ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА И СЕЛЕКТИВНАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Trichomonas vaginalis Российский патент 2010 года по МПК C12N1/10 C12R1/90 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для культуральной диагностики трихомоноза.

В настоящее время известны различные питательные среды для культивирования трихомонад и селективные добавки к ним.

В частности, известна (RU 2272834, 27.03.2006) питательная двухфазная среда для выделения трихомонад, содержащая:

- коагулированную сыворотку в количестве 5 мл,

- питательную среду 199 в количестве 5 мл,

- раствор натриевой соли бензил-пенициллина 10000-30000 Ед/мл в количестве 1 мл,

- раствор стрептомицина 10000-30000 Ед/мл в количестве 1 мл.

Известна селективная добавка для выращивания и культивирования трихомонад (каталожный номер FD099), содержащая

стрептомицин в количестве 500,00 мг,

бензил-пенициллин в количестве 125000 ME.

Известна среда Trichosel broth (производитель Becton Dickinson, США) для выращивания и культивирования трихомонад (номер по каталогу 211747), содержащая бычий экстракт, дрожжевой экстракт, панкреатический казеин, L-цистеин, мальтозу, агар, хлорамфеникол, метиленовый синий.

Указанные селективные добавки для выращивания и культивирования трихомонад и среды, содержащие селективные добавки, позволяют либо подавить только сопутствующую бактериальную микрофлору, либо являются дорогостоящими и многим лабораториям не доступными и также не позволяют подавлять грибковую сопутствующую микрофлору.

Кроме того, из анализа уровня техники известна (Урогенитальный трихомониаз. Актуальные вопросы диагностики и лечения, Пособие для врачей, 2001) питательная среда, содержащая в 1 л дистиллированной воды:

Белковый порошок 12,5 г,

Хлорид калия 0,1 г,

Хлорид кальция 0,1 г,

Двууглекислый натрий 0,1 г,

Аскорбиновая кислота 0,6 г,

Лимонная кислота 0,12 г,

Оротоновая кислота 0,075 г,

Лактат кальция 1,0 г,

Мальтоза 10,0 г,

Лошадиная сыворотка 220 мл.

Среда содержит в качестве антибиотиков: пенициллин в количестве 1000 мкг/мл, стрептомицин, в количестве 1000 мкг/мл, амфоглюкамицин в количестве 40 ед/мл. Данная питательная среда выбрана в качестве ближайшего аналога изобретения.

К недостаткам указанной среды может быть отнесен недостаточно высокий и недостаточно быстрый рост биомассы Trichomonas vaginalis.

Задача заявленного изобретения заключается в создании новой селективной добавки и среды, содержащей добавку, позволяющую ликвидировать вышеуказанные недостатки известных сред и селективных добавок.

Технический результат заключается в повышении скорости роста биомассы Trichomonas vaginalis (число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигало 5×10⁴ особей в 1 мл среды) и снижении концентрации антибиотика, проявляющего противогрибковую активность.

Указанный технический результат достигается в результате использования в питательной среде для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis селективной добавки, содержащей:

пенициллин G в концентрации 900-1100 ед/мл,

стрептомицин, в концентрации 1030-1260 ед/мл,

амфотерицин-В в концентрации 4,5-5,5 ед/мл.

Питательная среда для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis содержит на 100 мл среды:

Пептон 1,44-1,76 г,

Дрожжевой экстракт 1,26-1,54 г,

L-цистеин 0,9-1,1 г,

Мальтоза 0,72-0,88 г,

NaCl 0,54-0,66 г,

KCl 0,009-0,011 г,

сыворотка крови лошади 18,0-22,0,

пенициллин G в концентрации 900-1100 ед/мл,

стрептомицин в концентрации 1030-1260 ед/мл,

амфотерицин-В в концентрации 4,5-5,5 ед/мл,

вода - остальное.

Селективные питательные среды могут быть получены сразу в жидкой форме, а также сухой и лиофильно высушенной форме с последующим разведением их водой перед использованием. Получение селективных питательных сред в лиофильной форме проводили путем смешивания всех входящих в их состав компонентов, в том числе и воды, с последующей лиофилизацией биологических объектов в замороженном состоянии под вакуумом. Оптимальными условиями лиофильного высушивания питательной среды и селективной добавки к питательной среде для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis, позволяющими сохранять их биологические и физико-химические свойства, являются: длительность сушки в течение 8 часов, давление 50 Pa и температура замораживания конденсатора 40°С.

Получение селективных питательных сред в порошковидной форме осуществляли смешиванием входящих в их состав компонентов без воды. В целях обеспечения стерильности разрабатываемых диагностикумов, полученных в порошковидной форме, применялась электронно-лучевая стерилизация. Высоконадежная стерильность среды была обеспечена при дозе излучения 25 кГр. В качестве источника ионизирующего излучения были выбраны ускоренные электроны, так как при их воздействии наблюдалась максимальная антимикробная эффективность.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

Пример 1. Способ получения селективной питательной среды.

В мерный химический стакан объемом 100 мл вносили сухую питательную среду, содержавшую:

Пептон 1,6 г,

Дрожжевой экстракт 1,4 г,

L-цистеин 1,0 г,

Мальтоза 0,8 г,

NaCl 0,6 г,

KCl 0,01 г,

сыворотка крови лошади - 20,0.

