Способ определения повреждения мембран эритроцитов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и биохимии, в частности к способам оценки повреждения мембран эритроцитов.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа за счет использования препарата мембран эритроцитов, обработанного эргокаль- циферолом и Fe

Пример 1.Берут 5 мл венозной крови и вьщеляют из нее эритроциты, при этом в качестве антикоагулянта используют гепарин (2000 еДо/мл), для этого кровь центрифугируют при 300 g в течение 10 мин, плазму и верхний слой эритроцитов, содержащий .лейкоциты, удаляют. Затем производят трехкратную отмывку, добавляя четырехкратный объем охлажденного физиологического раствора, каждый раз осаждая клетки центрифугированием

при 300 g в течение 10 мин и удаляя надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов.

Мембраны эритроцитов выделяют путем гипоосмотического гемолиза, при этом в качестве гемолизирующей среды берут 5 мМ , содержащую 1 мМ ЭДТА. Один миллилитр осажденных эритроцитов быстро и энергично перемешивают с 20 мл охлажденной до гемолияирующей среды и выдерживают при этой температуре, периодически помешивая, 40 мин. Гемолизат центрифугируют при 20000 g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок мембран эритроцитов трехкратно промывают 20 объемами 10 мМ трис-НС1-буфера (рН 7,4, при 20°С), каждый раз осаждая мембраны центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Осадок мембран зритСЛ

N5

;о

г

роцитов переносят в мерные центрифужные пробирки и доводят 10 мМ трис- НС1-буфером рН 7,Д объем до 1,0 мл Полученную суспензию мембран эритроцитов обрабатывают ультразвуком при частоте 44 кгц с выходной электрической мощностью генератора в рабочем диапазоне частоты на активной нагрузке 360 Вт, К 0,2 МП обработанной ультразвуком суспензии мембран эритроцитов добавляют 0,5 мл 0,5%-ного спиртового раствора эргокапьдиферола (конечная концентрация 0,08%), доводя объем инкубационной смеси до 4 мл 10 мМ трис-НС1-буфером (рН 7,4), и инкубируют при 37°С 60 мин. Затем добавляют в инкубационную смесь 1 мл водного раствора сульфата двухвалентного железа (PeSO)при конечной кон- цснтрации его в кювете на 5 мл равной 5 10 М, и на хемилюминометре, работающем в режиме счета фотонов, регистрируют светосумму инициированной ионами двухвалентного железа быстрой вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси при 37°Со Зарегистрированная светосумма отражает интенсивность свободнорадикапьных процессов, соответствующую уровню со- держания гидроперекисей липидов, увеличение концентрации которых и указывает на повреждение мембран эритроцитов ,

Существенно, что мембраны эритроцитов без раствора эргокальциферола не дают быстрой вспышки хемилюминесценции на введение ионов железа,,

При обследовании мембран эритроцитов практически здоровых людей (50 человек) выявлено, что светосумма быстрой вспьшки хемилюминесценции составляет 6200t80 0 имп,/минс При обследовании мембран эритроцитов больных с-различной патологией (70 человек) выявлено повышение светосуммы быстрой вспьппкй хемилюминесценции инкубационной смеси, содержащей мембраны эритроцитов, до 12000-17500 имп./мин. Следовательно, при уровне светосуммы быcJгpoй вспышки хемилюминесценции инкубационной смеси выше 7000 имп./мин судят о повреждении мембран эритроцитов.

.

П р и м е р 2„ Эритроциты получают, как описано в примере 1, Эритроциты смешивают с раствором дигитони- на при его конечной концентрации в инкубационной среде 2 мкг/мл; 10 мкг/мл и 20 мкг/мло Инкубационная смесь содержит 1 мл осадка эритроцитов; 8,98 мл физиологического раствора и 20 мкл плазмы крови, содержащей соответствующую концентрацию дигитонина. После 20-минутного выдерживания, смесь центрифугируют и полученный осадок обработанных дигито- нином эритроцитов, как и стандартный образец, используют для гипоосмоти- ческого гемолиза (как описано в примере 1) и последующего определения светосуммы быстрой вспьшки Fe -индуцированной хемилюминесценциио

Аналогичное исследование было проведено с использованием способа- прототипа.

При большем повреждении мембран эритроцитов наблюдается более значительное нарастание светосуммн их хемилюминесценции, измеренное по предлагаемому способу 7883 имп./мин 10982 имп./мин, 15117 имп,/мин , что подтверждает адекватность и достаточную чувствительность предпагаемого способа.

Формула изобретения

Способ определения повреждения мембран эритроцитов путем обработки эритроцитов химическими реагентами, индуцирующими хемилюминесценцию, с последующей регистрацией уровня хемилюминесценции, отличающий- с я , что, с целью повьппения чувствительности способа, мембраны эритроцитов обрабатывают ультразвуко и инкубируют в спиртовом растворе эргокальЦиферола при конечной концентрации последнего 0,06%, хемилю-. минесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа, затем регистрируют светосумму быстрой вспышки хемилюминесценции, а при этом наличие повреждения мембран определяют при уровне светосуммы вспышки вьппе 7000 имп,/мин.

Изобретение относится к медицине и биохимии и может быть использовано для определения повреждения мембран эритроцитов. Цель - повышение чувствительности способа. Мембраны эритроцитов, полученные гипоосмотическим шоком и обработанные ультразвуком, инкубируют с раствором эргокальциферола при 37°С 60 мин и проводят хемилюминесцентный анализ инкубационной смеси. Хемилюминесценцию индуцируют ионами двухвалентного железа. Регистрируют светосумму "быстрой" вспышки хемилюминесценции. При уровне светосуммы выше 700 имп/мин судят о повреждении мембран эритроцитов.