СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ И КОМПЛЕКСА КИСЛОТОСТАБИЛЬНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ Российский патент 2007 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения лимонной кислоты ферментацией среды на основе гидролизата крахмала грибом Aspergillus niger и выделением ее из ферментированного раствора.

Известный традиционный способ получения кристаллической лимонной кислоты на основе мелассы и сахара включает много стадий: отделение мицелия фильтрованием культуральной жидкости, термообработка при температуре 80-100°С ферментированного раствора, осаждение целевого продукта в виде цитрата кальция, разложение соли серной кислотой, фильтрацию гипсовой суспензии через активированный уголь, кристаллизацию (Технологическая инструкция по производству пищевой лимонной кислоты. Л.: ЛИИПП, 1981, 130 с.).

Использование экологически вредных реагентов значительно усложняет процесс и требует дополнительной очистки растворов лимонной кислоты, регенерации сорбента, увеличения энерго- и материальных затрат. Кроме того, в способе невозможно получение кислотостабильных ферментов.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения лимонной кислоты из культуральной жидкости, имеющей активность α-амилазы и глюкоамилазы, включающий отделение мицелия гриба-кислотообразователя Aspergillus niger от ферментированного раствора, очистку ферментированного раствора с температурой ≤32° посредством фильтрации через мембрану с диаметром 0,65 мкм и разделение очищенного ферментированного раствора через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на раствор лимонной кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов (патент России №2233882, 10.08.2004, Бюл. №22).

Таким образом, известным способом получают из культуральной жидкости раствор лимонной кислоты с массовой концентрацией 120-125 г/дм³, недостаточно очищенный от активных ферментов, и раствор комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов. В результате раствор лимонной кислоты характеризуется определенной цветностью (оптическая плотность D при λ_max 400 нм 0,04-0,29), обусловленной, в частности, присутствием низкомолекулярных аминосахаров культуральной жидкости, являющихся субстратом для развития микрофлоры, что сокращает сроки хранения раствора. Кроме того, используемые в способе для очистки полученной культуральной жидкости ни суспензия бентонита, ни углеволокнистый материал типа Карбопон-актив, ни мембрана с диаметром пор 0,65 мкм не позволяют полностью удалить клетки продуцента гриба Aspergillus niger из ферментированного раствора, поэтому после разделения ультрафильтрацией раствор кислотостабильных амилолитических ферментов содержит клетки гриба Aspergillus niger в количестве 20-30 КОЕ/см³, что не соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1293 для ферментных препаратов.

Таким образом, получение кристаллической лимонной кислоты и сухого комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов в известном способе отсутствует.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение одновременно кристаллической лимонной кислоты и сухого комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов высокого качества и с высоким выходом.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается способом получения лимонной кислоты из культуральной жидкости, имеющей активность α-амилазы и глюкоамилазы, включающим отделение мицелия гриба-кислотообразователя Aspergillus niger от ферментированного раствора при температуре ≤32°С, очистку ферментированного раствора с температурой ≤32°С посредством фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,65 мкм и разделение ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на раствор лимонной кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов, в котором согласно изобретению используют ферментированный раствор с концентрацией белка 1,5-7,0 г/дм³, который дополнительно очищают через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, 0,15 мкм, раствор лимонной кислоты концентрируют, причем раствор с содержанием белка 0,05-0,15 г/дм³ предварительно осветляют, а затем концентрируют, кристаллизуют и отделяют кристаллы лимонной кислоты от маточного раствора, при этом маточный раствор с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,1-0,4, возвращают на стадию концентрирования, а с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,41-0,8, предварительно осветляют, а затем возвращают на стадию концентрирования, раствор упомянутых ферментов высушивают сублимацией или распылением до получения сухого комплекса с ферментативной активностью α-амилазной 700-900 ед./г и глюкоамилазной 10000-15000 ед./г или осаждают с последующим высушиванием до получения сухого комплекса с ферментативной активностью α-амилазной 1000-1300 ед./г и глюкоамилазной 20000-26000 ед./г.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В примерах используют ферментированный раствор, который получают ферментацией среды на основе гидролизата крахмала грибом Aspergillus niger и фильтрованием культуральной жидкости.

Ферментированный раствор представляет собой жидкость, концентрация лимонной кислоты в котором составляет 100-150 г/дм³, значение декстриногенной активности (ДАк) - (0,5-3,7) ед./см³, сахарогенной активности (САк) - (20-200) ед./см³, оптическая плотность D при λ_max 400 нм 1,5-5,0, при λ_max 750 нм 2,0-3,5, характеризующая соответственно цветность и мутность раствора, содержание белка 1,5-7,0 г/дм³, рН 1,3-2,8.

