СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2002 года по МПК C12P7/48 C12N1/14 C12N9/14 C12N9/28 C12N9/30 C12N9/34 C12P7/48 C12R1/685 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения из крахмалосодержащего сырья лимонной кислоты и кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы.

Известен способ получения амилолитических ферментов культивированием гриба Aspergillus niger на различных крахмалосодержащих средах с выходом 0,64 ед./см³ α-амилазы и 15,7 ед./см³ глюкоамилазы [1].

Таким способом получают только кислотоустойчивые ферменты: α-амилазу и глюкоамилазу.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения лимонной кислоты на основе питательной среды, содержащей гидролизат крахмала и минеральные соли, включающий гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26-36 мас. % сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы, взятом в количестве 0,5-1,5 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, при выдерживании под избыточным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин, добавление минеральных солей макроэлементов и последующую ферментацию питательной среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger в течение 6 суток при температуре 32^oС. После ферментации биомассу инактивируют кипячением, отделяют культуральный раствор и определяют в нем конверсию сахаров в лимонную кислоту [2].

Таким способом получают лимонную кислоту, и можно предположить, что α-амилаза и глюкоамилаза образуются в небольшом количестве. Сведения об одновременном получении лимонной кислоты и кислотоустойчивых амилолитических ферментов отсутствуют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является культуральный раствор, содержащий лимонную кислоту и дополнительно кислотоустойчивые амилолитические ферменты: α-амилазу и глюкоамилазу.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается способом получения лимонной кислоты, включающем гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26-30 мас. % сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала, последующую ферментацию питательной среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger при температуре не выше 32^oC и отделение культурального раствора, в котором согласно изобретению используют бактериальную α-амилазу, взятую в количестве 1,5-2,0 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, добавляют к гидролизату крахмала дополнительно минеральные соли в виде сульфатов цинка, железа (II), меди в количестве (2,0-7,0)•10^-3 г/дм³, используют гриб - кислотообразователь Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 и после ферментации отделяют кислотосодержащий культуральный раствор, обладающий амилолитической и глюкоамилолитической активностью.

Сведения, подтверждающие возможность достижения технического результата предлагаемого изобретения, представлены в примерах.

В качестве исходного крахмалосодержащего сырья используют крахмальную суспензию с концентрацией сухих веществ 26-30 мас.%, приготовленную из сухого крахмала с содержанием 88 мас.% сухих веществ, а в качестве ферментного препарата бактериальной α-амилазы используют препарат, выпускаемый отечественной промышленностью под торговым названием "Амилосубтилин Г10Х" с активностью от 1000 до 2500 единиц амилолитической способности (А.С.) на 1 г препарата, в примерах использован препарат, имеющий активность α-амилазы 2000 ед. А. С. /г, в качестве продуцента целевых продуктов используют известный штамм гриба Aspergillus niger, который до сих пор применяли для биоконверсии свекловичной мелассы в лимонную кислоту (штамм ВКПМ F-171) [3].

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1
а) Подготовка конидий продуцента
Конидии гриба - продуцента Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 взвешивают в стерильную пробирку в расчете 250 мг на 100 см³, помещают в среду следующего состава, г/дм³:
Сахар-песок - 50
Дигидрофосфат калия - 0,16
Нитрат аммония - 2,5
Сульфат магния гептагидрат - 0,25
Суспензию конидий в колбе ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают 5-6 часов при температуре 32^oС.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия
11,9 г сухого крахмала растворяют в нагретой до 50^oС водопроводной воде, доводят объем до 200 см³, получая 5,25 мас.%-ную крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала).

При интенсивном перемешивании нагревают крахмальную суспензию до 58-60^oС и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 0,39 см³, которое соответствует 0,075 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала или 1,5 ед. А.С./г сухого вещества крахмала, при постоянном перемешивании доводят температуру до 82-85^oС. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22^oС и доводят объем до 200 см³.

