2-МЕТИЛСУЛЬФАНИЛ-6-НИТРО-7-ОКСО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[5,1-c] [1,2,4]ТРИАЗИНИД L-АРГИНИНИЯ ДИГИДРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА Российский патент 2014 года по МПК C07D487/04 A61K31/4196 A61P29/00 

Заявляемое изобретение относится к области биологически активных соединений и касается 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинида L-аргининия дигидрата, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики вирусных заболеваний человека и животных, преимущественно Лихорадки Западного Нила, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, научно-исследовательских лабораториях, лечебных учреждениях, а также ветеринарии.

Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой эффективностью и устойчивостью при мутациях вирусов, продолжительным действием, низкой токсичностью и отсутствием побочных эффектов при лечении. В связи с этим, важным фактором является возможность получения синтетических лекарственных препаратов, а также создание доступной технологии их получения.

В настоящее время заболеваемость лихорадкой Западного Нила (далее - ЛЗН) в мире и, в частности, на территории Российской Федерации продолжает увеличиваться.

За 10 месяцев 2012 года в странах Европейского Союза, Российской Федерации и на территории сопредельных государств зарегистрировано 923 случая заболевания ЛЗН, в том числе: в Греции - 161, Венгрии - 17, Италии - 50, Румынии - 14, Алжире - 1, Хорватии - 5, Республике Македония - 6, Израиле - 83, Косово - 4, Черногории - 1, Российской Федерации - 447, территории Палестинской автономии - 2, Сербии - 69, Тунисе - 63 (см. www.edc.europa.eu/en/healthtopics/west_nile_fever/West-Nile-fever-maps/Pages/2012-table.aspx).

По данным Центра по контролю и предотвращению заболеваний США только за сентябрь-октябрь в 2012 году в США в 48 штатах зарегистрировано 5674 случаев заболевания ЛЗН, в т.ч. 2969 нейроинвазивных случаев (что составляет 51%), при этом 3491 (62,0%) человек были госпитализированы, из них 286 случаев (5,0%) закончились летальным исходом (см. West Nile virus and other Arboviral diseases - United States, 2012 // Morbidity and Mortality Weekly Report. - 2013. - 62(25); 513-517).

Эпидемический процесс ЛЗН имеет ряд особенностей, как в эпидемиологических, так и клинических аспектах: раннее начало и позднее окончание эпидсезона, выраженная сезонность заболевания; различия в клинических проявлениях и структуре заболеваемости, определяемой количеством заболевших, их возрастом, территорией, на которой зафиксировано заболевание и т.д., при этом на территориях «старых» и «новых» очагов наблюдается увеличение доли заболевших ЛЗН сельских жителей, значительное увеличение доли заболевших возрастной категории 20-29 лет (хотя доминирующей группой, по-прежнему, остается возрастная категория «60 лет и старше»), появление новых клинических проявлений инфекции, а именно изменение структуры мест заражения ЛЗН - значительное увеличение группы населения, заразившейся при выезде в места отдыха на природу как на территории Российской Федерации, так и зарубежных стран (см. Информационное письмо Главного санитарного врача РФ Г.Г. Онищенко от 22.02.2013 г. №01/1990-13-32 "Прогноз эпидемиологической ситуации по Лихорадке Западного Нила на 2013 год").

Расширение ареала распространения ЛЗН и увеличение заболеваемости подталкивает исследователей и разработчиков к поиску и производству эффективных неспецифических противовирусных препаратов в отношении данной инфекции. Однако попытки изучения эффективности отдельных соединений in vitro и in vivo (см. Odelola H.A. Antiviral activity of Virazole on replication of viruses isoleted in Nigeria. In: Siegenthaler W., Lathy R. editors. Current chemotherapy. Vol.1. Washington: American Society of Microbiology. - 1978. - Vol.1. - P.3343-3345; Jordan I., Briese Т., Fisher N. et al. Ribavirin inhibits West Nile virus replication and cytopathic effect in neural cells // J. Infect. Dis. - 2000. - Vol.182. - P.1214-1217. Shahar A., Lustig S., Akov Y. et al. Different pathogenicity of encephalitic togaviruses in organotypic cultures of spinal cord slices // J. Neurosci. Res. - 1990. - Vol.25. - P.345-352. Anderson J.F., J.J. Rahal. Efficacy of interferon alpha-2b and ribavirin against West Nile virus in vitro // Emerg. Inf. Dis. - 2002. - Vol.8, n.1. - P.107-108; Логинова С.Я., Ковальчук А.В., Борисевич С.В. и др.; Противовирусная эффективность индуктора интерферона амиксина в отношении экспериментальной формы Лихорадки Западного Нила // Вопр. вирусол. - 2004. - №2. - С.14-17; Логинова С.Я., Борисевич С.В., Пащенко Ю.И., Бондарев В.П. Профилактика и терапия экспериментальной формы Лихорадки Западного Нила // Антибиот. и химиотер. - 2009. - Том. 54, №№11-12. - С.17-20, Логинова С.Я., Борисевич С.В., Максимов В.А., Бондарев В.П. Оценка токсичности неспецифических медицинских противовирусных средств, предназначенных для профилактики и лечения опасных и особо опасных вирусных инфекций // Антибиот. и химиотер. - 2009. - Том. 54, №№3-4. - С.11-14.), так и не привели к их применению при лечении ЛЗН.

