СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕКАРСТВЕННОЙ АЛЛЕРГИИ ВЫЯВЛЕНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике.

В последние годы исследователями предпринимаются попытки разработать высокоэффективный и универсальный метод специфической диагностики лекарственной сенсибилизации. В комплекс методов, обеспечивающих диагностику гиперчувствительности, включена и регистрация иммунокомплексных реакций [1].

Как известно, иммунные комплексы, или комплексы антиген-антитело - макромолекулярные структуры, образующиеся в результате специфического взаимодействия корпускулярных или растворимых антигенов с бивалентными антителами. При умеренном избытке антигена формируются крупные кристаллоподобные образования, состоящие из множества частиц антигена и молекул антител. К иммунным комплексам присоединяются компоненты комплемента, антиглобулиновые факторы и некоторые другие вещества, что вызывает нарушение проницаемости мембран, вплоть до их разрыва. Это, в конечном итоге, может привести к гибели клетки. Определение иммунных комплексов в сыворотке крови имеет важное значение в диагностике аллергических реакций 3 типа, при которых уровень циркулирующих иммунных комплексов повышается [1, 2].

В основе реакции по определению специфических комплексов лежит избирательная способность специфического антигена и соответствующих антител реагировать друг с другом независимо от присутствия других антигенов и антител. В результате их взаимодействия образуется различные вещества пептидной природы (комплекс антиген - антитело, или иммунный комплекс). Образование иммунного комплекса сопровождается появлением осадка, регистрируемого различными способами.

Известен метод определения специфических антител в сыворотке крови осаждением иммунных комплексов [2].

Метод заключается в том, что иммунные комплексы, в состав которых входят Ig G-антитела и антиген, осаждают 2-3,5% полиэтиленгликолем (ПЭГ), приготовленным на боратном буферном растворе. К 0,2-0,5 мл сыворотки крови больного добавляется равный объем аллергена (или лекарственного препарата в разведении в 1000 - 10 000 раз) и инкубируется 30 мин при 37°С. Далее в пробирки вносят двукратный объем (по 1 мл или 0,4 мл) 2-3,5% реактива ПЭГ, а в контрольную пробирку - аналогичный объем физиологического раствора. Оставляют на 1-2 часа (или на ночь - до 18 часов) при комнатной температуре. Учет проводят измерением на ФЭК при 450 нм по степени помутнения. Объемы опыта и контроля доводят физиологическим раствором до нужного объема кювет (например, до 2 мл) и оценивают разность опыта с контролем в условных единицах.

Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков:

указанный способ рекомендован только для диагностики аллергии к белкам и выявления сывороточной болезни;

различная концентрация лекарственных препаратов, используемых для исследований in vitro, может обусловить искажение получаемых результатов, снижение чувствительности метода;

метод трудоемок, требует достаточно большого объема крови, что ограничивает количество исследуемых препаратов одновременно;

режим инкубирования сыворотки с аллергеном - 30 мин при 37°С не оптимален, поскольку не позволяет сформировать достаточно прочные связи гаптена с гаптенспецифическими антителами;

использование ФЭК для учета результатов, требующего дополнительного разведения опытных и контрольных проб физиологическим раствором при доведении объемов до объема кювет, как дополнительное субъективное вмешательство также может искажать получаемые результаты, снижать чувствительность метода;

неконкретная концентрация раствора ПЭГ (2-3,5%) не позволяет стабилизировать реакцию образования иммунных комплексов;

допускаемая неопределенность времени инкубации проб с ПЭГ (от 1-2 до 18 часов) также может искажать получаемые результаты и снижать чувствительность метода.

Поставлена задача разработки способа определения специфических иммунных комплексов к широкому спектру лекарственных препаратов, повышения специфичности и чувствительности способа, стабилизации получаемых результатов, снижения трудоемкости, себестоимости анализа, возможности одновременного определения большого количества препаратов у одного пациента.

Поставленная задача достигается приготовлением раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) в конкретной концентрации 4,2% на боратном буферном растворе [3] инкубацией сыворотки крови пациента с лекарственными препаратами в концентрации, равной половине терапевтической дозы, в течение 1 часа при 37°С.

