СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/573 C12Q1/26 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам исследования грибов, и может быть использовано для определения активности фермента лакказы мицелия базидиальных грибов при селекционном процессе.

Известен способ определения активности лакказы гриба Pleurotus ostreatus, включающий инокуляцию мицелиальной культуры гриба на жидкую питательную среду, культивирование на качалке глубинным методом в течение 14 суток, отфильтровывание культуральной жидкости, смешивание ее с дихлорфенолиндофенолом и спектрофотометрирование на 605 нм (Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ячкова С.Н. и др. Разложение лигноуглеводного субстрата почвенными грибами - продуцентами лакказы и целлобиозодегидрогеназы //Прикладная биохимия и микробиология, 2004, том 40, №1. с.51-56).

Недостатками данного способа являются его значительная трудоемкость и технологическая сложность выполнения данного способа, большой период культивирования мицелиальной культуры и большие объемы сред для культивирования, что увеличивает продолжительность выполнения анализа и материальные затраты.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов, на агар - солодовую питательную среду, содержащую α-нафтол, инкубирование инокулированных чашек до образования окрашенных цветных пятен (Методы экспериментальной микологии. Справочник / под ред. В.И.Билай/ - Киев: Наукова думка, 1982. с.176).

Однако указанный способ не предусматривает возможности изучения динамики образования фермента мицелием базидиальных грибов в процессе роста.

Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение технологического процесса определения активности лакказы базидиальных грибов, изучение свойств грибов на питательной среде с естественным источником углерода, сокращение продолжительности анализа и материальных затрат на реактивы и труд.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности лакказы базидиальных грибов, включающем инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и α-нафтол, инкубирование, оценку результатов, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество α-нафтол составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам, появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.

Новизна заявленного изобретения обусловлена введением в питательную среду целлюлозы в качестве источника углерода, что дает возможность исследовать активность лакказы базидиальных грибов на естественном источнике углерода, установлением оптимальной концентрации α-нафтола, определение активности лакказы путем измерения линейных размеров и интенсивности окрашенных зон питательной среды денситометрически, инкубация проводится в течение 3 суток, а не 14 как в известных способах.

Сущность изобретения поясняется фотографией, где представлены окрашенные зоны в зависимости от активности лакказы.

Пример конкретного осуществления способа определения активности лакказы базидиальных грибов.

Мицелий изучаемого штамма гриба Pleurotus ostreatus инокулируют на агаризованную питательную среду следующего состава: в качестве источника углерода целлюлоза (измельченная фильтровальная бумага) - 5 г/л, минеральные соли, например (NH₄)₂SO₄ - 4 г/л, КН₂PO₄ - 0,5 г/л, MgSO₄·7Н₂O - 0.3 г/л и α-нафтол в концентрации 0,08-0,12 г/л. Данная концентрация α-нафтола является оптимальной, что было установлено экспериментально. При увеличении концентрации происходит гибель мицелия, а при уменьшении концентрации образования цветных пятен на питательной среде не происходит. Также в питательную среду входит затвердитель - агар - 15 г/л. рН среды 5,5-6,0.

Инкубацию проводили в темноте в термостате при 25°С в течение трех суток. Оценку проводили на четвертые сутки, измеряя диаметр образовавшихся окрашенных зон на питательной среде и определяя интенсивность их окрашивания денситометрически. В течение трех суток мицелиальная колония разрасталась в радиальном направлении, образовывая окрашенные радиальные зоны. Среда под воздействием фермента лакказы, выделяемой грибом Pleurotus ostreatus, окрашивается в фиолетовый цвет (фото). Определение интенсивности окраски образующихся зон на питательной среде проводили денситометрически: получение изображения реверзума чашки Петри сканирующим цифровым устройством с последующей обработкой в программе Сорбфил Денситометр 1.4 на компьютере.