С учетом изложенного, поиск и разработка новых эффективных средств, предназначенных для профилактики и лечения ЛЗН, являются актуальными.

В широком кругу синтетических лекарственных средств, проявляющих противовирусное действие, значительное место занимают азолоазины, содержащие в структуре молекулы мостиковый атом азота.

Из уровня техники известны тиадиазолотриазины, проявляющие активность в отношении вируса гепатита В, вируса Коксаки (см. A.M. Демченко, В.В. Кислый, З.Б. Квачева, М.О. Лозинський. Синтез и противовирусная активность производных [1,3,4]тиадиазоло[2,3-с][1,2,4]триазина. Журнал органичной та фармацевтичной химии, 2003, т.1, вып.1-2, стр.55-58; М.А. El-Badawi, A.A. El-Barbary, Y.M. Lokshaa, Mai El-Daly. Synthesis and biological evaluation of some novel N,N'-bis-(1,2,4-Triazin-4-yl)dicarboxylic acid amides and some fused rings with 1,2,4-triazine ring. Phosph., Sulfur, Silicon and Related Elements, 2002, V.177, pp.587-596).

Противовирусной активностью в отношении герпеса обладают пиразоло[5,1-с][1,2,4]триазины (G. Bravi, A. Goretti Cheasty, J.A. Corfield, R.M. Grimes. 4-Carboxy pyrazole derivates as antiviral agents. WO 2007039146; F.A. Attaby, A.H. Elghandour, М.А. Ali, Y.M. Ibrahem. Synthesis, reactions, and antiviral activity of 1-(1h-pyrazolo[3,4-b]pyridin-5-yl)ethanone and pyrido[2',3':3,4]pyrazolo[5,1-c][1,2,4]triazine derivatives. Phosph., Sulfur, Silicon and Related Elements, 2006, v.181, №5, pp.1087-1102).

Противовирусным действием в отношении гриппа и герпеса обладают триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазины (V.A. Plastunov, M.M. Kozlovs'kii, L.V. Benzel, G.V. Bilets'ka, I.M. Lozins'kii,; E.G. Rogochii, Sholomei, M.D. L'viv. NDI Epidemiol. ta Gigieni. Mikrobiologichnii Zhurnal. 2001, 63, №2, 14-19; В.Л. Русинов, Е.Н. Уломский, О.Н. Чупахин, M.M. Зубаиров, А.Б. Капустин, Н.И. Митин и др. Синтез и противовирусная активность 6-нитро-7-оксо-4,7-дигидроазоло[5,1-с][1,2,4]триазинов. Химико-фармацевтический журнал. 1990, №9, с.41-44).

Анализ известных технических решений показал, что аналоги 1,2,4-триазоло[1,5-а]триазинов-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидины являются перспективным направлением поиска новых противовирусных соединений.

Наиболее близким по структуре и проявляемой противовирусной активности к заявляемому соединению (прототипом) является натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-(4Н)-она, имеющая формулу

(см. патент РФ №2294936 на изобретение «Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающая противовирусной активностью», дата подачи 29.06.2005 г., опубликовано 10.03.2007 г.).

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является создание нового эффективного средства азолоазинового ряда, обладающего противовирусной активностью в отношении группы РНК-содержащих вирусов, и снижение зависимости активного соединения от клеточного метаболизма.

Указанный технический результат достигается тем, что создано новое лекарственное средство 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат, обладающее противовирусным действием и имеющее формулу

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-c][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат, включающий смешивание растворенного в воде аргинина и растворенного в водно-этанольной смеси (1:1) 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-1,2,4 триазоло[5,1-с]триазинида натрия дигидрата, после чего полученную смесь кипятят на водяной бане, затем охлаждают, выпавший осадок отфильтровывают и сушат.

Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».

Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «изобретательский уровень».

Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примерах конкретного применения.

Техническая задача решена путем модификации молекулы натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-[5,1-c]-1,2,4-триазин-7-(4Н)-она, в частности, заменой катиона натрия биогенным аминокислотным аргининиевым фрагментом.

Синтез 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-c][1,2,4]триазинида-аргининия дигидрата осуществляют следующим образом:

В круглодонную колбу объемом 50 мл, снабженную нагревательной баней, мешалкой и обратным шариковым холодильником с водяным охлаждением, загружают 2,1 г (0,01 моль) аргинина, добавляют 9 мл воды и при комнатной температуре при перемешивании доводят смесь до полного растворения. Далее в другую круглодонную колбу объемом 50 мл, снабженную нагревательной баней, мешалкой и обратным шариковым холодильником с водяным охлаждением, загружают 2,53 г (0,01) моль 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с]триазинида натрия дигидрата, добавляют 20 мл водно-этанольной смеси (1:1) и при нагревании до температуры 20-25°С смесь доводят до растворения.