В примерах используют капсульные фильтрующие мембранные элементы на основе стекловолоконного картона, фторопласта марок КФМ.К, КФМ.СЦ, КФМ.Ф (НПП "ТехноФильтр", г.Владимир с размером пор 0,65, 0,45 и 0,15 мкм). Для ультрафильтрации применен аппарат ВПУ НПК "Биотест", г.Кириши, Россия и полые волокна с удерживанием молекулярной массы 1000, 5000, 15000, 50000.

В примерах используют известные способы анализа: определение содержания кислоты в растворах титриметрическим методом, определение оптической плотности растворов, декстриногенной и сахарогенной активностей с помощью колориметрического метода, белка - методом Лоури, микробиологических показателей - по ГОСТ 20264.1-74, показателей лимонной кислоты - по ГОСТ 908-2004.

Пример 1

В ферментатор объемом 30 дм³ помещают 16,0 дм³ питательной среды и засевают ее подрощенным мицелием. Ферментацию проводят при температуре 32°С и числе оборотов мешалки в минуту 120 на первые сутки процесса, 150-200 - на 2 сутки, 250-300 - 3-4 сутки, 300-350 - 5-6 сутки. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в ферментированном растворе определяют оптическую плотность раствора, активность кислотостабильных амилолитических ферментов, концентрацию белка и лимонной кислоты. Ферментированный раствор объемом 18,0 дм³, с содержанием лимонной кислоты 100 г/дм³, белка - 7,0 г/дм³, ДАк 3,7 ед./см³, САк 200 ед./см³, D при λ_max 400 нм 5,0, D при λ_max 750 нм 3,5, рН 2,8 пропускают последовательно через фильтрующие мембраны с диаметром пор 0,65 мкм, 0,45 мкм и 0,15 мкм (микрофильтрация) для полного удаления остатков мицелия, а затем раствор, полностью очищенный от клеток, содержащий кислоту и кислотостабильные амилолитические ферменты, разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 50000, на раствор лимонной кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов. Раствор лимонной кислоты объемом 16,0 дм³ с содержанием белка 0,15 г/дм³ предварительно осветляют, смешивая с суспензией активного угля из расчета 0,5 г угля на 100 г лимонной кислоты при температуре 20°С и смесь перемешивают в течение 1,0 часа. Суспензию фильтруют и осветленный раствор лимонной кислоты концентрируют при вакууме 0,082 МПа (615 мм рт.ст.) до объема 2,2 дм³. Полученный раствор с содержанием лимонной кислоты 69% охлаждают до плюс 8°С и перемешивают при этой температуре в течение 1,5 часов, суспензию кристаллов лимонной кислоты центрифугируют при температуре плюс 8°С, кристаллы отделяют от жидкости фильтрацией, промывают водой с температурой плюс 30°С в объеме 0,03 дм³ с одновременным отсасыванием жидкости с последующим высушиванием при температуре плюс 50°С в течение 1,5 часов.

После отделения кристаллов маточный раствор 1 объемом 0,9 дм³ с содержанием лимонной кислоты 329 г/дм³ и D при λ_max 400 нм 0,10 возвращают на стадию концентрирования раствора лимонной кислоты. Маточный раствор 2 от второго отделения объемом 1,1 дм³ с содержанием лимонной кислоты 350 г/дм³ и D λ_max 400 нм 0,20 возвращают на стадию концентрирования раствора лимонной кислоты от третьей ферментации. Маточный раствор 3 объемом 1,12 дм³, с содержанием лимонной кислоты 358 г/дм³ и D при λ_max 400 нм 0,40 возвращают на стадию концентрирования раствора лимонной кислоты от четвертой ферментации. Маточный раствор 4 объемом 1,15 дм³, с содержанием лимонной кислоты 403 г/дм³ и D при λ_max 400 нм 0,41 возвращают на стадию осветления раствора лимонной кислоты после пятой ферментации и смешивают с суспензией активного угля из расчета 1,0 г угля на 100 г лимонной кислоты при температуре 20°С в течение 1 ч. Маточный раствор 5 объемом 1,1 дм³, с содержанием лимонной кислоты 447 г/дм³ и D при λ_max 400 нм 0,62 возвращают на стадию осветления раствора лимонной кислоты после шестой ферментации по аналогии с маточным раствором 5. Маточный раствор 6 объемом 1,22 дм³, с содержанием лимонной кислоты 608 г/дм³ и D при 0,68 и последующий маточный раствор 7 объемом 1,25 дм³ с содержанием лимонной кислоты 625 г/дм³ и D при λ_max 400 нм 0,8 возвращают на стадию осветления раствора лимонной кислоты после последующей ферментации и смешивают с суспензией активного угля из расчета 2,0 г угля на 100 г лимонной кислоты. Раствор ферментов после ультрафильтрации объемом 0,4 дм³ высушивают сублимацией при температуре замораживания ферментов минус 60°С, в течение 10 часов. В сухом комплексе определяют активность α-амилазы и глюкоамилазы.