Дальнейшие исследования проводят в иммунологическом планшете, где специфические иммунные комплексы осаждают ПЭГ в течение 1 часа при комнатной температуре. Регистрация результатов осуществляется на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. Поскольку у пациентов, принимающих лекарственный препарат и не имеющих к нему гиперчувствительности, может отмечаться присутствие специфических антител и иммунных комплексов в определенных пределах, предлагают оценку результатов проб в конкретных границах:

- при нарастании уровня оптической плотности опытной пробы до 10% регистрировать нормальное значение реакции на препарат;

- от 10 до 15% - возможность аллергической реакции;

- свыше 15% - наличие аллергической реакции на препарат.

Способ диагностики лекарственной аллергии выявлением специфических иммунных комплексов осуществляется следующим образом:

1. Приготовление боратного буферного раствора:

- 1,24 г борной кислоты растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 мл; 1,9 г буры (натрия тетраборнокислого) растворяют в воде и доводят до 100 мл. Берут 55 мл 1-го и 45 мл 2-го раствора, сливают и доводят объем водой до 200 мл.

2. Приготовление раствора полиэтиленгликоля:

на основе боратного буферного раствора готовят 4,2% раствор ПЭГ (рН 8,4).

3. Подготовка сыворотки крови пациента к исследованию:

- из локтевой вены пациента берут 5-7 мл крови, переносят в пробирку и помещают на 30 мин в термостат при 37°С. Сыворотку отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин.

4. Подготовка проб к исследованию:

- к 50 мкл сыворотки крови больного добавляют равное количество лекарственного препарата (количество опытных проб неограниченно), концентрация которого равна половине терапевтической дозы (например, концентрация бензилпенициллин натриевой соли - 400 мкг/мл). В качестве контроля к 50 мкл сыворотки крови добавляют такое же количество физиологического раствора (рН 7,4). Пробы инкубируют при 37°С в течение 1 часа.

5. Используют планшеты для иммунологических анализов, оптическая плотность лунок которых стандартизирована и не превышает 0,04 единицы оптической плотности. В лунки раскапывают по 150 мкл раствора ПЭГ, куда добавляют по 50 мкл исследуемых проб и контроля. Исследования проводят в дублях. Планшет накрывают крышкой, выдерживают 60 мин при комнатной температуре (20-22°С).

6. Проводят измерение оптической плотности на планшетном иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм.

7. Учет результатов:

- разность оптической плотности опыта и контроля оценивают в процентах, при этом оптическую плотность контроля принимают за 100%.

8. Оценка результатов исследования

Нарастание уровня оптической плотности опытной пробы:

- до 10% расценивают как нормальное значение;

- от 10 до 15% - возможность развития аллергической реакции;

- свыше 15% - наличие аллергической реакции на препарат.

Пример 1.

Больная Н., 30 лет. В анамнезе: аллергия на тетрациклин в 2-летнем возрасте. Других аллергических реакций не отмечает.

Из локтевой вены пациентки взяли 3 мл крови и поместили на 30 мин в термостат при 37°С. Сыворотку отделили центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин. В первую опытную пробирку прилили 50 мкл сыворотки крови и добавили равное количество раствора тетрациклина, приготовленного на физиологическом растворе в концентрации, равной половине терапевтической дозы. Во вторую опытную пробирку к 50 мкл сыворотки крови прилили 50 мкл раствора доксициклина в концентрации, равной половине терапевтической дозы, а в третью опытную пробирку - раствор бензилпенициллин натриевой соли в дозе, равной половине терапевтической. В качестве контроля к 50 мкл сыворотки крови добавили равное количество физиологического раствора (рН 7,4). Пробы инкубировали при 37°С в течение 1 часа.