Полученные растворы сливают друг с другом и кипятят на водяной бане в течение 10 минут при температуре 90-95°С. Реакционную массу охлаждают, отфильтровывают выпавший осадок, который затем сушат при комнатной температуре в течение суток (24 часа).

Полученное соединение 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат имеет следующие физико-химические характеристики: Т_ПЛ>300°С; Найдено С - 30,30%, Н - 4,86%, N - 32,08%. Брутто-формула - C₁₁H₁₈N₁₀O₅S*2H₂O. Вычислено: С - 30,14%, Н - 5,06%, N - 31,95%. Спектр ¹H ЯМР (400 МГц, D₂O), δ (м.д): 1.702 (м, 2Н, СН₂), 1.918 (м, 2Н, СН₂), 2.651 (с., 3H, SCH₃), 3.245 (м., 2Н, CH₂), 3.786 (м, 1Н, СН).

Заявленное соединение представляет собой желтое аморфное вещество, растворимое в воде, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и нерастворимое в хлороформе, этаноле, бензоле.

Осуществление заявляемого изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1

Оценка цитотоксичности исследуемого соединения с использованием постоянной культуры клеток GMK-AH (1Д).

Для формирования сплошного монослоя в пробирки вносили по 1 мл суспензии клеток с плотностью 200 тыс./мл, инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С, 5% CO₂. Затем ростовую среду удаляли и вносили свежую питательную среду, содержащую различные концентрации исследуемого препарата (от 1000 до 6,25 мкг/мл). Затем пробирки инкубировали в течение 5 суток при температуре (37,0±0,5)°С, 5% CO₂. Используя световой микроскоп, наблюдали за состоянием монослоя клеток: частичная или полная деструкция монослоя клеток, повреждение отдельных клеток, образование клеточного синцития. Контрольными образцами являлись пробирки с монослоем, в которые была внесена поддерживающая среда без препарата.

Результаты оценки цитотоксичности исследуемого соединения свидетельствуют, что субстанция активного вещества в концентрации 500 мкг/мл не вызывает видимых изменений в культуре клеток (см. таблицу №1).

Таблица 1 Изучение цитотоксичности заявляемого соединения в культуре клеток GMK-AH (1Д) Препарат Частота цитопатического эффекта при применении заявляемого соединения в концентрации, мкг/мл ЦПД50, мкг/мл МПК, мкг/мл 1/2 МПК, мкг/мл 1000,0 500,0 250,0 125,0 62,5 31,3 15,5 7,8 Заявляемое соединение 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1000,0 500,0 250,0

Пример 2

Изучение эффективности субстанции в отношении вируса Западного Нила в культуре клеток GMK-AH (1Д).

Монослой культуры клеток GMK-AH (1Д) инфицировали вирусом Западного Нила в дозе 0,05 БОЕ/клетку. Адсорбцию вируса проводили при температуре 37°С, 5% CO₂, в течение 60 мин. По окончании инкубирования монослой трижды промывали поддерживающей средой, содержащей по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, для удаления не адсорбировавшегося вируса и вносили исследуемые соединения в концентрации, составляющей 1/2 МПК. Субстанцию растворяли в поддерживающей питательной среде до нужной концентрации. На каждое соединение использовали не менее 10 пробирок с монослоем клеток. Инкубирование проводили при температуре 37°С, 5% CO₂, в течение 48 часов. Далее проводили криодеструкцию клеток и объединяли пробы. Инфекционный титр в объединенных пробах определяли титрованием методом формирования негативных колоний под агаровым покрытием в культуре клеток GMK-AH (1Д).

Результаты изучения противовирусной активности заявленного соединения свидетельствуют о том, что препарат подавляет репродукцию вируса 3H на 2,31g, при этом коэффициент ингибирования составил 99,5% (см. таблицу №2).

Таблица 2 Изучение эффективности заявляемого соединения в культуре клеток GMK-AH (1Д) в отношении вируса Западного Нила Препарат Концентрация заявляемого соединения, мкг/мл Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл Снижение уровня накопления вируса, lg БОЕ/мл Коэффициент ингибирования репродукции вируса, процент Заявляемое соединение 250,0 4,2 2,3 99,5 К дозы - 7,8 - -

Таким образом, заявляемое химическое соединение не токсично в используемых концентрациях, обладает значимой противовирусной активностью in vitro в отношении вируса Западного Нила.

Описывается новое биологически активное соединение 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат формулы

обладающее противовирусным действием, способ его получения и применение для профилактики и лечения Лихорадки Западного Нила. 3 н.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. 2-Метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат, обладающий противовирусным действием и имеющий формулу

2. Способ получения 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат по п.1, включающий смешивание растворенного в воде аргинина и растворенного в водно-этанольной смеси (1:1) 2-метилтио-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-с]триазинида натрия дигидрата, после чего полученную смесь кипятят, затем охлаждают, выпавший осадок отфильтровывают и сушат.

3. Применение 2-метилсульфанил-6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[5,1-c][1,2,4]триазинид L-аргининия дигидрат по п.1 для профилактики и лечения Лихорадки Западного Нила.