Способ получения инвертазы и лимонной кислоты Российский патент 2018 года по МПК C12P7/48 C12N9/24 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения инвертазы и лимонной кислоты ферментацией гидролизатов кукурузного крахмала грибом Aspergillus niger.

За рубежом промышленные препараты инвертазы обычно получают с помощью дрожжей. Впервые инвертаза была получена из культуры дрожжей в виде водного раствора Деберейнером и Мичерлихом в 1830 г. Бертле выделил инвертазу в чистом виде в 1860 г.

Известен способ получения препарата инвертазы, который включает автолитическую деструкцию клеток дрожжей, обладающих инвертазной активностью, центрифугирование полученного автолизата, промывку осадка и его центрифугирования до получения осадка, состоящего из изолированных стенок дрожжевых клеток (патент РФ, №2157844, 20.10.2000, Бюл. №29).

Недостатком этого способа является то, что препарат инвертазы состоит преимущественно из стенок дрожжевых клеток, что не позволяет получить чистый препарат инвертазы.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения инвертазы, включающий глубинную ферментацию среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, при постоянном перемешивании в течение 5 суток (Шарова Н.Ю., Выборнова Т.В., Килеева А.И., Юшкаускайте А.Р. Инвертазная активность при культивировании продуцентов лимонной кислоты-штаммов Aspergillus niger на мелассе и гидролизатах крахмала // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. 2016. Т. 12. №4. С. 16-22.).

Известным способом в результате 120-часовой ферментации получают инвертазу с экстрацеллюлярной активностью 0,36 ед/см³.

Недостатком вышеуказанного способа является получение инвертазы с низкой ферментативной активностью.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение одновременно инвертазы с высокой ферментативной активностью за счет интенсификации биосинтеза инвертазы и обеспечение высокого выхода лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в известном способе получения инвертазы, включающим глубинную ферментацию среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, при постоянном перемешивании в течение 5 суток, согласно изобретению в первые сутки процесса перемешивание осуществляют со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов мешалки в минуту, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки (24-40) литров в минуту, во вторые сутки (32-48) литров в минуту, в третьи сутки и до конца процесса (40-56) литров в минуту и далее проводят разделение культуральной жидкости гриба-кислотообразователя на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.

Микромицет Aspergillus niger является аэробным продуцентом и поэтому аэрирование глубинной культуры является важным фактором и его интенсивность по-разному влияет на продуцирующую способность гриба. Увеличение степени аэрирования среды приводит к интенсификации процесса биосинтеза фермента и повышению ее активности. Совокупность предлагаемых режимов операций и последовательность их проведения обеспечивает также достижение высокого выхода лимонной кислоты.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В примерах используют ферментированный раствор, который получают ферментацией среды на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом Aspergillus niger в ферментаторе вместимостью 30 дм³.

В примерах инвертазную активность оценивают с помощью колориметрического метода (Рухлядева А.П., Полыгалина Г.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. Москва. Легкая и пищевая промышленность, 1981. - 288 с.). Концентрацию лимонной кислоты определяют титриметрическим методом (Муратова Е.И., Зюзина О.В., Шуняева О.Б. Биотехнология органических кислот и белковых препаратов: учебное пособие - Тамбов: Изд-во Тамб.гос.техн.ун-та, 2007. - 80 с.).

Для ультрафильтрации используют аппарат ВПУ НПК «Биотест», г. Кириши, Россия и мембрану на основе полых волокон, удерживающих молекулярную массу в пределах 1000-15000.

Пример 1.

Гидролиз кукурузного крахмала до степени гидролиза, обеспечивающей декстрозный эквивалент ДЕ=52,3% проводят в соответствии с (патент РФ №2294371, 27.02.2007, Бюл. №6).

Выращивание посевного мицелия: стерильную питательную среду на основе гидролизата кукурузного крахмала, содержащую: углеводный субстрат - 50 г/дм³, NH₄NO₃ - 2,5 г/дм³, KН₂РO₄ - 0,16 г/дм³, MgSO₄⋅7Н₂O - 0,25 г/дм³, засевают спорами гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F- 171, предварительно выдержанными в среде А4 следующего состава: сахароза - 50 г/дм³, NH₄NO₃ - 2,5 г/дм³, KН₂РO₄ - 0,16 г/дм³, MgSO₄⋅7Н₂O - 0,25 г/дм³.

Выращивание посевного мицелия проводят при температуре 36°С и скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 оборотов мешалки в минуту, после 12 ч и до конца процесса 250 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 л/мин, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 л/мин. Возраст посевного мицелия составляет 24 часа.

