СПОСОБ ОЦЕНКИ УРОВНЯ СОРБЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ СОРБЕНТА Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/04 C12N5/00 

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных сорбентов (например, аппликационных, используемых для лечения ран), а именно к оценке уровня сорбционной активности сорбентов в отношении микробных токсинов.

Сущность способа сводится к тому, что в стационарных условиях питательной среды для культуры клеток проводится в течение 1 часа прединкубация сорбента и тест-штамма микроорганизма в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), после чего в течение следующего 1 часа проводят совместную инкубацию контрольной и опытной суспензий тест-микроорганизма с монослоем культуры клеток, затем уровень сорбции микробного токсина оценивается по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта.

Методы изучения уровня сорбционной активности (эффективности) сорбентов зависят от типа сорбента и предполагаемой области применения в медицине. Аппликационные сорбенты, как правило, используются для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных процессов в различных областях медицины. Изучение эффективности аппликационных сорбентов проводят в эксперименте на адекватных биологических моделях соответствующих заболеваний и патологических состояний. С этой целью используются различные виды лабораторных животных. Исследуемые показатели изучаются в динамике в течение длительного времени (2-4 недели) [1]: выживаемость, продолжительность жизни, скорость заживления ран, уменьшение активности протеолиза. При этом неселективные аппликационные сорбенты исследуются на влагопоглощение (по количеству впитываемой и удерживаемой влаги), атравматичность (по адгезии модельной раневой поверхности), сорбцию белков (по кинетике сорбции бычьего сывороточного альбумина, фибриногена, трипсина), сорбцию микроорганизмов (по сорбции и задержке роста золотистого стафилококка, синегнойной палочки, кишечной палочки на твердой питательной среде). Селективные и биоактивные аппликационные сорбенты исследуются на сорбцию токсических метаболитов, экофакторов (по изотерме и кинетике сорбции соответствующих токсикантов), на специфическую биологическую активность (гемостатическая, бактерицидная и др. - по проявлению регламентирующих свойств).

Особенность биологии патогенных бактерий свидетельствует о том, что способность вызывать инфекционные заболевания формировалась у них в направлении приобретения функций, позволяющих им проникать в организм хозяина, противостоять его защитным системам, а также вызывать нарушения деятельности физиологически важных систем. Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной стадии инфекционного процесса. К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные вещества (токсиканты), обусловливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной и возможную смерть хозяина [2].

К сожалению, вышеизложенные методы оценки специфической активности сорбентов часто не позволяют выявлять перспективные препараты, предназначенные для предупреждения и лечения инфекционно-воспалительных процессов.

Аналогами предлагаемого способа являются следующие методы.

Для аппликационных сорбентов сорбция белков изучается путем анализа кинетических кривых сорбции трипсина. Сорбция белков проводится из водных растворов в статическом режиме в течение 4-х часов, при этом остаточная концентрация белка определяется по методу Лоури. Способ имеет ряд существенных недостатков. Он предполагает использовать в качестве сорбирующего агента протеолитический фермент животного происхождения трипсин. Этот фермент не входит в патогенетическую цепь вышеназванных ферментов, от которых зависит развитие и глубина инфекционно-восстановительного процесса в тканях. Кроме того, методика занимает много времени, т.к. после 4-х часов экспозиции фермента с сорбентом определение остаточной концентрации белка занимает 6-7 часов. Кроме того, условия опыта очень далеки от условий макроорганизма.

Сорбция микроорганизмов из суспензии проводится с твердой питательной среды. Изучается динамика роста колоний. Для оценки сорбции микроорганизмов с поверхности твердой питательной среды используются суточные культуры E.coli и S.aureus в концентрациях соответственно 10³ и 10⁶ КОЕ/мл (по стандарту мутности Мак-Фарланда). По 0,5 и 0,05 мл суспензии соответствующих микробов высевается на чашки Петри с питательной средой (мясопептонный агар). Через 15 минут на поверхности агара плотно укладывается слой сорбента определенной площади или массы, увлажненный 0,9% раствором хлорида натрия. Через 30, 60 мин, 2, 4, 6, 12 и 24 часа сорбент удаляется. Чашки помещаются в термостат и инкубируются при 37°С в течение 24 часов. Затем проводится подсчет колоний в контроле и после аппликации сорбента и расчет сорбционной емкости материала, которая выражается в КОЕ на 1 см² и коэффициент сорбции (%). Способ имеет ряд существенных недостатков. Он длителен по времени (48 часов) и не отражает условий макроорганизма. Кроме того, он недостаточно стандартизован, его результаты зависят от штаммных различий и условий культивирования (рН среды, качества питательных сред и т.д.).

Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого способа является также способ оценки сорбции бактериальных липополисахаридов (эндотоксинов). Сорбция эндотоксинов изучается путем построения кинетических кривых в течение 3-х часов. Остаточная концентрация эндотоксина определяется через 1-180 минут по содержанию колитозы, отщепляющейся от молекулы липополисахарида (ЛПС) при гидролизе в присутствии серной кислоты [1]. Способ имеет ряд существенных недостатков. По времени он занимает 5-6 часов и не отражает условий макроорганизма. Самый главный недостаток состоит в том, что ЛПС не являются истинным токсином, до настоящего времени их патологическая функция еще полностью не выяснена. С одной стороны, их нельзя отнести безоговорочно к истинным токсинам, а с другой - они не укладываются полностью в группу факторов с антифагоцитарным действием [2].

Техническим результатом изобретения является повышение точности и скорости способа выявления уровня сорбции микробных токсинов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма.

Результат изобретения достигается за счет того, что проводят в течение 1 часа прединкубацию сорбента, тест-микроорганизма в присутствии или отсутствии токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), а уровень сорбционной активности оценивают по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно для оценки уровня сорбции микроорганизмов по степени уменьшения адгезии тест-микроорганизма в стерильную пробирку с 1,8 мл поддерживающей среды Игла добавляют 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Затем в пробирку помещают исследуемый сорбент (1 г или 1 см²).

Для оценки уровня сорбции токсиканта в стерильную пробирку с 1,8 мл токсиканта в требуемой концентрации (разведение на среде Игла) добавляют 0,2 мл суточной культуры тест-штамма в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Затем в пробирку помещают исследуемый сорбент (1 г или 1 см²).

Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляют и 1,8 мл оставшейся жидкости помещают в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем кожно-мышечных (ФКЭЧ) или легочных фибробластов (ФЛЭЧ) эмбриона человека, полученным по [3]. Пробирку инкубируют 1 час при 37°С, затем клетки монослоя отмывают от неприкрепившихся бактерий многократной сменой среды Игла, фиксируют 96° этиловым спиртом, окрашивают по Романовскому-Гимза и исследуют микроскопически, определяя степень инфицированности монослоя сравнительно с контролем. Интенсивность процесса адгезии оценивают по следующим показателям: 1) индекс адгезии (ИА) выражают средним числом бактериальных клеток на одной эукариотической клетке; 2) процент пораженных клеток монослоя (ПК%); 3) обсемененность 100 клеток монослоя - микробную нагрузку (МН) - определяют по формуле МН=ИА·ПК%. Процент сорбции микроба определяют по показателю микробной нагрузки относительно контроля, принимаемого за 100%. Процент сорбции токсиканта определяют по разнице между процентом сорбции смеси микроба с токсикантом и процентом сорбции микроба без токсиканта.

Пример 1. Определение сорбционной активности углеволокнистого сорбента (УВС) и хитозана (ХС) на тест-штамме S.aureus 209 и культуре клеток ФКЭЧ (КК). Среда для культивирования стафилококка - мясопептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла.

В стерильную пробирку с 1,8 мл среды Игла помещали исследуемый сорбент (1 см²) и 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляли и 1,8 мл оставшейся жидкости помещали в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирку инкубировали 1 час при 37°С, клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент сорбции микроба по сравнению с соответствующим контролем без сорбента по показателю микробной нагрузки (таблицы 1, 2).

Пример 2. Определение сорбционной активности углеволокнистого сорбента (УВС) и хитозана (ХС) на тест-штамме S.aureus 209 и культуре клеток ФКЭЧ (КК) в присутствии токсиканта - фермента коллагеназы - одного из основных факторов патогенности микроорганизмов. Среда для культивирования стафилококка - мясопептонный бульон, для культивирования фибробластов - питательная среда Игла. Тестировали три различные дозы коллагеназы 300, 600 и 900 КЕ в виде стандартного коммерческого препарата "Коллализин" (коллагеназа Clostridium histolyticum), разведенного на среде Игла до соответствующих концентраций.

