СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУННОЙ ПЛАЗМЫ КРОВИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к области клинической иммунологии и микробиологии.

Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающий приготовление смеси микробной культуры E.Coli, внесение ее в опытные и контрольные пробирки, добавление в опытные пробирки исследуемой сыворотки крови, внесение во все пробирки 24-часовой культуры E.Coli, смешивание и измерение оптической плотности содержимого в пробирках при длине волны, равной 460 мкм, инкубирование в течение 3-х часов при температуре 37°С, дополнительное измерение оптической плотности и определение бактерицидной активности сыворотки крови по формуле.

(Методические рекомендации «Иммунологические методы исследования в ветеринарии». Краснодар, 2001, с.52; RU 2289132, C1, G01N 33/48, 2006 г.)

Однако указанный способ не решает проблемы количественной характеристики плазмы крови для направленного клинического применения и не может быть сравним с заявленным техническим решением.

Технической задачей изобретения является количественное определение в автоматизированном режиме антимикробной активности поливалентных иммунных плазм для их направленного клинического применения.

Поставленная задача решается тем, что способ определения антимикробной активности поливалентной иммунной плазмы крови включает приготовление взвеси культур микробных клеток, выбранных из группы: S.aureus АТСС 29213, P.vulgaris АТСС 13883, P.aeruginosa АТСС 27853, внесение взвеси в опытные и контрольные лунки 96-луночного планшета, добавление в опытные лунки исследуемой плазмы, регистрацию параметров кинетики роста микроорганизмов в автоматическом режиме и проведение оценки антимикробной активности исследуемой плазмы по сравнению с антимикробной активностью мирамистина.

Кроме того, тем что регистрацию параметров кинетики роста микроорганизмов проводят в микробиологических анализаторах iEMS-Reader и Multiscan-Accent, производства фирмы «TERMO-Labsystems», Финляндия. Динамику изменений концентрации клеток в бактериальной суспензии определяли компьютерной программой «Микроб-автомат» (Л.З.Скала, 2001).

Кроме того, тем что количественно оценивают антимикробную активность поливалентной иммунной плазмы в эквиваленте мирамистина, рассчитывая указанную активность исследуемой плазмы по следующим формулам:

Staphylococcus aureus y=19,034x-15,309,

Proteus vulgaris y=3,3813x+16,87,

Pseudomonas aeruginosa y=2,8365x+31,977,

где x - эквивалент мирамистина,

y - подавление роста бактерий в % по отношению к контролю.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в качестве эквивалента антимикробного действия использован антисептик мирамистин, что позволяет количественно характеризовать антимикробную активность иммунных плазм, определены референтные значения антимикробной активности плазмы крови здоровых людей по отношению к 3 микроорганизмам (S.aureus АТСС 29213, Р.aeruginosa ATCC 27853, Р.vulgaris ATCC 13883), предложена «суммарная антимикробная активность» для характеристики специфической активности поливалентных иммунных плазм.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемая совокупность признаков, позволяющая решить поставленную задачу, что указывает на изобретательский уровень предложения.

Способ иллюстрируется на следующем примере.

Пример. Предварительно готовят тестовые микробные культуры S.aureus ATCC 29213, Р.aeruginosa ATCC 27853, P.vulgaris ATCC 13883 путем смыва единичных колоний суточных агаровых культур. Их доводят бульоном Mueller-Hinton до концентрации 10⁶ КОЕ/мл. Для определения антимикробной активности исследуемой иммунной плазмы приготовленные культуры в количестве 150 мкл вносят в опытные и контрольные ячейки планшета. Количество опытных ячеек берется по числу исследуемых плазм. Затем в опытные ячейки добавляют 50 мкл исследуемой плазмы, а в контрольные добавляют по 50 мкл бульона Mueller-Hinton. Кинетику роста бактерий регистрируют в условиях микробиологического анализатора в течение 18 часов при 37°С при автоматическом встряхивании планшета каждые 5 мин. Антимикробную активность выражают: 1) в проценте подавления роста, определяемом отношением площади под кривой в опыте по сравнению с контролем автоматически программой «Микроб-Автомат», 2) в эквиваленте мирамистина и 3) в единицах суммарной антимикробной активности.

Пример тестирования плазмы крови донора Иванова П.И. (30 лет).

Донор привит двукратно поликомпонентной вакциной «Пиопол». После окончания цикла иммунизации у него взята кровь и получена плазма. Осуществляют вышеописанную процедуру.

В результате выявлено, что антистафилококковая активность исследуемой плазмы крови донора составила 53% подавления роста культуры стафилококка. В эквиваленте мираместина:

в единицах суммарной антимикробной активности составила 12 ЕД.

Антипротейная активность составила 56% подавления роста культуры протея.

В эквиваленте мираместина:

В единицах суммарной антимикробной активности составила 14,6 ЕД.

Антисинегнойная активность составила 75% подавления роста культуры Р.aeruginosa.

В эквиваленте мираместина:

В единицах суммарной антимикробной активности составила 30,2 ЕД.

Общая суммарная антимикробная активность исследуемой плазмы донора, привитого вакциной «Пиопол», по трем возбудителям составила 56,93 ЕД, что в 19 раз выше, чем в среднем в популяции здоровых лиц (3 ЕД).

Изобретение относится к медицине, а именно к области клинической иммунологии и микробиологии, и касается способа определения антимикробной активности иммунной плазмы крови. Сущность изобретения заключается в том, что приготовливают взвеси культур микробных клеток, выбранных из группы: S.aureus АТСС 29213, P.vulgaris АТСС 13883, Р.aeruginosa АТСС 27853, вносят взвеси в опытные и контрольные лунки 96-луночного планшета, добавляют в опытные лунки исследуемой плазмы, регистрируют параметры кинетики роста микроорганизмов в автоматическом режиме и количественно оценивают антимикробную активность поливалентной иммунной плазмы в эквиваленте мирамистина. Использование способа позволяет количественно охарактеризовать антимикробную активность иммунных плазм для их направленного клинического применения. 1 з.п.ф-лы.

1. Способ определения антимикробной активности иммунной плазмы крови, включающий приготовление взвеси культур микробных клеток, выбранных из группы: S.aureus АТСС 29213, P.vulgaris АТСС 13883, P.aeruginosa АТСС 27853, внесение взвеси в опытные и контрольные лунки 96-луночного планшета, добавление в опытные лунки исследуемой плазмы, регистрацию параметров кинетики роста микроорганизмов в автоматическом режиме и проведение оценки антимикробной активности исследуемой плазмы, рассчитывая указанную активность исследуемой плазмы по следующим формулам:
Staphylococcus aureus: y=19,034x-15,309,
Proteus vulgaris: y=3,3813x+16,87,
Pseudomonas aeruginosa: y=2,8365x+31,977,
где x - эквивалент мирамистина,
y - подавление роста бактерий в % по отношению к контролю.

2. Способ по п.1, где регистрацию параметров кинетики роста микроорганизмов проводят в микробиологических анализаторах iEMS-Reader и Multiscan-Accent.