СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИРОВАНИЯ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ И ПРОСТЕЙШИХ РОДА TRICHOMONAS Российский патент 2002 года по МПК C12Q1/00 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для дифференцировки грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также простейших рода Trichomonas в процессе лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ дифференцировки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов путем окрашивания по методу Грама (генциановый фиолетовый 1-2 мин, через полоску фильтровальной бумаги, раствор Люголя 1-2 мин, обесцвечивание препарата этиловым спиртом в течение 30-60 с, промывание водой и докрашивание водным фуксином 1-2 мин). [Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Под ред. Л.Б. Борисова. М. 1979. С. 32.] Указанный способ наиболее широко применяется для сужения круга поиска предполагаемого возбудителя путем дифференцирования бактерий по различию в цвете после окрашивания (грамположительные - синие, грамотрицательные - красные). При этом необходимо отметить частую невозможность дифференцирования бактерии по цвету при непосредственном окрашивании клинического материала, поскольку в нем всегда присутствуют бактерии, находящиеся на разных стадиях роста. Эти различия определяют различия в химическом составе клеточной стенки и невозможность дифференцировки грамположительных и грамотрицательных по цвету.

Протозоологическое изучение простейших предполагает использование нативных методов и окрашенных препаратов. При этом методы окраски, используемые при микроскопии простейших, только сложные (окраска по Романовскому-Гимзе, окраска по Романовскому-Гимзе в модификации Филипсона, окраска по Лейшману и другие) [Медицинские лабораторные технологии и диагностика: справочник под ред. проф. А.И. Карпищенко С.-Пб,: Изд. "Интермедика", 1998, с. 277-78] . Использование визуализации простейших, например окраска по Романовскому-Гимзе, нередко обусловливает искажение результата, поскольку требует только свежеприготовленных реактивов, не подлежащих хранению, и соблюдения очень жестких требований к рН растворов. Кроме того, для выявления и бактерий и простейших на практике используется разные методы, что удлиняет промежуток времени до конечного результата, повышает стоимость исследований и их ресурсозатратность. В этой связи для одномоментного выявления простейших и бактерий, а также дифференцирования последних на грамположительные и грамотрицательные предложен способ, описанный ниже.

Технический результат - повышение информативности и диагностической ценности, сокращение времени исследования и стоимости за счет одномоментной дифференцировки грамположительных и грамотрицательных бактерий и простейших.

Технический результат достигается благодаря применению нового способа окраски микроскопических препаратов с использованием красителя - щелочного раствора метиленового синего Леффлера в прописи М.О. Биргера [Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. / Под ред. М.О. Биргера. -3 изд. перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - С. 22].

1. Дистиллированная вода - 100 мл
10 %-ный раствор КОН - 2 капли
Насыщенный (7%-ный) раствор метиленового синего - 30 мл
или
2. Метиленовый синий - 3 г
1%-ный раствор КОН - 1 мл
95%-ный спирт - 20 мл
Дистиллированная вода - 100 мл
Способ дифференцировки осуществляется следующим образом: исследуемый материал фиксируют ацетоном, затем наносят насыщенный щелочной раствор метиленового синего. Окрашивание препарата проводят в течение 20-25 мин в эксикаторе, при температуре 37^oС. В результате проведенных нами опытов мы убедились, что только щадящая фиксация мазка и такое продолжительное инкубирование в условиях термостата обеспечивает максимально эффективную картину его окрашивания. Грамположительные микроорганизмы при этом окрашиваются в серо-голубой цвет, а грамотрицательные - в иссиня-черный. Простейшие окрашиваются в голубой цвет, с иссиня-черными ядрами и четко видным контуром.

Несомненным преимуществом данного способа окраски является доступность и простота приготовления реактивов и процесс окраски, скорость проведения исследования и основное - возможность обнаружения в одном препарате и бактерий и простейших, что значительно ускорят лабораторную диагностику вызываемых ими заболеваний.

Пример 1. На фиксированный ацетоном мазок из смеси музейных культур стафилококка и кишечной палочки наносили краситель (щелочной раствор метиленового синего Леффлера) и окрашивали в эксикаторе в течение 20 мин при 37^oС. В результате проведенного опыта были обнаружены четко прокрашенные в иссиня-черный цвет палочки и кокки серо-голубой окраски, образующие неравномерные скопления.

Пример 2. Материалом для исследования явилось отделяемое слизистой оболочки мочеиспускательного канала больного с подозрением на трихомонадный уретрит. Отделяемое фиксировали ацетоном, окрашивали предложенным нами способом. При микроскопии мазка обнаружены четко прокрашенные в иссиня-черный цвет палочки и кокковая флора серо-голубой окраски, а также сплошь в поле зрения полиморфно-ядерные нейтрофилы и крупные, слегка вытянутые микроорганизмы с треугольным или чечевицеобразным ядром. Размеры их превосходили поперечник лейкоцитов приблизительно в 2 раза. Цитоплазма была прокрашена в серо-голубой цвет, а ядра - в иссиня-черный. По совокупности морфологических признаков указанные микроорганизмы были отнесены к трихомонадам.

Проведенные исследования свидетельствуют, что предложенный нами способ окраски микроорганизмов и простейших является эффективным удобным и экономичным методом микроскопической дифференцировки микроорганизмов, необходимой в процессе лабораторной диагностики.

Изобретение относится к области медицины, а именно, к медицинской микробиологии и может быть использовано для дифференцирования грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также простейших рода Trichomonas в процессе лабораторной диагностики вызываемых ими заболеваний. Исследуемый материал фиксируют ацетоном, затем наносят насыщенный щелочной раствор метиленового синего. Окрашивание препарата проводят в течение 20-25 минут в эксикаторе при температуре 37^oС. Щадящая фиксация мазка и продолжительное инкубирование в условиях термостата обеспечивает максимально эффективную картину его окрашивания. Грамположительные микроорганизмы при этом окрашиваются в серо-голубой цвет, а грамотрицательные - в иссиня-черный. Простейшие окрашиваются в голубой цвет с иссиня-черными ядрами и четко видным контуром. Способ обеспечивает повышение информативности и диагностической ценности, сокращение времени исследования и стоимости за счет одномоментной дифференцировки грамположительных и грамотрицательных бактерий и простейших.

Способ дифференцирования грамположительных и грамотрицательных бактерий и простейших рода Trichomonas, предусматривающий окрашивание фиксированного препарата и дифференцирование по изменению исходного цвета микроорганизма, отличающийся тем, что препарат фиксируют ацетоном, окрашивают его, используя в качестве красителя щелочной раствор метиленового синего Леффера в прописи М. О. Биргера, в эксикаторе при температуре 37^oС в течение 20-25 мин, при этом дифференцируют грамположительные бактерии при наличии серо-голубого цвета, грамотрицательные бактерии - иссиня-черного цвета и простейшие рода Trichomonas - интенсивно окрашенного в синий цвет ядра серо-голубой цвет цитоплазмы.