В стерильную пробирку с 1,8 мл коллагеназы в соответствующей дозе помещали исследуемый сорбент (1 см²) и 0,2 мл суточной культуры S.aureus 209 в дозе 10⁸ КОЕ/мл. Через 1 час совместного инкубирования сорбент удаляли и 0,2 мл оставшейся жидкости помещали в пробирку Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ. Пробирку инкубировали 1 час при 37°С, клетки монослоя отмывали от неприкрепившихся микроорганизмов многократной сменой среды Игла, фиксировали 96° этиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимза и исследовали под микроскопом, определяя степень инфицированности монослоя и процент сорбции смеси микроба с коллагеназой по сравнению с соответствующими контролями без сорбента по показателю микробной нагрузки (таблицы 3, 4).

Процент сорбции токсиканта определяли по разнице между процентом сорбции смеси микроба с коллагеназой и процентом сорбции микроба без токсиканта по данным таблиц 1 и 2.

Таблица 1Уровень сорбции микроорганизма (патогенного стафилококка золотистого) в присутствии углеволокнистого сорбента (УВС)Тест-объектИА% ПКМН% сорбции микроба, Аконтроль:    ФКЭЧ + микроб620120-опыт:    микроб + УВС: (1 час), затем микроб + ФКЭЧ5189025

Таблица 2Уровень сорбции микроорганизма (патогенного стафилококка золотистого) в присутствии хитозана (ХС)Тест-объектИА% ПКМН% сорбции микроба, Вконтроль:    ФКЭЧ + микроб620120-опыт:    микроб + ХС: (1 час), затем микроб + ФКЭЧ5168033

Таблица 3Уровень сорбции токсиканта (бактериальной коллагеназы) в присутствии углеволокнистого сорбента (УВС)Тест-объектИА% ПКМН% сорбции смеси микроба и токсиканта, С% сорбции токсиканта, D=C-A1. контроли:     1.1. ФКЭЧ + микроб620120--1.2. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 3001220240--1.3. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 6001425350--1.4. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 9001830540--2. опыт:     2.1. микроб + УВС + коллагеназа 300 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 (1 час)71611253,328,32.2. микроб + УВС + коллагеназа 600 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 (1 час)102222037,112,12.3. микроб + УВС + коллагеназа 900 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 (1 час)152436033,38,3

Таблица 4Уровень сорбции токсиканта (бактериальной коллагеназы) в присутствии хитозана (ХС)Тест-объектИА% ПКМН% сорбции смеси микроба и токсиканта, Е% сорбции токсиканта, F=E-B1. контроли:     1.1. ФКЭЧ + микроб620120--1.2. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 3001220240--1.3. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 6001425350--1.4. ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 9001830540--2. опыт:     2.1. микроб + ХС + коллагеназа 300 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 300 (1 час)6148465,032,02.2. микроб + ХС + коллагеназа 600 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 600 (1 час)92018048,615,62.3. микроб + ХС + коллагеназа 900 (1 час), затем ФКЭЧ + микроб + коллагеназа 900 (1 час)132228647,014,0

Литература.

1. МУ МЗ Украины "Разработка и доклиническая оценка сорбентов медицинского назначения", Киев, 1992. С.21.

2. Езенчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977, с.215.

3. Грабовская К.Б., Тотолян А.А. Журн. Микробиол. - 1977. - №2. - С.32-36.

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, биологии при испытании различных сорбентов (например, аппликационных, используемых для лечения ран), а именно к оценке уровня сорбционной активности сорбентов в отношении микробных токсинов. Сущность способа сводится к тому, что в стационарных условиях питательной среды для культуры клеток проводится в течение 1 часа прединкубация сорбента и тест-штамма микроорганизма в присутствии (опыт) и в отсутствии (контроль) токсиканта (например, бактериальной коллагеназы), после чего в течение следующего 1 часа проводят совместную инкубацию контрольной и опытной суспензий тест-микроорганизма с монослоем культуры клеток. Уровень сорбции микробного токсина оценивается по разнице показателей адгезии тест-микроба к культуре клеток в опыте с токсикантом и в контроле без токсиканта. Способ обеспечивает повышение точности и скорости выявления уровня сорбции микробных токсинов за счет приближения условий оценки к условиям макроорганизма. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ оценки уровня сорбционной активности сорбента, отличающийся тем, что проводят предынкубацию сорбента с тест-микроорганизмом в присутствии (опыт) или отсутствии (контроль) токсиканта в течение 1 ч, далее сорбент удаляют, а полученные опытные и контрольные суспензии тест-микроорганизма инкубируют с монослоем культуры клеток, после инкубирования определяют степень адгезии тест-микроорганизма к культуре клеток и оценивают уровень сорбционной активности сорбента по уменьшению степени адгезии тест-микроорганизма в опыте по сравнению с контролем.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве токсиканта используют бактериальную коллагеназу.