Затем гидролизат крахмала выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата магния гептогидрата концентрации 10 мас. % и 0,32 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас.%.

в) Приготовление питательной среды для ферментации
150 г сухого крахмала растворяют в водопроводной воде, нагретой до 50^oС, доводят объем до 500 см³, получая 26,4 мас.%-ную крахмальную суспензию (в расчете на сухое вещество крахмала), которую нагревают при интенсивном перемешивании до 58-60^oС и вводят 2 мас.%-ный раствор ферментного препарата бактериальной α-амилазы в количестве 4,9 см³, что соответствует 0,1 мас.% препарата к массе сухого вещества крахмала, что соответствует 1,5 ед. А.С./г сухого вещества крахмала, при постоянном перемешивании доводят температуру до 82-85^oС и выдерживают при этой температуре 90 мин. Для прекращения действия ферментного препарата гидролизат нагревают до кипения, охлаждают до 20-22^oС, доводят объем до 500 см³.

Затем гидролизат выдерживают при избыточном давлении 0,1 МПа в течение 30 мин, охлаждают до 45-50^oС и стерильно вносят 12,5 см³ раствора нитрата аммония концентрации 10 мас.%, 1,25 см³ раствора сульфата магния гептагидрата концентрации 10 мас.%, 0,8 см³ раствора дигидрофосфата калия концентрации 10 мас. %, 0,5 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас. %, 0,2 см³ раствора сульфата железа гептагидрата концентрации 0,5 мас. %, 0,7 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 мас.% и стерильно разбавляют водой до концентрации ферментируемых сахаров 150-155 г/дм³.

г) Выращивание посевного мицелия
В колбы емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают 10 см³ суспензии конидий. Колбу ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 48 часов при температуре 32^oС.

д) Ферментация питательной среды на основе гидролизата крахмала в лимонную кислоту
В колбы емкостью 750 см³ помещают 50 см³ питательной среды и засевают ее 10 см³ подрощенного мицелия. Колбы ставят на качалку с числом оборотов 160 мин^-1 и выдерживают в течение 6 сут при температуре 32^oС. После ферментации биомассу гриба отделяют на воронке Бюхнера и в культуральном растворе определяют активность кислотоустойчивых ферментов и конверсию сахаров в лимонную кислоту.

Пример 2
а) Подготовку конидий продуцента Aspergillus niger, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды проводят аналогично примеру 1.

б) Приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но увеличивают дозу ферментного препарата бактериальной α-амилазы до 2,0 ед. А.С./г сухого крахмала и в питательную среду для ферментации вводят 0,2 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, 0,7 см³ раствора сульфата железа гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, 0,5 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 мас.%.

Пример 3
Подготовку конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды, приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия и приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 2, но в питательную среду для ферментации, приготовленную из 170,8 г сухого крахмала в виде 30 мас.% крахмальной суспензии, вводят 0,7 см³ раствора сульфата цинка гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, 0,4 см³ раствора сульфата железа гептагидрата концентрации 0,5 мас.%, 0,2 см³ раствора сульфата меди пентагидрата концентрации 0,5 мас.%.

Пример 4
Подготовку конидий продуцента гриба Aspergillus niger штамма ВКПМ F-171, выращивание посевного мицелия, приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия, приготовление питательной среды для ферментации проводят аналогично примеру 1, но без добавления сульфатов цинка, железа, меди. После ферментации, как в примере 1, биомассу гриба отделяют и в культуральном растворе определяют активность кислотоустойчивых амилолитических ферментов и конверсию сахаров в лимонную кислоту.

Пример 5 (по прототипу)
Подготовку конидий продуцента гриба Aspergillus niger штамма ВКПМ F-171, приготовление питательной среды для выращивания посевного мицелия, приготовление питательной среды для ферментации, выращивание посевного мицелия, ферментацию питательной среды на основе гидролизата крахмала в лимонную кислоту проводят аналогично примеру 4.

