СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ КЛОСТРИДИЙ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 C12Q1/02 

Изобретение относится к области медицины, медицинской токсикологии, микробиологии, а именно к оценке клинической значимости клостридий, особенно в условиях полимикробной инфекции.

Особенность биологии патогенных бактерий свидетельствует о том, что способность вызывать инфекционные заболевания формировалась у них в направлении приобретения функций, позволяющих им проникать в организм хозяина, противостоять его защитным системам, а также вызывать нарушения деятельности физиологически важных систем. Факторы патогенности с инвазивной функцией и функцией защиты от фагоцитоза можно объединить в одну группу факторов, обеспечивающих развитие начальной, часто клинически не выраженной, стадии инфекционного процесса.

К другой группе факторов патогенности можно отнести биологически активные вещества (токсиканты), обусловливающие синдром заболевания с выраженной клинической картиной и возможную смерть хозяина (Ю.В.Езепчук «Биомолекулярные основы патогенности бактерий» М., 1977, 214 с.).

К клостридиям, продуцирующим гистотоксические экзотоксины, кроме C. perfringens, относятся: С.novyi, С.septicum, С.hystoliticum, С.bifermentans и ряд других.

Наиболее тяжелой формой клостридиальных поражений тканей является газовая гангрена (мионекроз). Микроорганизмы продуцируют ряд токсинов: альфа, бета, эпсилон и йота. Альфа-токсин - основной, он проявляет фосфолипазную, лецитиназную и гемолитическую активности, а также обладает прямыми летальным и некротизирующим эффектами. Клостридий являются типичными условными патогенами, поскольку они не могут пролиферировать и продуцировать токсины в интактных тканях

Основным фактором, способствующим их пролиферации, является снижение оксигенации тканей, связанное с травмами, оперативными вмешательствами, нарушениями кровоснабжения. При формировании указанных условий клостридиальное поражение может развиваться практически на любом участке тела человека.

Газовая гангрена (клостридиальный мионекроз) представляет собой прямое токсическое разрушение мышечной ткани, сопровождающееся пролиферацией микроорганизмов и накоплением газа (водорода и азота), выраженной токсемией, в значительной части случаев наблюдают бактериемию.

Наиболее типичной локализацией газовой гангрены являются мышечные массивы нижних конечностей, однако возможны и поражения гладкой мускулатуры, например миометрия, развивающиеся после криминального аборта или осложненных родов.

Кроме газовой гангрены цитотоксические клостридии вызывают некротические процессы с газообразованием в мягких тканях без поражения мышц (крепитирующие анаэробные целлюлиты). По тяжести течения в некоторых случаях эти процессы могут не уступать газовой гангрене.

Необходимо иметь в виду, что поражения мягких тканей, сопровождающиеся крепитацией (газообразованием), могут вызывать и другие микроорганизмы (анаэробные кокки, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., C. bifermentans, С.sordelii, С.tertium и другие).

Для анаэробных целлюлитов характерно наличие в мазке полимикробной флоры и лейкоцитарной реакции.

Клостридии являются типичными условными патогенами из-за неспособности к пролиферации и продуцированию токсинов в интактных тканях. Ведущая роль клостридии в развитии некротических поражений ишемизированных тканей очевидна (Сидоренко С.В., Яковлев С.В. «Инфекции в интенсивной терапии», М., 2000 г., с.40).

Выявление наличия и определение степени действия клостридиальных токсинов при полимикробных инфекциях (ассоциациях микроорганизмов) является основанием для оценки клинической значимости клостридий.

Аналогом заявляемого предложения является способ выявления токсина клостридий с помощью заражения лабораторных животных (морских свинок) (И.Е.Колуканов «Методы выделения и идентификации анаэробов - возбудителей газовой гангрены» (методическое пособие для врачей-бактериологов), Л., 1970, с.16). Микробная суточная культура клостридий в количестве 0,5-1 мл вводится в/мышечно во внутреннюю поверхность бедра морской свинки. У погибших животных исследуют ткани из очага поражения и внутренние органы (кровь из сердца, печень и т.д.). Если животное не погибает, то по истечении нескольких дней после заражения его умерщвляют и исследуют ткань, в которую был инъецирован материал.

Недостатком этого метода являются: отсутствие стандартизации, длительность и трудоемкость исследования, невозможность определения наличия и степени действия токсина клостридий у выживших животных.

Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого предложения является определение токсина С.perfringens в культуре ткани (И.Е.Колуканов «Методы выделения и идентификации анаэробов - возбудителей газовой гангрены» (методическое пособие для врачей-бактериологов), Л., 1970, с.24). Метод заключается в следующем: культура ткани готовится путем трипсинизации 11-дневных куриных эмбрионов с последующим выращиванием клеточной взвеси при температуре 37°С в питательной среде, состоящей из 7,5% бычьей сыворотки и 92,5% раствора Хенкса. Материал засевают на среду Китт-Тароцци и выращивают 4-6 часов при температуре 37°С. Затем культуральную жидкость разводят вдвое физиологическим раствором и добавляют антибиотики (по 50 ед./мл пенициллина и стрептомицина). Приготовленное таким образом разведение токсина вводится в количестве 0,2 мл в пробирку с культурой ткани, которая затем помещается в термостат при температуре 37°С. При этом учитывается, что прибавление 0,2 мл токсина к 1,8 мл питательной смеси в пробирках приводит к разведению токсина еще в 10 раз. На каждую пробу берется по 4 пробирки с культурой ткани. В качестве контроля служит пробирка с культурой ткани, к которой добавляется физиологический раствор, используемый для разведения. Наличие цитотоксического действия определяется при малом увеличении микроскопа (7×10). Это действие проявляется в разрушении значительного числа клеток и иногда отслоении клеточного слоя от стенок пробирки. В опыт лучше брать суточную культуру ткани, полученную путем посева взвеси клеток, содержащей 1 млн. клеток на 1 мл питательной среды.