В лунки А1 и А2 прилили по 150 мкл раствора ПЭГ и по 50 мкл сыворотки, инкубированной с раствором тетрациклина, в лунки В1 и В2 приливали по 150 мкл раствора ПЭГ и по 50 мкл сыворотки, инкубированной с раствором доксициклина, в лунки С1 и С2 - по 150 мкл раствора ПЭГ и по 50 мкл сыворотки, инкубированной с раствором пенициллина, в лунки Д1 и Д2 раскапывали по 150 мкл раствора ПЭГ и по 50 мкл контрольной сыворотки. Планшет накрыли крышкой, выдержали 60 мин при комнатной температуре и замерили оптическую плотность на иммуноферментном анализаторе УНИПЛАН "ПИКОН" при длине волны 450 им. Разницу в полученных результатах оценивали в процентах.

Результаты определения оптической плотности:

Контроль - 0,091 ед;

Тетрациклин - 0,162 ед;

Доксициклин - 0,099 ед;

Пенициллин - 0,098 ед.

Определение разности оптической плотности:

Тетрациклин - увеличение на 0,071 ед;

Доксициклин - увеличение на 0,008 ед;

Пенициллин - увеличение на 0,007 ед;

Оценка результатов проб:

Тетрациклин - увеличение на 78% - положительная;

Доксициклин - увеличение на 8,8% - отрицательная;

Пенициллин - увеличение на 7,6% - отрицательная.

Заключение: У больной определена высокая степень сенсибилизации к тетрациклину.

Пример 2.

Больная К., 55 лет. Диагноз: Аутоиммунный тиреоидит, гипотиреоз. Регулярно принимает L-тироксин в течение 6 лет. Одновременно принимает налипрел и теодибаверин. В последний месяц появилась сыпь, зуд, умеренная отечность. Использовала антигистаминные препараты: кларотадин, тавегил.

Результаты определения оптической плотности:

Контроль - 0,037 ед;

L-тироксин - 0,061 ед;

Теодибаверин - 0,039 ед;

Налипрел - 0,037 ед.

Результаты определения разности оптической плотности:

L-тироксин - 0,024 ед;

Теодибаверин - 0,002 ед;

Налипрел - 0 ед.

Оценка результатов проб:

L-тироксин - увеличение на 64,7% - положительная;

Теодибаверин - увеличение на 5,4% - отрицательная;

Налипрел - увеличения нет - отрицательная.

Заключение: У больной определена высокая степень сенсибилизации к L-тироксину.

Пример 3.

Больной М., 65 лет. Диагноз: Гипертоническая болезнь 2 ст., ИБС 1 ст. В терапии использовались амлодипин, арифон, козаар и клофелин. В последние 7 дней появилась сыпь, легкий зуд и отечность слизистой полости рта.

Результат определения оптической плотности:

Контроль - 0,069 ед;

Амлодипин - 0,115 ед;

Арифон - 0,082 ед;

Козаар - 0,070 ед;

Клофелин - 0,075 ед.

Результаты определения разности оптической плотности:

Амлодипин - увеличение на 0,046 ед;

Арифон - увеличение на 0,013 ед;

Козаар - увеличение на 0,001 ед;

Клофелин - увеличение на 0,006 ед.

Оценка результатов проб:

Амлодипин - увеличение на 66,7% - положительная;

Арифон - увеличение на 18,8% - положительная;

Козаар - увеличение на 1,4% - отрицательная;

Клофелин - увеличение на 8,6% - отрицательная.

Заключение: У больного определена сенсибилизация к арифону и высокая степень сенсибилизации к амлодипину.

Пример 4.

Больная Г., 19 лет. Направительный диагноз: определение чувствительности к местноанестезирующим препаратам: лидокаин, убистезин, септанест. В анамнезе: аллергия к бытовым, пыльцевым аллергенам. Местноанестезирующие препараты использовались 3 года назад. Отмечалось головокружение, слабость после инъекций лидокаином.

Результат определения оптической плотности:

Контроль - 0,073 ед;

Лидокаин - 0,091 ед;

Убистезин - 0,082 ед;

Септанест - 0,075 ед;

Результат определения разности оптической плотности:

Лидокаин - увеличение на 0,018 ед;

Убистезин - увеличение на 0,009 ед;

Септанест - увеличение на 0,002 ед.

