СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ, АЛЬФА-АМИЛАЗЫ И ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12P7/48 C12N9/30 C12N9/34 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы, которые используются в хлебопечении, пивоварении, крахмалопаточной промышленности, медицине, т.е. во всех процессах, требующих гидролиза поли- и олигосахаридов.

Известен способ получения лимонной кислоты, включающий гидролиз крахмала препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении до достижения значения декстрозного эквивалента гидролизата крахмала не менее 30%, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. В качестве минеральных солей используют соли в виде сульфатов меди (II), цинка, кобальта (II). К гидролизату крахмала дополнительно добавляют органический источник азота в количестве, обеспечивающем содержание в среде углерода и азота в соотношении (65-75):1 соответственно /1/.

Недостатком вышеуказанного способа является невысокий выход ос-амилазы и глюкоамилазы.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения лимонной кислоты, α-амилазы и глюкоамилазы, включающий гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger /2/.

Недостатком вышеуказанного способа является невысокий выход α-амилазы и глюкоамилазы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение выхода α-амилазы и глюкоамилазы при сохранении высокого выхода лимонной кислоты.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе получения лимонной кислоты, α-амилазы и глюкоамилазы, включающем гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger, в качестве крахмалсодержащего сырья используют рисовую в количестве 205,3-235,7 г или ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г, предварительно выдержанную в воде, при температуре 20-25°С в течение 10-12 часов, при этом содержание в полученной суспензии рисовой муки углерода и азота в соотношении (20-23):1, а в суспензии ржаной муки (14-16,0):1 соответственно, ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода не менее (35-45)%.

Использование в качестве исходного сырья рисовой муки в количестве 205,3-235,7 г или ржаной муки 232,0-290,6 г, а также предварительное выдерживание рисовой или ржаной муки в воде при температуре 20-25°С в течение 10-12 часов способствует максимальному выходу из растительных клеток растворимых углеводов и белка, необходимых для роста и развития гриба Aspergillus niger, что обеспечивает соотношение углерода и азота (20-23):1 для суспензии рисовой муки и (14-16):1 - для суспензии ржаной муки, сокращает длительность гидролиза и повышает выход α-амилазы и глюкоамилазы.

Использование ферментного препарата в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-45% также повышает выход α-амилазы и глюкоамилазы, при этом сохраняя и высокий выход лимонной кислоты.

В качестве исходного крахмалосодержащего сырья используют суспензию рисовой или ржаной муки с концентрацией сухих веществ 25 мас.%, приготовленную из сухой рисовой или ржаной муки с содержанием сухих веществ 86 мас.%, а в качестве ферментного препарата бактериальной α-амилазы используют препарат, выпускаемый отечественной промышленностью под торговым названием «Амилосубтилин ГЗХ» или «Амилосубтилин Г10Х» с активностью от 1000 до 3000 единиц амилолитической способности (А.С) на 1 г препарата, в примерах используют препарат 1000 ед. А.С/г, а в качестве продуцента целевых продуктов выбраны штаммы гриба Aspergillus niger ВКПМ F-171, ВКПМ F-501 и ВКПМ F-719, известные продуценты лимонной кислоты для биоконверсии свекловичной мелассы /2, 3/ и сока сорго /4/.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

а) Подготовка конидий продуцента

Конидии гриба-продуцента Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 взвешивают в стерильную пробирку в расчете 250 мг на 100 см³, помещают в среду следующего состава, г/дм³: сахар-песок - 50,0, дигидроортофосфат калия - 0,16, нитрат аммония - 2,50, сульфат магния гептагидрат - 0,25.

Суспензию конидий гриба в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5-6 часов при температуре 32°С.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия

50,0 г сахара-песка, 0,16 г дигидроортофосфата калия, 2,50 г нитрата аммония, 0,25 г сульфата магния гептагидрата растворяют в 1 дм³ водопроводной воды. Затем раствор выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 25-32°С.

в) Приготовление питательной среды для ферментации

205,3 г рисовой муки заливают водопроводной водой при температуре 20°С, доводят объем до 500 см³ и выдерживают при температуре 20°С в течение 10 часов, затем нагревают до 40°С, получая 41,0 мас.%-ную суспензию рисовой муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 23:1, которую нагревают при интенсивном перемешивании до 55-60°С и вводят ферментный препарат бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 35%. При постоянном перемешивании доводят температуру до 82-85°С и выдерживают при этой температуре 60 мин. Для прекращения действия ферментного препарата полученный гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22°С, доводят объем до 500 см³.

Затем гидролизат рисовой муки с ДЕ, равным 35%, выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50°С и стерильно вносят 0,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,80 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.% и стерильно разбавляют водой до 1,00 дм³. Концентрация ферментируемых сахаров 130,6 г/дм³ среды.

г) Выращивание посевного мицелия

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 36 часов при температуре 32°С.

д) Ферментация питательной среды на основе гидролизата рисовой муки

В колбу емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 9 см³ подрощенного мицелия. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 5 сут при температуре 32°С. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в культуральном растворе определяют конверсию сахаров в лимонную кислоту и активность кислотоустойчивых амилолитических ферментов: α-амилазы - амилолитическую способность, глюкоамилазы - глюкоамилазную способность (Гл.С).