Добавляли дистиллированную воду объемом 70 мл. Тщательно перемешивали на магнитной мешалке компоненты селективной среды до полного их растворения при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем вносили селективную добавку, содержавшую:

пенициллин G в концентрации 1000 ед/мл,

стрептомицин в концентрации 1145 ед/мл,

амфотерицин-B в концентрации 5 ед/мл,

и тщательно перемешивали в течение 15 минут при комнатной температуре. Измеряли рН среды и доводили значение рН питательной среды до значения 6,0±0,2 (рН Trichomonas vaginalis) путем капельного добавления, по 0,1 молярного NaOH. Объем 0,1 NaOH, потраченного на доведение рН-среды, равнялся 10 мл.

После приготовления жидкой питательной среды ее автоклавировали, после чего она была готова к посеву культур Т. vaginalis.

Для посевов на селективную питательную среду для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis применялись культуры Trichomonas vaginalis в объеме 0,1 мл, содержавшие 10⁵ микроорганизмов.

Пример 2. Способ культивирования Trichomonas vaginalis.

На питательную селективную среду, полученную в примере 1, осуществляли посев лабораторного штамма Trichomonas vaginalis. Сравнительную оценку диагностической эффективности селективной питательной среды для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis проводили путем подсчета количества выросших на среде простейших с использованием камеры Горяева через 18, 20, 24, 48, 72, 96, 120 часов после посева культур на среду. Число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигало 5×10⁴ особей в 1 мл среды, в то время как при проведении опыта согласно прототипу установлено, что число трихомонад в культуре достигало 5×10⁴ особей в 1 мл среды, только через 24 часа инкубации.

Методика подсчета живых микроорганизмов состояла в следующем: пробирки с культурами Trichomonas vaginalis осторожно встряхивали для обеспечения полного перемешивания осадка, содержавшего трихомонады, с надосадочной культуральной средой с целью равномерного распределения трихомонад во всем объеме среды. Со дна пробирки со средой, содержавшей Trichomonas vaginalis, стерильной пастеровской пипеткой брался материал (1 капля), которым заполнялась камера Горяева и производился подсчет трихомонад в 5-и расположенных по диагонали больших квадратах, каждый из которых разделен на 16 маленьких квадратов.

Количество трихомонад вычислялся по формуле:

X - количество микроорганизмов в 1 мм³ культуры;

а - количество микроорганизмов в 5-и больших квадратах;

б - число маленьких квадратов в 5-и сосчитанных больших квадратах;

4000 - маленькие квадраты, объем которых всегда равен 1/4000 мм³.

Для того чтобы получить число трихомонад в одном миллилитре среды, число Х умножалось на 1000, так как 1 мл³ равен 1000 мм³.

Одним из важных критериев оценки диагностической эффективности селективной среды для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis являлась оценка морфологических свойств культур Trichomonas vaginalis и их подвижности. Типичные трихомонады имели округлую или овальную форму, ундулирующую мембрану и 5 жгутиков; при этом 4 жгутика расположены в передней части трихомонады и 1 - по краю ундулирующей мембраны. Особи с типичной формой активно передвигались, совершая волнообразные движения ундулирующей мембраной и пропеллероподобные движения жгутиками.

Пример 3. Способ выращивания Trichomonas vaginalis.

Опыт проводили аналогично примеру 2, изменяли только концентрацию компонентов селективной добавки, при этом концентрация компонентов варьировала в следующих пределах:

пенициллин G в концентрации 900-1100 ед/мл,

стрептомицин в концентрации 1030-1260 ед/мл,

амфотерицин-B в концентрации 4,5-5,5 ед/мл.

Исследования показали результаты, аналогичные результатам, приведенным в примере 2.

Пример 4.

На указанную в примере 1 питательную среду с селективной добавкой производили посев лабораторных штаммов следующих микроорганизмов: S. epidermidis, E.coli, С.albicans, Trichomonas vaginalis. Через 24 часа производили оценку наличия роста штаммов микроорганизмов. Анализ показал, что в результате эксперимента был полностью подавлен рост сопутствующей микрофлоры (S. epidermidis, E.coli, С.albicans), при обильном росте лабораторного штамма Trichomonas vaginalis.

Как видно из представленных примеров, изобретение позволяет повысить скорость роста биомассы Trichomonas vaginalis (число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигало 5×10⁴ особей в 1 мл среды) при полном подавлении посторонней микрофлоры и снизить концентрацию антибиотика, проявляющего противогрибковую активность.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при диагностике трихомонадной инфекции. Питательная среда с селективной добавкой содержит пептон, дрожжевой экстракт, L-цистеин, мальтозу, NaCl, KCl, сыворотку крови лошади, пенициллин G, стрептомицин, амфотерицин-В, воду. Изобретение позволяет повысить скорость роста биомассы Trichomonas vaginalis (число простейших в культуре уже через 20 часов инкубации достигает 5×10⁴ особей в 1 мл среды) при полном подавлении посторонней микрофлоры и снизить концентрацию антибиотика, проявляющего противогрибковую активность. 2 н.п. ф-лы.

1. Селективная добавка к питательной среде для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis, включающая антибиотик, отличающаяся тем, что в качестве антибиотика содержит: пенициллин G в концентрации 900-1100 ед./мл, стрептомицин в концентрации 1030-1260 ед./мл и амфотерицин-В в концентрации 4,5-5,5 ед./мл.

2. Питательная среда для выделения и культивирования Trichomonas vaginalis, содержащая на 100 мл среды:
Пептон 1,44-1,76 г Дрожжевой экстракт 1,26-1,54 г L-цистеин 0,9-1,1 г Мальтоза 0,72-0,88 г NaCl 0,54-0,66 г KCl 0,009-0,011 г сыворотка крови лошади 18,0-22,0 мл пенициллин G в концентрации 900-1100 ед./мл стрептомицин в концентрации 1030-1260 ед./мл амфотерицин-В в концентрации 4,5-5,5 ед./мл вода остальное