После ферментации биомассу инактивируют кипячением, отделяют культуральный раствор. Затем определяют показатели качества культурального раствора.

Данные примеры представлены в таблице.

Сравнение представленных в таблице результатов примеров 1-4 (по предлагаемому изобретению) и примера 5 (по прототипу) показывает, что способом получения лимонной кислоты по предлагаемому изобретению в отличие от способа по прототипу получен культуральный раствор, который содержит лимонную кислоту и обладает амилолитической активностью.

Результат примера 4, в котором ферментация проведена без добавления к гидролизату крахмала дополнительно минеральных солей в виде сульфатов цинка, железа (II), меди, показывает, что после ферментации и отделения биомассы гриба получен культуральный раствор, который содержит лимонную кислоту 84,6% и кислотоустойчивые амилолитические ферменты, активность которых меньше, чем в примерах 1-3, в которых использованы дополнительно добавки названных минеральных солей.

В примере 5, проведенном в условиях по прототипу - с инактивацией биомассы - получен культуральный раствор, который содержит лимонную кислоту 85,0%, но не обладает амилолитической активностью.

Таким образом, по предлагаемому изобретению получен технический результат - культуральный раствор, в котором содержится лимонная кислота и дополнительно кислотоустойчивые амилолитические ферменты: α-амилазы и глюкоамилазы, причем конверсия сахаров в лимонную кислоту составляет 84,9-88,5%, амилолитическая активность кислотоустойчивых α-амилазы и глюкоамилазы составляет соответственно, ед. А.С./см³: 0,62-0,69 и 22,5-28,6.

Источники информации
1. Тохадзе З.В., Квачадзе Л,П., Квеситадзе Г.И. Влияние состава питательной среды на биосинтез кислотоустойчивой α-амилазы различными видами Aspergillus. Прикладная биохимия и микробиология. - М., 1975. - 4. - с. 515-518.

2. Патент РФ 2132384, МПК 6 С 12 Р 7/48, С 12 N 1/14, 1999.

3. Патент РФ 975799, МКИ 3 С 12 N 15/00, 1982.

Способ получения лимонной кислоты включает гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26-30 мас.% сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы, взятым в количестве 1,5-2,0 единиц амилолитической способности (А.С.) на 1 кг сухого вещества крахмала, при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление к гидролизату крахмала минеральных солей в виде сульфатов цинка, железа (II), меди в количестве (2,0-7,0)•10^-3 г/дм³ гидролизата крахмала, последующую ферментацию питательной среды грибом Aspergillus niger. После ферментации и отделения биомассы гриба получают культуральный раствор, содержащий 84,9-88,5 мас.% лимонной кислоты и кислотоустойчивые ферменты: α-амилазу и глюкоамилазу. Способ позволяет получить культуральный раствор, который имеет повышенную амилолитическую активность кислотоустойчивых ферментов: α-амилазы и глюкоамилазы соответственно, ед. А.С. /см³: 0,62-0,69 и 22,5-28,6. 1 табл.

Способ получения лимонной кислоты, включающий гидролиз крахмальной суспензии, содержащей 26 - 30 мас.% сухих веществ, ферментным препаратом бактериальной α-амилазы при повышенной температуре и избыточном давлении, добавление минеральных солей к гидролизату крахмала, последующую ферментацию питательной среды грибом - кислотообразователем Aspergillus niger при температуре не выше 32^oС и отделение культурального раствора, отличающийся тем, что используют бактериальную α-амилазу, взятую в количестве 1,5 - 2,0 единиц амилолитической способности на 1 г сухого вещества крахмала, добавляют к гидролизату крахмала дополнительно минеральные соли в виде сульфатов цинка, железа (II), меди в количестве (2,0-7,0)•10^-3 г/дм³, используют гриб - кислотообразователь Aspergillus niger штамм ВКПМ F-171 и после ферментации отделяют кислотосодержащий культуральный раствор, дополнительно обладающий амилолитической и глюкоамилолитической активностью.