СПОСОБ РЕВЕРСИИ L-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ Российский патент 2006 года по МПК C12N1/20 C12R1/32 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике туберкулеза.

Известен способ ускоренной реверсии L-форм микобактерий на 7-дневных куриных эмбрионах, когда полученной L-культурой заражают куриные эмбрионы с последующим посевом на плотную питательную среду Левенштейна - Иенсена, который повторяют в течение 3-4 пассажей до получения реверсии.

Однако известный способ является трудоемким и дорогостоящим (1).

Известен способ реверсии L-форм микобактерий путем пассирования выделенных культур на плотных яичных средах Левенштейна - Иенсена или Фин-2 (3-5 и более пассажей, длительность одного пассажа 1-1,5 месяца). Недостатком этого способа является длительность получения ревертантов (2).

Задачей изобретения является повышение чувствительности способа и сокращение сроков получения культур-ревертантов, которая достигается путем посева выделенных из биоматериала L-форм микобактерий на плотную питательную среду Фаст-3Л, которая дополнительно содержит нативную сыворотку крупного рогатого скота или лошади. Питательная среда Фаст-3Л обладает высокими ростовыми качествами за счет присутствия в ней предельного углеводорода с длиной цепи С₁₄-С₁₇. Она активно влияет на обменные процессы в микроорганизмах, являясь для них источником энергии и пластического материала. Обогащение среды нативной сывороткой крупного рогатого скота или лошади способствует созданию благоприятных условий для культивирования L-форм. Благодаря своим буферным свойствам сыворотка нейтрализует действие некоторых ингибиторов роста L-форм, содержащихся в питательных средах, стимулирует потребление питательных веществ, ускоряет скорость деления клеток.

Пример 1.

Было испытано влияние различных доз нативной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади на скорость получения культур ревертантов. Для этого выделенные из патологического материала культуры L-форм пересевали на плотную питательную среду Фаст-3Л, в которую непосредственно перед посевом добавляли нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади по 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 мл на пробирку в стерильных условиях. Затем производили пересев культур L-форм с полужидкой среды на плотную. Посевы инкубировали в термостате при t 37°С в течение 3-4 недель, просматривая ежедневно при появлении роста туберкулезных или атипичных микобактерий, готовили мазок, окрашивали по Циль-Нильсену и просматривали в световом микроскопе.

При исследовании 97 различных биоматериалов выделено 54 L-формы микобактерий, из которых получено 23 культуры-ревертанта. 1 культура отнесена к M.bovis, 3 культуры отнесены к 3-й группе по классификации Раньона и 19 к быстрорастущим. Из таблицы видно, что при добавлении 0.05 мл сыворотки к среде роста культур ревертантов бычьего вида не наблюдалось, атипичные культуры 3-4 групп в малом количестве (8-17%) появились через 14-28 дней. На средах с добавлением 0.1 и 0.2 мл сыворотки рост культур бычьего вида отмечали на 21-28 сутки, а атипичные в основном росли на 7-14 сутки (21-43%).

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1.
Результаты пассирования L-форм микобактерий на питательной среде Фаст-3Л с добавлением различных доз сывороткиИсследуемый материалКол-во исследуемых пробКол-во выделенных L-формСодержание сыворотки крови в млСроки появления культур ревертантов (кол-во культур)nревертантов7 дней14 дней21 дней28 дней1. Лимфоузлы от крупного рогатого скота с туберкулезными поражениями 
 
31 
 
6 
 
20,05
0,1
0,2
0,5-
-
-
--
-
-
--
1
1
1-
1
1
12. Лимфоузлы от крупного рогатого скота без туберкулезных поражений 
 
52 
 
42 
 
170,05
0,1
0,2
0,5-
4
4
31
8
6
62
2
4
23
3
3
63.Биоматериал от морских свинок зараженных атипичными микобактериями 
 
14 
 
6 
 
40,05
0,1
0,2
0,5-
2
1
21
2
3
21
-
-
-1
-
-
-Итого9754230,05
0,1
0,2
0,5-
6
5
52
10
9
83
3
5
34
4
4
7

При добавлении сыворотки в дозе 0.5 мл были получены аналогичные результаты.

Пример 2.

Опыт проводили, как описано в примере 1. Для испытания были взяты питательные среды Левенштейна - Иенсена, Фаст-3Л без нативной сыворотки и Фаст-3Л с нативной сывороткой крови крупного рогатого скота или лошади.

Результаты испытания питательной среды Фаст-3Л с добавлением 0.1-0.2 мл нативной сыворотки крови крупного рогатого скота или лошади для реверсии различных L-форм микобактерий представлены в таблице 2.

Таблица 2
Скорость и интенсивность роста L-форм микобактерий на стандартной и испытуемой питательных средахИсследуемый материалПитательные средыЛевенштейна -ИенсенаФаст-3ЛФаст-3Л + сыворотка кровиСкорость (дни)Интенсивность (баллы)Скорость (дни)Интенсивность (баллы)Скорость (дни)Интенсивность (баллы)L-формы M.bovis32-45130-381-225-352-3L-формы атипичных микобактерий17-242-310-166-156-153-4

Сравнительный анализ полученных данных показал, что использование среды Фаст-3Л с добавлением нативной сыворотки крупного рогатого скота или лошади в дозе 0.1-0.2 мл на 5 мл среды позволяет сократить сроки реверсии на 7-10 дней.

Таким образом, предложенный способ реверсии L-форм микобактерий более чувствительный и сокращает срок получения культур-ревертантов на 7-10 дней.

Совокупность отличительных признаков соответствует критерию «новизна» и «изобретательский уровень».

Литература

1. B.C. Федосеев, И.Н. Рубцова, Н.Т. Кириленко: Выделение L-форм микобактерий туберкулеза от животных. Метод. рекомендации, 1989.

2. И.Р. Дорожкова, З.Н. Кочемасова, М.М. Дыхно: Выделение L-форм микобактерий туберкулеза из патологического материала. Метод. рекомендации. М., МЗ СССР, 1984.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ реверсии L-форм микобактерий предусматривает пересев L-форм микобактерий на плотную питательную среду Фаст-3Л, которая дополнительно содержит фактор роста - нативную сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС) или лошади в дозе 0,1-0,2 мл на 5 мл среды. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа и сократить сроки получения культур-ревертантов. 2 табл.

Способ реверсии L-форм микобактерий путем пересева их на плотную питательную среду, отличающийся тем, что в качестве плотной питательной среды используют питательную среду Фаст-3Л, которая дополнительно содержит фактор роста - нативную сыворотку крови крупного рогатого скота или лошади в дозе 0,1-0,2 мл на 5 мл среды.