Пример 2

а) Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но суспензию рисовой муки выдерживают в водопроводной воде в течение 12 часов при температуре 25°С, в результате гидролиза получают ДЕ, равный 40%.

Пример 3

а) Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, время выдерживания в воде 11 часов, а для приготовления гидролизата используют 235,7 г рисовой муки, получая 47,1 мас.%-ную суспензию рисовой муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 20,0:1, и используют гидролизат рисовой муки с ДЕ, равным 45%. Концентрация ферментируемых сахаров 150,0 г/дм³ среды.

Пример 4

Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1, но готовят суспензию из 232,0 г ржаной муки, получая 46,4 мас.%-ную суспензию ржаной муки (в расчете на сухое вещество) с содержанием углерода и азота в соотношении 14:1, и используют гидролизат с ДЕ, равным 40%. Концентрация ферментируемых сахаров 119,7 г/дм³ среды.

Пример 5

Используют продуцент - гриб Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, подготовку его конидий и ферментацию проводят аналогично примеру 1, но готовят суспензию из 271,3 г ржаной муки, выдерживают при температуре 25°С в течение 11 часов, получая 54,2 мас.%-ную суспензию ржаной муки (в расчете на сухое вещество), получают суспензию ржаной муки с содержанием углерода и азота в соотношении 15,4:1,0 и используют гидролизат с ДЕ, равным 37%. Концентрация ферментируемых сахаров 140,9 г/дм³ среды.

Пример 6

Используют продуцент - гриб Aspergillus niger штамм ВКПМ F-719, подготовку его конидий и ферментацию проводят аналогично примеру 1, но готовят 58,1 мас.%-ную суспензию из 290,6 г ржаной муки, которую выдерживают в водопроводной воде в течение 12 часов при температуре 22°С, получая суспензию с содержанием углерода и азота в соотношении 16:1, и используют гидролизат с ДЕ, равным 43%. Концентрация ферментируемых сахаров 149,9 г/дм³ среды.

Пример 7 (по прототипу).

Подготовку конидий продуцента - гриба Aspergillus niger штамм ВКПМ F-501, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но используют для приготовления питательной среды суспензию из 140,0 г крахмала и 20 г кукурузной муки в нагретой до 40°С водопроводной воде с доведением объема до 500 см³ и нагреванием до 40-50°С, получая 32,0 мас.%-ную суспензию, введением препарата бактериальной α-амилазы в количестве, обеспечивающем ДЕ, равный 26%, внесением 25,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, обеспечивающем в среде соотношение углерода и азота 50:1. Концентрация ферментируемых сахаров 135,4 г/дм среды.

Технический результат в опытах, представленных в примерах 1-6 таблицы, по сравнению с прототипом заключается в увеличении конверсии сахаров в лимонную кислоту до (86,7-93,2)% и увеличении активности ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы соответственно до 4,5-6,2 единиц А.С/см³ и 160-180 единиц Гл.С/см³.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Патент РФ №2215036, публ. 2003 г.

2. Патент РФ №2266960, публ. 2005 г.

1. Патент РФ №975799, публ. 1982.

2. Патент СССР №1811697, публ. 1993.

3. Патент РФ №2088658, публ. 1997.

Способ предусматривает гидролиз крахмалсодержащего сырья, добавление к полученному гидролизату минеральные солей, ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger. Гидролиз осуществляют ферментным препаратом бактериальной α-амилазой при повышенной температуре и избыточном давлений. В качестве крахмалсодержащего сырья используют предварительно выдержанную в воде при 20-25°C в течение 10-12 ч рисовую муку в количестве 205,3-235,7 г и ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г. При этом в полученной суспензии рисовой муки обеспечивают содержание углерода и азота в соотношении (20,0-23,0):1, а в суспензии ржаной муки (14,0-16,0):1 соответственно. Ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-40%. Способ позволяет повысить выход α-амилазы и глюкоамилазы при сохранении высокого выхода лимонной кислоты. Конверсия сахаров в лимонную кислоту составляет 86,7-93,2%. Активность α-амилазы и глюкоамилазы составляет 4,5-6,2 единиц А.С/см³ и 160-180 единиц Гл.С/см³ соответственно. 1 табл.

Способ получения лимонной кислоты, α-амилазы и глюкоамилазы, включающий гидролиз крахмалсодержащего сырья ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала и последующую ферментацию среды грибом-кислотообразователем Aspergillus niger, отличающийся тем, что в качестве крахмалсодержащего сырья используют рисовую в количестве 205,3-235,7 г или ржаную муку в количестве 232,0-290,6 г, предварительно выдержанную в воде при температуре 20-25°С в течение 10-12 ч, обеспечивающем содержание в полученной суспензии рисовой муки углерода и азота в соотношении (20,0-23,0):1, а в суспензии ржаной муки (14,0-16,0):1 соответственно, ферментный препарат используют в количестве до достижения значения декстрозного эквивалента источника углерода 35-40%.