СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ГЛИКОЗИДАЗ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/14 C12R1/01 C12R1/465 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно пищевой биотехнологии, и касается способа получения ингибитора гликозидаз, предназначенного для использования в качестве биологически активной и пищевой добавки специального назначения в функциональных продуктах диетического направления

Известен способ получения ингибитора гликозидаз углеводной природы из культуральной жидкости с активностью 3000±200 ИЕ/см³ или 6500±500 ИЕ/см³, полученной при использовании актиномицетов (Streptomyces BKM Ac 1328-D и Streptomyces 839/64), включающий подкисление культуральной жидкости до рН 3,6±0,1 ед., центрифугирование, ультрафильтрацию через ацетилцеллюлозную мембрану УАМ-300 (полые волокна) при давлении 2,5-3,0 атм, депигментацию на анионите, лиофилизацию, позволяющий получать препарат ингибитора с активностью 130±100 и 250±200 ИЕ/мг (Акулова Н.Ю. Ингибиторы α-глюкозидаз из Streptomyces. Выделение и свойства: автореф. дисс. … канд. биол. наук: 03.00.04; АООТ «НИИТИАФ». - СПб., 1993. - 20 с.).

Однако процессы подготовки ионитов и их регенерации, основанные на использовании, в частности, кислот и щелочей, являются трудоемкими и сопровождаются большим количеством отходов.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом (Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1734) и имеющей ингибиторную активность 3700±180 ИЕ/см³, включающий очистку фильтрата культуральной жидкости с содержанием белка 5,0±0,2 г/дм³, редуцирующих сахаров 6,0±0,3 г/дм³, цветностью 8,2±0,4 е.о.п. посредством ультрафильтрации на фильтрационном аппарате ВПУ-15ПА, оснащенном мембраной с отсечением 15 кДа (полые волокна), при температуре 20°С, концентрирование фильтрата при температуре 90°С, осветление при температуре 25°С, сушку при температуре 55±2°С и измельчение (Ходкевич О.А. Разработка технологии биосинтеза ингибитора α-гликозидаз актиномицетами рода Streptomyces и применение комплексной пищевой добавки на его основе в хлебопечении: автореф. дисс. … канд. техн. наук: 05.18.07; ГУ ВНИИПАКК, ГОУ ВПО «СПб ГУ НиПТ». - СПб., 2009. - 16 с.).

Известный способ позволяет получать препарат ингибитора гликозидаз с активностью 700000±1000 ИЕ/г. Однако ультрафильтрация через мембрану с отсечением 15 кДа не позволяет полностью отделить балластные белковые примеси, которые при высокой температуре в процессе последующего концентрирования денатурируют и осложняют процесс осветления. Кроме того, в результате концентрирования при высокой температуре цветность концентрата увеличивается не только за счет концентрирования окрашенных примесей, но и за счет карамелизации редуцирующих сахаров, что также снижает эффективность осветления. Указанная в способе последовательность стадий «концентрирование → осветление» не позволяет снизить содержание белка, который является примесью и мешает ингибиторному действию выделенного препарата.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение ингибитора гликозидаз с повышенной активностью.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается способом получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом, включающим ультрафильтрацию фильтрата культуральной жидкости, осветление и последующую сушку и измельчение, в котором согласно изобретению фильтрат культуральной жидкости используют с активностью 4250±250 ИЕ/см³, ультрафильтрацию проводят через мембраны с отсечением 5 кДа, осветление ультрафильтрата осуществляют непосредственно после ультрафильтрации при температуре 30-40°С, затем проводят концентрирование под вакуумом 0,082 МПа при температуре 25-30°С и ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В примерах используют фильтрат культуральной жидкости, который получают ферментацией среды на основе гидролизата кукурузного крахмала актиномицетом Streptomyces lucensis ВКПМ Ac-1734 или Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1743 и фильтрованием культуральной жидкости.

Фильтрат культуральной жидкости представляет собой жидкость, значение ингибиторной активности в которой составляет 4100-4500 ИЕ/см³, содержание белка 2-6 г/дм³, содержание редуцирующих сахаров 5-10 г/дм³ оптическая плотность D при λ_max 360 нм равна 8,1-11,3 е.о.п., характеризующая цветность раствора.

Пример 1

Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4100 ИЕ/см³, содержанием белка 2 г/дм³, содержанием редуцирующих сахаров 5 г/дм³, D при λ_max 360 нм равно 8,1 е.о.п.

Фильтрат культуральной жидкости в количестве 1000 см³ очищают ультрафильтрацией через мембрану с отсечением 5 кДа и получают раствор объемом 0,9 дм³. Ультрафильтрат осветляют, смешивая с его с суспензией активного угля из расчета 0,5 г угля на 1 дм³ раствора, при температуре 40°С, и полученную суспензию перемешивают в течение 30 минут. Суспензию фильтруют и осветленный раствор концентрируют при вакууме 0,082 МПа (615 мм рт.ст.) и температуре 25°С до объема 0,2 дм³. Полученный концентрат очищают ультрафильтрацией через мембрану с отсечением 1 кДа и получают раствор объемом 0,15 дм³, который высушивают при температуре 40°С и измельчают. В сухом препарате ингибитора определяют ингибиторную активность.

Результаты опыта представлены в таблице 1.

Пример 2

Очистку фильтрата культуральной жидкости, концентрирование, очистку концентрата концентрата, высушивание и измельчение проводят согласно примеру 1.

Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4300 ИЕ/см³, содержанием белка 6 г/дм³, содержанием редуцирующих сахаров 10 г/дм³, D при λ_max 360 нм равно 11,3 е.о.п.

Осветление ультрафильтрата проводят активным углем в количестве 1,0 г на 1 дм³ раствора при температуре 30°С в течение 60 минут.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Пример 3.

Очистку ультрафильтратов, осветление, высушивание и измельчение проводят согласно примеру 1.

Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4500 ИЕ/см³, содержанием белка 4 г/дм³, содержанием редуцирующих сахаров 8 г/дм³, D при λ_max 360 нм равно 8,2 е.о.п.

Концентрирование проводят при температуре 30°С.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Пример 4 (по прототипу)

Используют фильтрат культуральной жидкости с ингибиторной активностью 4100 ИЕ/см³, с содержанием белка 5 г/дм³, содержанием редуцирующих сахаров 6 г/дм³, D при λ_max 360 нм равно 10,5 е.о.п.

Очистку фильтрата культуральной жидкости и осветление ультрафильтрата осуществляют согласно примеру 1. Для ультрафильтрации используют мембрану с отсечением 15 кДа. Затем ультрафильтрат концентрируют при температуре 90°С до объема 0,1 дм³ и осветляют при температуре 25°С. Осветленный раствор высушивают при температуре 55°С и измельчают. В сухом препарате ингибитора определяют ингибиторную активность.

Данные опыта представлены в таблице 1.

Результаты, полученные в примерах 1-4 по предлагаемому способу и в примере 5 - по прототипу, показывают, что последовательность «ультрафильтрация → осветление» и использование мембран с отсечением 5 и 1 кДа в примерах 1-4 позволяют полностью удалить балластную белковую фракцию и снизить цветность растворов. Использование предлагаемого способа обеспечивает улучшение качества препарата ингибитора, а именно увеличение ингибиторной активности в 8,6-11,4 раз, по сравнению с примером по прототипу и полное удаление белка, снижающего ингибиторное действие.

Таблица 1 Показатели процесса выделения ингибитора гликозидаз № примера Наименование полупродукта или продукта Наименование показателя Массовая концентрация, г/дм³, г/г* Показатель цветности, D при λ_max 360 нм, е.о.п. Ингибиторная активность ИЕ/см³; ИЕ/г* белка редуцирующих сахаров   Фильтрат культуральной жидкости         2,0 5,0 8,10 4100           Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа)         1,2 0,7 0,15 4100         1 Осветленный ультрафильтрат         0,8 0,7 0,03 4100   Концентрат 4,1 3,2 0,05 20400   Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа)         отсутствует 3,2 0,01 20400           Высушенный ультрафильтрат         отсутствует 0,7 отсутствует** 3000000           Фильтрат культуральной жидкости         6,0 10,0 11,3 4250         2 Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа)         3,5 1,5 0,25 4250           Осветленный ультрафильтрат 0,9 1,5 0,03 4250   Концентрат 4,5 7,5 0,07 21500   Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа)         отсутствует 7,5 0,01 21500           Высушенный ультрафильтрат         отсутствует 0,8 отсутствует** 3500000         3 Фильтрат культуральной жидкости         4,0 8,0 8,2 4500         Ультрафильтрат (отсечение мембраны 5 кДа)         2,4 1,2 0,20 4500        

  Осветленный ультрафильтрат         0,8 1,2 0,02 4500 Концентрат 4,0 6,0 0,05 22500 Ультрафильтрат (отсечение мембраны 1 кДа)         отсутствует 6,0 0,01 22500         Высушенный ультрафильтрат         отсутствует 0,8 отсутствует** 4000000           Фильтрат культуральной жидкости         5 6 10,5 4100         4 (по прототипу) Ультрафильтрат (отсечение мембраны 15 кДа)         3,2 3,5 0,65 4100         Концентрат 31,5 33,6 4,8 30600 Осветленный ультрафильтрат   30,6 0,65 30600 10,6     Высушенный ультрафильтрат 0,5 0,4 1,3** 350000 Примечание: * - для высушенного препарата, ** - показатель цветности определен для раствора высушенного ультрафильтрата с массовой долей 1%.

Проводят ферментацию питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом. Проводят ультрафильтрацию полученного фильтрата культуральной жидкости с активностью 4250±250 ИЕ/см³ через мембраны с отсечением 5 кДа. Концентрируют под вакуумом 0,082 МПА при температуре 25-30°C полученный фильтрат. Осветляют его при температуре 30-40°C. Снова проводят его ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа. Полученный ингибитор гликозидаз сушат и измельчают. Изобретение позволяет получить ингибитор гликозидаз с повышенной активностью 3500000±50000. 1 табл., 4 пр.

Способ получения ингибитора гликозидаз из фильтрата культуральной жидкости, полученной при ферментации питательной среды на основе гидролизатов кукурузного крахмала актиномицетом, включающий ультрафильтрацию фильтрата культуральной жидкости, концентрирование ультрафильтрата, осветление, последующую сушку и измельчение полученного ингибитора, отличающийся тем, что фильтрат культуральной жидкости используют с активностью 4250±250 ИЕ/см³, ультрафильтрацию проводят через мембраны с отсечением 5 кДа, осветление ультрафильтрата осуществляют непосредственно после ультрафильтрации при температуре 30-40°C, а затем проводят концентрирование под вакуумом 0,082 МПа при температуре 25-30°C и ультрафильтрацию через мембрану с отсечением 1 кДа.