Ферментация: в ферментатор вместимостью 30 дм³ вносят 10 дм³ питательной среды на основе гидролизата кукурузного крахмала следующего состава: углеводный субстрат - 150 г/дм³, NH₄NO₃ - 2,5 г/дм³, KН₂РО₄ - 0,16 г/дм, MgSO₄⋅7Н₂О - 0,25 г/дм³ и засевают посевным мицелием в количестве 10% от исходного объема среды. Ферментацию проводят при температуре 32°С в течение 5 суток.

В первые сутки процесса перемешивание культуральной жидкости осуществляют со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов мешалки в минуту, в третьи сутки - 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки 24 л/мин, во вторые сутки 32 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 40 л/мин.

После окончания ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в ферментированном растворе определяют экстрацеллюлярную инвертазную активность и концентрацию лимонной кислоты.

Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 100 г/дм³ и инвертазной активностью 1,14 ед/см³ разделяют ультрафильтрацией, пропуская через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 2

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия, ферментацию и перемешивание ферментационной среды проводят согласно примеру 1. Аэрирование глубинной культуры в первые сутки составляет 32 л/мин, во вторые сутки 40 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 48 л/мин. Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 110 г/дм³ и инвертазной активностью 1,31 ед./см³ разделяют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 3

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия, ферментацию и перемешивание ферментационной среды проводят согласно примеру 1. Аэрирование глубинной культуры в первые сутки составляет 40 л/мин, во вторые сутки 48 л/мин., в третьи сутки и до конца процесса 56 л/мин. Ферментированный раствор с концентрацией лимонной кислоты 105 г/дм³ и инвертазной активностью 1,25 ед./см³ разделяют согласно примеру 1.

Данные опыта представлены в таблице.

Пример 4 (по прототипу)

Гидролиз кукурузного крахмала, выращивание посевного мицелия и ферментацию проводят согласно примеру 1. Ферментацию осуществляют при постоянном перемешивании.

Данные опыта представлены в таблице.

Таким образом, как видно из результатов таблицы, предлагаемый способ позволяет одновременно получить инвертазу с высокой ферментативной активностью 1,31 ед./см³ и выходом 98,3% и лимонную кислоту с высоким выходом 92%.

Предложен способ получения инвертазы и лимонной кислоты. Способ предусматривает выращивание при 36°С посевного мицелия Aspergillus niger - продуцента лимонной кислоты, и глубинную ферментацию среды при 32°С на основе гидролизата кукурузного крахмала, содержащей источник азота и минеральные соли. Выращивание посевного мицелия проводят при скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 об/мин, после 12 ч и до конца процесса 250 об/мин в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 л/мин, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 л/мин. Глубинную ферментацию проводят при перемешивании в первые сутки со скоростью 250 об/мин, во вторые сутки со скоростью 300 об/мин, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 об/мин в условиях аэрации в первые сутки 24-40 л/мин, во вторые сутки 32-48 л/мин, в третьи сутки и до конца процесса 40-56 л/мин. Разделяют культуральную жидкость на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты. Способ позволяет получить одновременно инвертазу с активностью 1,31 ед./см³ и выходом 98,3% и лимонную кислоту с концентрацией 110 г/дм³ и выходом 92%. 1 табл., 4 пр.

Способ получения инвертазы и лимонной кислоты, включающий выращивание посевного мицелия при температуре 36°С и глубинную ферментацию среды при температуре 32°С на основе гидролизата кукурузного крахмала грибом-продуцентом лимонной кислоты Aspergillus niger, содержащей источник азота и минеральные соли, отличающийся тем, что выращивание посевного мицелия проводят при скорости перемешивания культуральной жидкости в первые 12 ч 120 оборотов мешалки в минуту, после 12 ч и до конца процесса 250 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые 6 ч - 8 литров в минуту, с 6 ч до 12 ч - 16 л/мин, с 12 ч до 24 ч - 32 литров в минуту, а глубинную ферментацию осуществляют при перемешивании в первые сутки со скоростью 250 оборотов мешалки в минуту, во вторые сутки со скоростью 300 оборотов в минуту, в третьи сутки и до конца процесса со скоростью 400 оборотов в минуту в условиях аэрации в первые сутки 24-40 литров в минуту, во вторые сутки 32-48 литров в минуту, в третьи сутки и до конца процесса 40-56 литров в минуту и далее проводят разделение культуральной жидкости гриба-кислотообразователя Aspergillus niger на мицелий и ферментированный раствор, который затем разделяют ультрафильтрацией через мембрану, удерживающую молекулярную массу 15000, на раствор инвертазы и раствор лимонной кислоты.