Оценка результатов проб:

Лидокаин - увеличение на 24,6% - положительная;

Убистезин - увеличение на 12,35 - возможно развитие реакции;

Септанест - увеличение на 2,7% - отрицательная.

Заключение: У пациентки определена гиперчувствительность к лидокаину, возможность развития реакции к убистезину. К использованию разрешен септанест.

Сравнительный анализ результатов диагностики лекарственной аллергии предлагаемым способом с рассматриваемым аналогом на 38 препаратах у 14 больных показал полное совпадение результатов исследования сенсибилизации к лекарственным веществам в 67,2%; в 11 случаях из 38 (28,9%) предлагаемый способ указывает на наличие сенсибилизации к лекарственным препаратам, что совпадало с анамнезом и клиническими проявлениями аллергической реакции у пациентов. Тогда как по результатам метода аналога отмечалось отсутствие реакции на эти препараты.

Таким образом, полученные результаты сравнительного анализа позволяют считать предлагаемый способ более чувствительным и воспроизводимым, чем известный аналог.

Предлагаемый способ:

1. Позволяет определять уровень специфических иммунных комплексов.

2. Позволяет исследовать наличие сенсибилизации к широкому спектру лекарственных препаратов.

3. Безопасен в диагностике.

4. Высокочувствителен и воспроизводим.

5. Дешев, с коротким временем постановки, что позволяет считать его скрининговым.

6. Использование предлагаемого способа возможно в любой клинической лаборатории, имеющей планшетный или стриповый иммуноферментный анализатор.

Источники информации

1. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: Медицина, 2002, 289 с.

2. Новиков Д.К. Оценка иммунологического статуса. Москва-Вибеск, 1996.

3. Гриневич Ю.А., Алферова А.Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных. Лабораторное дело, 1981, №8, с. 493-496.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике. Для выявления лекарственной аллергии к сыворотке крови пациента добавляют равное количество лекарственного препарата, концентрация которого равна половине терапевтической дозы, для контроля к сыворотке крови пациента добавляют такое же количество физиологического раствора. Пробы инкубируют в течение 1 часа, для осаждения образовавшихся иммунных комплексов добавляют по 50 мкл исследуемых проб в лунки планшета для иммуноферментного анализа, содержащие по 150 мкл 4,2% раствора ПЭГ, приготовленного на боратном буфере рН 8,4, выдерживают в течение 1 часа. Регистрацию результатов осуществляют на иммуноферментном анализаторе при длине волны 450 нм. По нарастанию уровня оптической плотности опытной пробы по сравнению с контролем определяют наличие или отсутствие аллергической реакции на препарат. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность способа.

Способ диагностики лекарственной аллергии выявлением специфических иммунных комплексов, включающий инкубирование сыворотки пациента с лекарственным препаратом при 37°С, осаждение специфических иммунных комплексов раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) при комнатной температуре, определение их содержания измерением оптической плотности при длине волны 450 нм и учет результатов по разности оптической плотности опыта и контроля, отличающийся тем, что к сыворотке крови пациента добавляют равное количество лекарственного препарата, концентрация которого равна половине терапевтической дозы, для контроля к сыворотке крови пациента добавляют такое же количество физиологического раствора, пробы инкубируют в течение 1 ч, для осаждения образовавшихся иммунных комплексов добавляют по 50 мкл исследуемых проб в лунки планшета для иммуноферментного анализа, содержащие по 150 мкл 4,2%-ного раствора ПЭГ, приготовленного на боратном буфере рН 8,4, выдерживают в течение 1 ч, измеряют оптическую плотность на иммуноферментном анализаторе, разность оптической плотности опыта и контроля оценивают в процентах, при этом оптическую плотность контроля принимают за 100%, при нарастании уровня оптической плотности опытной пробы по сравнению с контролем до 10% определяют нормальное значение реакции на препарат, от 10 до 15% - возможность аллергической реакции, а свыше 15% - диагностируют наличие аллергической реакции на препарат.