Сухой комплекс ферментов получают также путем смешивания раствора ферментов после ультрафильтрации с температурой 25°С объемом 0,48 дм³ с раствором едкого натрия (NaOH) с содержанием NaOH 3% объемом 0,010 дм³ до рН 3,3 или объемом 0,012 дм³ до рН 4,8 с последующим смешиванием с раствором этилового спирта объемом 1,44 дм³ с содержанием этилового спирта 96%, что соответствует объемному соотношению 1:3 и содержанию спирта в смеси 70%. При температуре раствора спирта минус 10°С спиртовую суспензию фермента центрифугируют при температуре минус 8°С и осадок высушивают распылением при температуре теплоагента от 110 до 160°С. В сухом комплексе определяют активность α-амилазы и глюкоамилазы.

Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2.

Ферментацию, очистку растворов, выделение лимонной кислоты и комплекса ферментов проводят согласно примеру 1.

Используют ферментированный раствор с содержанием лимонной кислоты 120 г/дм³, белка 5,3 г/дм³, ДАк 3,0 ед./см³, Сак 130 ед./см³, D при λ_max 400 нм 2,2, D при λ_max 750 нм 2,6, рН 1,9. Ультрафильтрацию проводят через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, и получают раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,09 г/дм³, который осветляют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Пример 3.

Ферментацию, очистку растворов, выделение лимонной кислоты и комплекса ферментов проводят согласно примеру 1.

Используют ферментированный раствор с содержанием лимонной кислоты 130 г/дм³, белка 4,3 г/дм³, ДАк 2,5 ед./см³, Сак 100 ед./см³, D при λ_max 400 нм 2,2, D при λ_max 750 нм 2,7, рН 2,3.

Ультрафильтрацию проводят через мембрану, удерживающую молекулярную массу 5000, и получают раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,05 г/дм³, который осветляют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Пример 4.

Ферментацию, очистку растворов, выделение лимонной кислоты и комплекса ферментов проводят согласно примеру 1.

Используют ферментированный раствор с содержанием лимонной кислоты 150 г/дм³, белка 1,5 г/дм³, ДАк 0,5 ед./см³, Сак 20 ед./см³, D при λ_max 400 нм 1,5, D при λ_max 750 нм 2,0, рН 1,3. Ультрафильтрацию проводят через мембрану, удерживающую молекулярную массу 1000, и получают раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,02 г/дм³. Осветление раствора лимонной кислоты после ультрафильтрации не проводят. Маточные растворы с D при λ_max 400 нм 0,41-0,8 осветляют, смешивая с суспензией активного угля из расчета 2,0 г угля на 100 г лимонной кислоты при температуре 70°С и смесь перемешивают в течение 30 минут. Суспензию фильтруют и осветленный маточный раствор возвращают на стадию концентрирования.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Пример 5 (по прототипу)

Ферментацию, очистку растворов, выделение лимонной кислоты и комплекса ферментов проводят согласно примеру 1.

Используют ферментированный раствор с содержанием лимонной кислоты 125 г/дм³, белка 3,5 г/дм³, ДАк 1,8 ед./см³, Сак 58 ед./см³, D при λ_max 400 нм 2,4, D при λ_max 750 нм 2,3, рН 2,3. Микрофильтрацию ферментированного раствора проводят через мембрану с диаметром пор 0,65 мкм. Ультрафильтрацию осуществляют через мембрану, удерживающую молекулярную массу 50000, и получают очищенный от остатков мицелия продуцента и ферментов раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,35 г/дм³ и раствор ферментов, содержащий клетки продуцента в количестве 30 КОЕ/см³, а полученный после осаждения спиртом и высушивания сухой комплекс ферментов содержит клетки продуцентов в количестве 2 КОЕ/г, что не соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1293.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Результаты, полученные в примерах 1-4 по предлагаемому способу, и в примере 5 - по прототипу, показывает, что использование в примерах 1-4 мембран с диаметром пор 0,45 мкм и 0,15 мкм дополнительно с мембраной 0,65 мкм для очистки ферментированного раствора с концентрацией белка 1,5-7,0 г/дм³, позволяет полностью удалить клетки продуцента и получить «стерильный» ферментированный раствор, а после его ультрафильтрации - и более чистый раствор лимонной кислоты и раствор амилолитических ферментов.

На основе очищенных растворов лимонной кислоты с помощью предложенных операций и условий их проведения предлагаемый способ позволяет также получить кристаллическую лимонную кислоту высокого качества и соответствующую требованиям ГОСТ 908-2004 «Кислота лимонная моногидрат пищевая», с высоким выходом (80,5-80,8%) (табл.2).

