СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2003 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N9/28 C12N9/34 C12N1/14 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы.

Известен способ получения амилолитических ферментов культивированием гриба Aspergillus niger на различных крахмалосодержащих средах с выходом 0,64 ед/см³ α-амилазы и 15,7 ед/см³ глюкоамилазы /1/.

Таким способом получают только кислотоустойчивые ферменты α-амилазу и глюкоамилазу.

Наиболее близким предлагаемому изобретению является способ получения лимонной кислоты на основе питательной среды, содержащей гидролизат крахмала и минеральные соли, включающий гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26-36 мас. % сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы, взятым в количестве 0,5-1,5 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, при выдерживании под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 минут, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала со значением декстрозного эквивалента не более 30, и последующую ферментацию питательной среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger в течение 6 суток при температуре 32^oС. После ферментации культуру гриба инактивируют кипячением и определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту /2/.

Таким способом получают лимонную кислоту, и можно предположить, что α-амилаза и глюкоамилаза образуются в небольшом количестве. Сведения об одновременном получении лимонной кислоты и кислотоустойчивых амилолитических ферментов отсутствуют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение в качестве целевых продуктов микробиологического синтеза лимонной кислоты трех продуктов: лимонной кислоты, кислотоустойчивых амилолитических ферментов - α-амилазы и глюкоамилазы, повышение их выхода.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе получения лимонной кислоты, включающем гидролиз крахмала ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента гидролизата крахмала не более 30, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger, добавляют дополнительно минеральные соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно (0,5-1,0)•10^-3, (1,5-3,5)•10^-3, (1,5-4,5)•10^-3 г на 1 дм³ гидролизата крахмала и органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75):1 соответственно.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В качестве исходного крахмалосодержащего сырья используют крахмальную суспензию с концентрацией сухих веществ 28,5 маc.%, приготовленную из сухого крахмала с содержанием 87 маc. % сухих веществ, а в качестве ферментного препарата бактериальной α-амилазы используют препарат, выпускаемый отечественной промышленностью под торговым названием "Амилосубтилин ГЗХ" или "Амилосубтилин Г10Х" с активностью от 1000 до 2500 единиц амилолитической способности (А.С) на 1 г препарата, в примерах используют препарат 1000 ед. А.С/г в качестве продуцента целевых продуктов использованы штаммы гриба Aspergillus niger ВКПМ F-171, ВКПМ F-501 и ВКПМ F-719, известные продуценты лимонной кислоты в биоконверсиях свекловичной мелассы /3, 4/ и сока сорго /5/.

В качестве органического источника азота использованы гидролизат соевой муки, гидролизат кукурузной муки, автолизат мицелия гриба Aspergillus niger.

Приготовление гидролизата соевой муки концентрации 100 г/дм³. Навеску 100 г соевой муки суспендируют в 700,0 см³ водопроводной воды. К суспензии добавляют препарат Протолихетерин Г20Х из расчета 1,5 ед. на 1 г соевой муки и проводят ферментативный гидролиз при температуре 55-60^oС в течение 1,5 ч. Объем полученного гидролизата доводят водой до 1000 см³ и выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, затем охлаждают до 45-50^oС. Гидролизат соевой муки концентрации 100 г/дм³ содержит 7,36 % азота /6/.

Приготовление гидролизата кукурузной муки концентрации 500 г/дм³. Навеску 500 г кукурузной муки суспендируют в 700,0 см³ водопроводной воды. К суспензии добавляют препарат Амилосубтилин ГЗХ или Г10Х из расчета 1,5 ед на 1 г кукурузной муки и проводят ферментативный гидролиз при температуре 80-85^oС в течение 1,5 ч. Объем полученного гидролизата доводят водой до 1000 см³ и выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, затем охлаждают до 45-50^oС. Гидролизат кукурузной муки концентрации 500 г/дм³ содержит 1,2 % азота /6/.

Приготовление автолизата мицелия гриба Aspergillus niger концентрации 80 г/дм³. Навеску 80 г влажного мицелия (влажность 80%) суспендируют в водопроводной воде, нагревают до 50-52^oC. Объем доводят водой до 1000 см³, выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 60 мин, затем охлаждают до 45-50^oC. Автолизат мицелия гриба Aspergillus niger концентрации 80 г/дм³ содержит 8% азота. Азот определен методом Кьельдаля.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
а) Подготовка конидий продуцента.

Конидии гриба-продуцента Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 взвешивают в стерильную пробирку в расчете 250 мг на 100 см³, помещают в среду следующего состава, г/дм³: сахар-песок - 50,0, дигидроортофосфат калия - 0,16, нитрат аммония - 2,50, сульфат магния гептагидрат - 0,25.

Суспензию конидий гриба в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5-6 часов при температуре 32^oС.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия.

11,5 г крахмала растворяют в нагретой до 50^oС водопроводной воде, доводят объем до 200 см³, получая 5,12 маc.% крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала).

При интенсивном перемешивании нагревают крахмальную суспензию до 55-60^oС и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем разжижение крахмала соответственно декстрозному эквиваленту (ДЕ), равному 25,0, при постоянном перемешивании и выдерживают в течение 90 мин. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22^oС и доводят объем до 200 см³.

Затем гидролизат крахмала с ДЕ, равным 25,0, выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 5,0 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 0,50 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 маc.% и 0,30 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 маc.%.

