Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

to

о со о 00 Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной технике, и может быть использовано в качестве объективного теста для характеристики естественной иммунологической реактивности организма. Известен способ определения бактерицидной активности сыворотки крови, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток. Определение бактерицидной активности сыворотки осуществляют методом нефелометрии до и после инкубирования смеси 1. Однако этот способ недостаточно точен, - поскольку проведение исследования бактерицидности осуществляется не в цельной (100%) сыворотке, а в ее относительно низкой (18%) концентрации, без учета того, что рост микробов в системе «жидкая средасыворотка крови зависит от конкретных взаимоотнощений трофических и бактерицидных факторов. При слабой концентрации сыворотки вследствие преобладания трофического эффекта, возникает ситуация, когда могут нивелироваться индивидуальные различия в бактерицидной силе испытуемых сывороток. Кроме того, регистрируются только простые количественные изменения оптической плотности микробной взвеси. При этом учитывая серийность исследования, время, затраченное на настройку прибора, на манипуляции измерения оптической плотности и расчет показателей, результат может быть получен не ранее, чем через 4-5 ч. Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени иссле..чования. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения бактерицидНОИ активности сыворотки крови, включающему инкубацию разведенной сыаороткк с тест-культурой микробных клеток, инкубацию тест-культуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактериальную активность по отнопшнию количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного в цельной сыворотке. Способ осуществляется следующим образом. Для каждой испытуемой сыворотки использу рт 6 пробирок. В 1-ю пробирку наливают 1 мл цельной сыворотки, а в остальные, кроме 5-й и 6-й пробирки, по 1 мл разбавленной среды 199 стандартная среда 199 на растворе Хенкса, рН 7,2) сыворотки в нисходящих концентрациях - 50,0% 25,0-12,5%. Кратность разведения составляет соответственно 2, 4, 8 раз. В Б-ю пробирку и 6-ю пипетируют по 1 мл среды 199. Во, все пробирки вносят по 2 мк КИ тимидина - Н в объеме 0,1 мл среды 199. В 1-5 пробирки вносят по 5X10 микробных клеток суточной культуры № 209 в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В 6-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавляют. В нее приливают 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Все манипуляции производят с использованием скоростных полуавтоматических пипеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37°С. После инкубации бактерии осаждают на фильтре «Сынпор или «Миллипор и под вакуумом отмывают от невключивщейся метки 10 мл физиологического раствора и фиксируют 5 мл метанола. Фильтры помещают во флаконы для счета, заливают 20 мл сцинтилляционной жидкости и подвергают радиометрии. Рассчитывают бактерицидную активность по формуле А § X К, где А - бактерицидная активность; Б- радиоактивность микробной массы, инкубированной при концентрации сыворотки, не в 1зывающеи торможения захвата метки; С - радиоактивность микробов, инкубированных в цельной сыворотке; К -- кратность разведения сыворотки. Пример. Исследование сыворотки больного К. В 1-ю пробирку наливают 1 мл цельной сыворотки, а в остальные, кроме 5-й и 6-й пробирки, вносят по 1 мл разбавленной средой 199, сыворотки в нисходящих концентрациях - 50,0%, 25..0% и 12,5%. Кратность разведения сосга14 1яет соответственно 2, 4, 8 раз. В 5-ю и 6-ю .тробирки вносят по 2 мк КИ тимидина - Н в объеме 0,1 мл среды 99. В 1-5 пробирки вносят по 5x10 микробньх клеток суточной культуры. В. 5тарЬу1ссис а: оЧЬ 209 в объеме 0,2 мл физиологического раствора. В 6-ю пробирку, которая служит контролем спонтанного связывания метки, микробную взвесь не добавляют. В нее приливают по 0,2 fvui стерильного физиологического раствора, все манипуляции производят с использованием скоростных полуавтоматических пипеток. Затем смесь в пробирках встряхивают, перекрывают над пламенем горелки в стерильном боксе пробками и помещают на 2 ч в термостат при 37°С. После инкубации бактерии осаждают на фильтре «Сынпор ил« «Миллипор и под вакуумом отмывают от невключившейся метки 10 мл физиологического paciBopa и фиксируют в 5 мл метанола. Фильтры помещают во флаконы .для счета, заливают 20 мл сцинтилляционной жидкости и подвергают радиометрии. Пример расчета индекса бактерицидности: при исследов-ании