Использование предлагаемого изобретения позволяет снизить затраты труда и времени на проведение анализов по определению активности лакказы у базидиальных грибов, уменьшить расход реактивов, не требуется использования дорогостоящего оборудования, возможно проведение массового анализа. Но при этом сохраняется эффективность способа как и у известных способов определения лакказной активности базидиальных грибов: выявляются четкие различия в активности мицелиальных изолятов, сохраняется высокая воспроизводимость опыт, результаты представляются в численном выражении, кроме того, изучение возможно проводить в условиях, максимально приближенных к естественным. Эффективность способа иллюстрируется результатами исследований, представленными в таблице определения активности лакказы мицелия штаммов вешенки обыкновенной НК-35 и Львовский, а также монокариотических изолятов, полученных из них (см. таблицу)

Таблица.
Зависимость активности лакказы от генотипа монокариотических изолятов гриба Pleurotus ostreatus (Вешенка обыкновенная)№ изолятаДиаметр окрашенной зоны, ммРезультат денситомет рирования№ изолятаДиаметр окрашенной зоны, ммРезультат денситомет рированияДикариотический НК-35 (St)20,74370543Дикариотический Львовский (St)305270763НК-215,7⁺2310056Л125⁺4453264НК-513,3⁺2290861Л224,3⁺4207093НК-622,3^×4500879Л318,33179526НК-716,7⁺2468478Л424,3⁺4329865НК-816,3⁺2156869Л719,7⁺3432568НК-922,3^×4370849Л822,3⁺4423568НК-1010⁺1115235Л1130^×5354367НК-1520,7^×4345274Л125⁺1013256НК-1621^×4263487Л1425,7⁺4586954НК-1725^*4643254Л1927^×5234876НК-186,7⁺1145897Л2016⁺2514446НК-2113⁺2547823Л2513,3⁺2265387НК-2320^×4210005Л2628,7^×5620788НК-2424,7^*4573256Л279,3⁺1130650НК-2513,3⁺2410574Л2817⁺2795684НК-2623,3^×4519058Л3020⁺4035698НК-2710,5⁺1253678Л3416,7⁺2510364НК-2827,7^*5348421Л3521,3⁺4270567НК-2918,7^×3156354Л3622⁺4328697НК-309⁺1232265Л3810⁺1352468НК-3117⁺2970345Л3919,7⁺4132564НК-3224,7^*4310250Л4917⁺2863547НСР₀₅3,6 -3,6 Обозначения: ^× - на уровне стандарта; ^* - достоверно превышает стандарт; ⁺ - достоверно меньше стандарта.

В качестве стандарта (St) для осуществления способа определения активности фермента лакказы базидиальных грибов можно использовать любой ди- или монокариотический мицелий, сравнение с которым проводят. В нашем примере в качестве стандарта использовали два дикариотических мицелия штаммов НК-35 и Львовский, которые являются родительскими для исследуемых в примере монокариотических изолятов.

Использование данного способа определения активности лакказы базидиальных грибов на твердой агаризованной среде, содержащей целлюлозу, позволяет определять активность фермента лакказы живой мицелиальной культуры гриба в процессе роста и развития на питательной среде с естественным источником углерода. Сокращает продолжительность процесса, снижает материальные затраты и затраты труда.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способам исследования грибов, и может быть использовано для определения активности фермента лакказы мицелия базидиальных грибов при селекционном процессе. Способ включает инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду. Питательная среда содержит целлюлозу, минеральные соли и α-нафтол в количестве 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят трое суток и оценку активности проводят по линейным размерам появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически. Способ позволяет упростить технологический процесс, сократить продолжительность анализа и затраты на реактивы и труд. 1 ил., 1 табл.

Способ определения активности лакказы базидиальных грибов, включающий инокуляцию мицелия базидиальных грибов на питательную среду, содержащую растительный источник углерода, агар и α-нафтол, инкубирование, оценку результатов, отличающийся тем, что в качестве растительного источника углерода используют целлюлозу, питательная среда дополнительно содержит минеральные соли, количество α-нафтола составляет 0,08-0,12 г/л, инкубирование проводят в течение трех суток и оценку активности проводят по линейным размерам появившихся на питательной среде окрашенных зон и интенсивности их окраски денситометрически.