Кроме того, полученные растворы ферментов по предлагаемому способу обладают ферментированными активностями, ДАк и САк, равными и превышающими активности известных промышленных ферментных препаратов амилолитического действия, и по компонентному составу являются комплексными ферментными препаратами, востребованными в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной спиртовой отраслях промышленности. Сухой ферментный комплекс по ферментной активности и степени очистки соответствует очищенным комплексным ферментным препаратам, применяемым в медицине. Выход ферментов высокий (81,2-83,7%). Ферментный комплекс в жидкой и сухой формах не содержит клетки продуцента - плесневого гриба Asp.niger, что соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1293.

В примере 5 (по прототипу) ферментированный раствор очищают посредством фильтрации через мембрану с размерами пор 0,65 мкм, разделяют ультрафильтрацией и получают раствор лимонной кислоты, не содержащий клетки продуцента, но характеризующийся присутствием веществ, усиливающих цветность и затрудняющих кристаллизацию лимонной кислоты, что приводит к снижению ее выхода (63,4%) и качества. Маточный раствор содержит высокий процент лимонной кислоты и сильно окрашен (D при λ_max 400 нм 0,46). Выделение из него лимонной кислоты не эффективно (выход 5,3%). Раствор ферментов после ультрафильтрации и сухой комплекс ферментов после спиртового осаждения содержат клетки продуцента и характеризуются меньшей степенью очистки и ферментативными активностями. Выход ферментов сравнительно ниже (43,1%).

Таким образом, предлагаемым способом из ферментированного раствора после ферментации среды на основе гидролизата крахмала плесневым грибом Aspergillus niger получают одновременно кристаллическую лимонную кислоту и сухой комплекс кислотостабильных амилолитических ферментов высокого качества и с высоким выходом.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов, обладающих α-амилазной и глюкоамилазной активностями. Способ заключается в том, что при температуре ≤32°С от ферментированного раствора с концентрацией белка 1,5-7,0 г/дм³ отделяют мицелий гриба-кислотообразователя Aspergillus niger, очищают полученный ферментированный раствор посредством последовательных процессов фильтрации через мембраны с диаметром пор 0,65 мкм, 0,45 мкм, 0,15 мкм, а затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на раствор лимонной кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов. Раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,05-0,15 г/дм³ предварительно осветляют, а затем концентрируют, далее кристаллизуют и отделяют кристаллы лимонной кислоты от маточного раствора. Маточный раствор с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,1-0,4, возвращают на стадию концентрирования, а с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,41-0,8, предварительно осветляют, а затем возвращают на стадию концентрирования. Раствор упомянутых ферментов высушивают сублимацией или распылением до получения сухого комплекса с ферментированной активностью α-амилазной 700-900 ед./г и глюкоамилазной 10000-15000 ед./г или осаждают с последующим высушиванием до получения сухого комплекса с ферментированной активностью α-амилазной 1000-1300 ед./г и глюкоамилазной 20000-26000 ед./г. Способ позволяет одновременно получить кристаллическую лимонную кислоту и сухой комплекс кислотостабильных амилолитических ферментов высокого качества и с высоким выходом. 2 табл.

Способ получения лимонной кислоты и комплекса кислотостабильных амилолитических ферментов из культуральной жидкости, имеющей активность α-амилазы и глюкоамилазы, включающий отделение мицелия гриба-кислотообразователя Aspergillus niger от ферментированного раствора при температуре ≤32°С, очистку ферментированного раствора с температурой ≤32°С посредством фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,65 мкм и разделение ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу в пределах 1000-50000, на раствор лимонной кислоты и раствор кислотостабильных амилолитических ферментов, отличающийся тем, что используют ферментированный раствор с концентрацией белка 1,5-7,0 г/дм³, который дополнительно очищают через мембраны с диаметром пор 0,45, 0,15 мкм, раствор лимонной кислоты концентрируют, причем раствор лимонной кислоты с содержанием белка 0,05-0,15 г/дм³ предварительно осветляют, а затем концентрируют, кристаллизуют и отделяют кристаллы лимонной кислоты от маточного раствора, при этом маточный раствор с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,1-0,4, возвращают на стадию концентрирования, а с оптической плотностью при λ_max 400 нм, равной 0,41-0,8, предварительно осветляют, а затем возвращают на стадию концентрирования, раствор упомянутых ферментов высушивают сублимацией или распылением до получения сухого комплекса с ферментативной активностью α-амилазной 700-900 ед./г и глюкоамилазной 10000-15000 ед./г или осаждают с последующим высушиванием до получения сухого комплекса с ферментативной активностью α-амилазной 1000-1300 ед./г и глюкоамилазной 20000-26000 ед./г.