в жидком сцинтилляторе радиоактивность микробной массы, инкубированной в порции цельной испытуемой сыворотки, составляет 29740 расп. мин., а максимальная активность (158413 расп. мин.) зарегистрирована при инкубации микробов в смеси, содержащей 25% сыворотки (кратность разведения - 4). При этом активность безмикробной среды 199 равняется 2415 расп. мин. В таком случае индекс бактерицидности равен -Aj x4-22,S

39740 -2415 X 4 22,8

Преимущество предлагаемого способа сосТоит в следующем. Захват тимидина - Н микроорганизмами, отражающий синтез ДНК, является наиболее адекватным показателем их жизнеспособности. Для разведения сыворотки используют стандартную жидкую питательную среду 199. При такой постановке опыта радиоактивность микробной массы, измеряемая в жидком сцинтиляторе, всегда ниже в цельной сыворотке (максимум концентрации бактерицидных агентов) и возрастает по мере разведения сыворотки (снижение концентрации бактерицидных веществ). Степень угнетения цельной сывороткой включения тимидина - Н в микроорганизме является в предлагаемом способе мерой ее бактерицидности. Для ее количественной оценки используют то методическое обстоятельство, что при определенной низкой концентрации сыворотки в инкубационной среде создают наилучшие условия для жизнедеятельности микроорганизмов, что находит отражение в максимальном захвате метки. Такая индивидуальная модель инкубационной среды, лишенной бактерицидных свойств, позволяет использовать ее за точку отсчета для количественного определения степени угне тения цельной сывороткой синтеза ДНК в микроорганизмах.

Радиоактивность микробной массы, ин кубированной только в среде 199 без добавления сыворотки, никогда не достигает максимальных значений. Показатель бактерицидной активности сыворотки (индекс бактерицидности) вычисляется путем де0 ления величины максимальной радиоактивности микробной массы на минимальную в ряду концентраций сыворотки и умножается на кратность ее разведения.

Сравнительные показатели оценки бактерицидной активности б-ти испытуемых сывороток крови представлены в таблице. Исследования включения тимидина - Н в микроорганизмы и изменений оптической плотности микробной взвеси обнаружи1зают

0 подавление цельной сывороткой метаболизма и роста микроорганизмов, а также полное совпадение концентраций сыворотки не оказывающей бактерицидного действия в каждом индивидуальном случае. Расчетный

e показатель бактерицидной активности сыворотки в предлагаемом способе выше в среднем в 1,39 раза по сравнению с прототипо.м. Учитывая, что разброс по радиометрическому методу составляет 0,3% а по способу-прототипу 60%, можно сделать

0 вывод, что радиометрический способ определения бактерицидной активности сыворотки крови в 200 раз точнее.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность определения бактерицидной активности сыворотки крови

и сократить время исследования на 2 ч.

о

Гч|

ШчО

4D 0-)

00 Сч|

-00

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий инкубацию разведенной сыворотки с тест-культурой микробных клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени исследования, инкубацию тесткультуры микроорганизмов проводят одновременно с цельной сывороткой и определяют бактерицидную активность по отношению количества радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в разведенной сыворотке, к количеству радиоактивного нуклеозида, поглощенного микроорганизмами в цельной сыворотке.

ОCN1 ООиПCN1

л1-Ол

-Г С-.-

dО

LO CsJ

LO CN

ОVDо

О -ООсо

о о

CN

m

LO

о

о

in сч

1Л N

1Л

О u-l

LnCM

1Л CN

CN-