови;

Д_о - оптическая плотность опытной пробирки;

Д_к - оптическая плотность контрольной пробирки,

отличающийся тем, что дополнительно вносят стимулятор роста микробной культуры E.Coli, в качестве которого используют предварительно инактивированную при температуре 56°С сыворотку крови кролика.