Способ определения тимидина в биологической пробе Советский патент 1988 года по МПК G01N33/53 

i

(Л

Изобретение относится к биохимии. Цель изобретения - упрощение способа. Клетки костного мозга суспендируют, затем центрифугируют. Осадок суспендируют в лизирующей смеси с аденозинтрифосфатом, К лизату клеток костного мозга с тимидинкиназой добавляют реакционную смесь с различным содержанием тимидина и инкубируют. Добавляют в пробы этанол и смесь наносят на хроматографическую бумагу. После промывки бумажные подложки заливают сцинтилляционной смесью и просчитывают радиоактивность. По калибровочному графику определяют концентрацию тимидина в пробе. 1 ил., 1 табл.

00

9д 1

:О qO

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицине в случаях, когда проводится лечение антиметаболитами нуклеиновых кислот, а также в тех случаях, когда тимидин используют в качестве лечебного средства в антираковой терапии.

Целью изобретения является упрощение способа за счет сокращения количества стадий.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения тимидина в биологической пробе, включающему инкубацию ее со специфическим белком в присутствии Н-тимидина с последующей очисткой полученного продукта и определением тимидина по калибровочной кривой уровня радиоактивности полученного продукта, в качестве специфического белка используют лизат клеток костного мозга, а инкубацию осуществляют в присутствии насыщающей концентрации аденозинтри- фосфата, далее полученный продукт очищают хроматографически.

Пример 1. Получение лизата клеток костного мозга, содержащего тимидинкиназу.

1,1 -10 клеток костного мозга из бедренных костей пяти мышей линии СВА суспендируют в 4 мл физиологического раствора при 4°С. Осаждают центрифугированием при 2000 об/мин 10 ми на центрифуге ЦЛС-3. Осадок суспендируют в 2 мл холодной лизирующей смеси, содержащей, М: КС1 0,01; MgCl 0,002; трис 0,01; аденозинтрифосфат 0,001; меркаптоэтанол 0,01; амино- капроновая кислота 0,,6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина; 10 мкМ NaF, и переносят в чистые пластиковые пробирки по 0,5 мл. Клетки разрушают поочередным замораживанием в жидком азоте и оттаиванием при 37 в водном термостате. Процедуру повторяют трижды. Полученный лизат про- . светляют центрифугированием при 16000 об/мин в течение 30 мин. Супер натант лизата клеток костного мозга, содержащий тимидинкиназу, разливают в чистые пробирки по 0,5 мл и хранят в жидком азоте. Процедура занимает 1 ,5 ч.

На чертеже показано построение калибровочного графика.

Составление полной реакционной смеси. Для построения калибровочной кривой к 0,1 мл начальной реакцион

0

T

ной смеси, содержащей, М: трис 0,15; аденозинтрифосфат 0,01; MgClj 0,01; NaF 0,025; меркаптоэтанол 0,01, рН 7, добавляют по 25 мкл водного раствора тимвдина различной концентрации (10; 7; 5; 1; 0,5; 0,1 мМ) и по 25 мкл Н-тимидина (1,87 inCi/мл; 40,4 мкМ) .

Составление полной инкубационной смеси. Для составления полной инкубационной смеси к 20 мкл лизата клеток костного мозга, содержащего тимидинкиназу, добавляют по 30 мкл полной реакционной смеси с различным содержанием тимидина. В качестве контроля берут пробу, содержащую 20 мкл ли- зирующего раствора (вместо клеточного лизата) и 30 мкл полной реакционной смеси.

Инкубация и анализ результатов. После составления полной инкубационной смеси пробы инкубируют при 37°С в течение 15 мин. Затем реакцию останавливают, добавляя в кажду пробу

ПО 13 мкл этанола. По 50 мкл из каждой пробы наносят на кружки из хрома- тографической бумаги Whatman АЕ-81 или ДЕ-81 диаметром 2,2-2,3 см, бумагу подсушивают. Затем бумажные кружки

трижды отмывают дистиллированной водой, один раз этанолом и эфиром. Сухие бумажные подложки переносят во флаконы, заливают по 5 мл сцинтилля- ционной смеси и просчитывают радиоактивности на счетчике импульсов.

Определение содержания тимидина в плазме крови мыщи. Тимидин концентрацией 60 мг/мл вводят внутрибрюшинно из расчета 3,0 мг на 1 г веса животного. Через промежутки времени 2 ч 30 мин; 6 ч 30 мин и 12 ч у животного берут кровь из вены, переносят ее в центрифужные пробирки. Сыворотку отделяют центрифугированием при

3000 об/мин в течение 10 мин. Затем составляют полную реакционную и полную инкубационную смеси как описано вьщ1е, за исключением того, что при составлении полной реакционной смеси

вместо раствора тимидина добавляют по 25 мкл сыворотки, содержащей неизвестное количество тимидина. Инкубацию проб и анализ результатов проводят как описано при построении калибровочной кривой.

Результаты определения содержания тим1одина в сыворотке крови представлены в таблице.

Данные о влиянии концентрации немеченого тимидина на фосфорилирование меченого Н-тимидина (калибровочный график зависимости уровня радиоактивности полученного продукта от концентрации тимидина в пробе, где точки (О) соответствуют уровню радиоактивности полученного продукта при измерении содержания тимидина в сыво- ротке крови мьшш через разные промежутки времени после введения ей препарата тимидина) представлены на чертеже .

Исходя из полученных значений радиоактивности, используя калибро- ЗО

вочную кривую, находят, что содержание тимидина в плазме после инъекции через указанные промежутки времени составляют соответственно 7,8; 1,7; 0,15 мМ.

Из приведенных результатов следует, что полученный калибровочный график позволяет эффективно различать содержание в биологической пробе немеченного тимидина концентрации от 0,1 до 10 мМ. Вся процедура измерения тимидина занимает 2,5-3 ч.

15Фо15мула изобретения

Способ определения тимидина в биологической пробе путем инкубации со специфическим белком в присутствии Н-тимидина с последующей очисткой полученного продукта, регистрацией связанного тимидина и расчетом по калибровочной кривой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет сокращения числа стадий, в качестве специфического белка используют тимидинкиназу в ли- зате клеток костного мозга, а инкубацию проводят в присутствии насыщающих концентраций АТФ.

Ю mufuduH

(Hfl)