в) Приготовление питательной среды для ферментации
160,0 г крахмала растворяют в водопроводной воде, нагретой до 50^oС, доводят объем до 500 см³, получая 28,5 мас.%-ную крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала), которую нагревают при интенсивном перемешивании до 55-60^oС и вводят ферментный препарат бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 25,0. При постоянном перемешивании доводят температуру до 82-85^oС и выдерживают при этой температуре 90 мин. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22^oС, доводят объем до 500 см³.

Затем гидролизат выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 18,9 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 маc.%.

В качестве органического источника азота вносят стерильный гидролизат соевой муки концентрации 100 г/дм³ в количестве 26,9 см³, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота как 65:1. Затем в среду стерильно вносят 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,80 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, что соответствует 0,0025 г соли, 0,3 см³ раствора сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 мас. %, что соответствует 0,0015 г соли кобальта, 0,20 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 мас.%, что соответствует 0,0010 г соли меди, и стерильно разбавляют водой до 1,0 дм³. Концентрация ферментируемых сахаров - (150-160) г/дм³ среды.

г) Выращивание посевного мицелия
В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 36 часов при температуре 32^oС.

д) Ферментация питательной среды на основе гидролизата крахмала в лимонную кислоту
В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 10 см³ подрощенного мицелия. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 6 сут при температуре 32^oС. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в культуральном растворе определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту и активность кислотоустойчивых амилолитических ферментов: α-амилазы - амилолитическую способность (А.С), глюкоамилазы - глюкоамилазную способность (Гл.С).

Пример 2
а) Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют гидролизат крахмала с ДЕ, равным 26,5.

В гидролизат крахмала вводят раствор нитрата аммония концентрации 10 мас. % в количестве 17,6 см³ и стерильный гидролизат кукурузной муки концентрации 500 г/дм³ в количестве 30,1 см³, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота как 70:1, 0,3 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 маc.%, соответствующее 0,0015 г соли цинка, 0,9 см³ раствора сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 маc. %, соответствующее 0,0045 г соли кобальта, 0,10 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 маc.%, соответствующее 0,0005 г соли меди.

Пример 3.

а) Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют гидролизат крахмала с ДЕ, равным 28,5, и в гидролизат крахмала для ферментации вводят раствор нитрата аммония концентрации 10 мас. % в количестве 16,4 см³, стерильную суспензию автолизата мицелия культуры Aspergillus niger концентрации 80 г/дм³ в количестве 66,4 см³, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота как 75:1. Затем стерильно вносят 0,7 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 маc.%, что соответствует 0,0035 г соли цинка, 0,3 см³ раствора сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,0015 г соли кобальта, 0,20 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 маc.%, соответствующее 0,0010 г соли меди.

Пример 4.

Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1, но используют гидролизат крахмала с ДЕ, равным 29,0, в него стерильно вносят раствор нитрата аммония концентрации 10 мас.% в количестве 18,9 см³, в качестве органического источника азота гидролизат соевой муки концентрации 100 г/дм³ в количестве 17,7 см³ и суспензию автолизата мицелия гриба Aspergillus niger концентрации 80 г/дм³ в количестве 50 см³, что обеспечивает в среде соотношение углерода и азота как 65:1, стерильно вводят 0,4 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, соответствующее 0,002 г соли цинка, 0,5 см³ раствора сульфата кобальта гептагидрата концентрации 0,5 маc.%, соответствующее 0,0025 г соли кобальта и 0,2 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 маc.%, соответствующее 0,0010 г соли меди.

Пример 5 (по прототипу).

Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но без добавления сульфатов цинка, кобальта, меди и органического источника азота.

Технический результат в опытах, представленных в примерах 1-4 таблицы, по сравнению с прототипом заключается в сохранении конверсии сахаров в лимонную кислоту на достаточно высоком уровне (79,5-83,2)% и получении кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы с активностями, повышенными соответственно до 0,80-1,25 единиц А.С/см³ и 32,6-76,7 единиц Гл. С/см³.

Источники информации
1. Тохадзе З. В., Квачадзе Л.П., Квеситадзе Г.И. Влияние состава питательной среды на биосинтез кислотоустойчивой α-амилазы различными видами Aspergillus// Прикладная биохимия и микробиология. - 1975 - 4 - с.515-518.

2. Патент РФ 2132384, МПК 6 С 12 Р 7/48, С 12 N 1/14, 1999.

3. Патент РФ 975799, МКИ С 12 N 15/00, 1982.

4. Патент СССР 1811697, МКИ 5 С 12 N 1/14, С 12 Р 7/48, 1993.

5. Патент РФ 2088658, МПК 6 С 12 N 1/14, С 12 Р 7/48, 1997.

6. Химический состав пищевых продуктов. Справочник/ под ред. акад. АМН СССР А.А. Покровского - М.: Пищевая промышленность - 1977 - с.18.24.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы. Способ включает гидролиз крахмала ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. В питательную среду для ферментации дополнительно добавляют минеральные соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно (0,5-1,0)•10^-3, (1,5-3,5)•10^-3, (1,5-4,5)•10^-3 г на 1 дм³ гидролизата крахмала и органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75):1 соответственно. Результатом изобретения является конверсия сахаров в лимонную кислоту на уровне (79,5-83,2)% и получение кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы с активностями соответственно 0,80-1,25 единиц А. С/см³ и 32,6-76,7 единиц Гл.С/см³. 1 табл.

Способ получения лимонной кислоты, включающий гидролиз крахмала ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента гидролизата крахмала не более 30, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, отличающийся тем, что добавляют дополнительно минеральные соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II) в количестве соответственно (0,5-1,0)•10^-3, (1,5-3,5)•10^-3, (1,5-4,5)•10^-3 г на 1 дм³ гидролизата крахмала и органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75): 1 соответственно.