Наличие цитотоксического эффекта определяют через 4 часа после начала исследования.

Недостатком этого способа является то, что он предназначен для оценки токсина только С.perfringens. Тест проводится без использования анаэростатов (без снижения уровня оксигенации ткани), оценка действия токсина не стандартизирована ни в отношении количества микробных клеток, ни по отношению к клеткам человеческого макроорганизма. Кроме того, и оценка проводится визуально по «разрушению значительного числа клеток и иногда отслоению клеточного слоя от стенок пробирки».

Таким способом можно оценить наличие только сильнодействующего токсина С.perfringens, а не других, часто встречающихся в микробных ассоциациях, видов клостридий, например C. bifermentans, С.sordelii, С.tertium и других.

Техническим результатом изобретения является выявление в стандартных условиях и при короткой экспозиции наличия и степени действия токсина клостридий в условиях, приближенных к условиям клеток человеческого макроорганизма, особенно у штаммов клостридий, роль которых раньше не учитывалась при наличии их в инфицированной ране.

Результат изобретения достигается за счет того, что в условиях анаэростата в течение 2 часов со стандартным количеством (0,2 мл) накопительной среды СКС, со стандартным количеством микроорганизмов проводят совместное инкубирование с монослоем фибробластов эмбрионов кожи человека (ФКЭЧ). Клетки монослоя отмывают трехкратно средой Игла и микроскопируют при увеличении (40×10) или (90×10). Наличие и силу действия токсина оценивают по состоянию монослоя по шкале Фармакопеи США.

В таблицах показаны: в таблице 1 - степень цитотоксического действия токсина и реакция клеток в соответствии с Фармакопеей США; в таблице 2 - результаты применения способа оценки клинической значимости клостридий, выделенных из ран больных и объектов внешней среды. (Методические указания МУ 1.2.1105-02 Оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средств. Журнал «Дезинфекционное дело», 2002 г., с.58.)

Способ осуществляется следующим образом.

В условиях анаэростата 0,2 мл суточной культуры клостридий (1×10⁶ КОЕ/мл) на среде СКС (среда для контроля стерильности) помещали в 1,8 мл среды Игла в пробирке Лейтона на покровное стекло с монослоем ФКЭЧ (фибробласты кожные эмбриона человека). Пробирку инкубировали 2 часа при 37°С в анаэростате, клетки монослоя отмывали 3-кратной сменой среды Игла и микроскопировали при увеличении (40×10) или (90×10), оценивая состояние монослоя в соответствии с таблицей 1.

Таким образом, предложенный способ позволяет выявить наличие и степень действия токсина не только известных, продуцирующих гистотоксические экзотоксины, С.perfringens и С.hystoliticum, но и довольно часто встречающихся как в монокультуре, так и в микробных ассоциациях С.tertium, С.inocuum, С.baratii, C. butyricum. В случае присутствия последних в микробных ассоциациях ран клиницисты должны учитывать возможное участие штаммов клостридий со степенью цитотоксического действия 1-4 в динамике инфекционного процесса не только как контаминацию раны.

Таблица 1СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ КЛОСТРИДИЙСтепень цитотоксического действия (ЦТД)Реакция клетокСостояние клеток в культуре4тяжелая100%-ная деструкция клеточного монослоя3умеренная70-75% клеточного монослоя содержит округлые и/или лизированные клетки2мягкая50% гибели клеток1слабая20-25% лизированных клеток0нетОтсутствие ЦТД

Таблица 2№п/пВид клостридийСтепень ЦТД1С.perfringens42С.hystoliticum33С.tertium24С.inocuum35С.baratii26C. butyricum1

Изобретение относится к области медицины, а именно к медицинской токсикологии, микробиологии, и касается способа оценки клинической значимости клостридий в условиях полимикробной инфекции. Способ заключается в том, что стандартное количество суточной культуры клостридий инкубируют в условиях анаэростата на среде СКС совместно с монослоем фибробластов кожи эмбриона человека и после трехкратного отмывания клеток монослоя средой Игла методом микроскопии оценивают наличие и силу действия токсина по степени разрушения монослоя в соответствии со шкалой Фармакопеи США. Использование способа позволяет повысить точность выявления наличия и определения степени действия клостридиальных токсинов. 2 табл.

Способ оценки клинической значимости клостридий, отличающийся тем, что в условиях анаэростата в течение 2 ч стандартное количество суточной культуры микроорганизмов (1×10⁶ КОЕ/мл) в стандартном количестве накопительной среды СКС 0,2 мл инкубируют совместно с монослоем фибробластов кожи эмбриона человека и после трехкратного отмывания клеток монослоя средой Игла методом микроскопии оценивают наличие и силу действия токсина по степени разрушения монослоя в соответствии со шкалой Фармакопеи США.