Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому Дауэр-феромону спящего состояния и к определению его структуры, более конкретно, к Дауэр-феромону, который может индуцировать стадию спящего состояния личинки у С.elegans. Настоящее изобретение также относится к новому способу эффективного выделения и очистки физиологически активного феромона спящего состояния и к определению структуры этого вещества.
Уровень техники
Феромоны определяются как вещества, которые используются для общения между индивидуумами одного и того же вида. Феромоны обычно получают в форме смесей, посредством множества стадий разделения, включая экстракцию органическими растворителями и жидкостную колоночную хроматографию.
В начале 1980 годов сообщалось, что С.elegans может секретировать тип феромона, названного «Дауэр-феромон» или «феромон спящего состояния», конститутивно секретируемое вещество, служащее в качестве индикатора плотности популяции (Golden and Riddle 1982, Golden and Riddle 1984a, Golden and Riddle 1984 с), который может индуцировать стадию спящего состояния у С.elegans, когда они встречаются с неблагоприятными условиями окружающей среды, такими как тепло, отсутствие корма и скученность. Хотя его существование известно в течение более двух десятилетий, его структура, молекулярная масса и физические свойства до сих пор не известны (Riddle, D.L., Science, 218: 578-580, 1982).
В соответствии с предыдущими исследованиями феромон, секретируемый C.elegans, существует в исключительно низкой концентрации. Из-за его возможностей в плане управления процессами старения и стрессом у C.elegans, феромон спящего состояния широко изучается. Однако до сих пор, поскольку он недоступен в виде отдельных молекул, большинство исследователей используют неочищенные (сырые) экстракты C.elegans, которые, как предполагается, содержат феромон спящего состояния, а также и другие соединения.
По этой причине, необходимо выделение чистого феромона спящего состояния из экстрактов и определение его структуры для исследований старения, стресса и других клеточных функций C.elegans. Вероятно, феромон спящего состояния должен детектироваться с помощью еще не идентифицированного рецептора феромона, который связан с путем сигнализации циклического ГМФ (цГМФ, циклический гуанозинмонофосфат), содержащего daf-11 (Birnby et al. 2000). Известно, что феромон спящего состояния С.elegans является очень стабильным и гидрофобным и имеет хроматографические свойства, сходные со свойствами гидроксилированных жирных кислот и желчных кислот.
В этой статье, авторы описывают очистку, идентификацию и молекулярную характеристику С.elegans - специфичного феромона спящего состояния.
Описание изобретения
Авторы настоящего изобретения провели широкие исследования в течение многих лет для выделения нового класса Дауэр-феромона спящего состояния, который может широко использоваться для исследований старения, стресса, передачи сигнала и различных биологических проблем. В результате, авторы обнаружили, что экстракт, полученный от C.elegans, которые изучаются в качестве хорошей животной модели для различных заболеваний, содержит новый феромон спящего состояния, и очистка этого экстракта посредством процедур постадийного разделения приводит к получению чистого феромона спящего состояния. На основе этих данных возможно получение нового Дауэр-феромона спящего состояния.
По этой причине, целью настоящего изобретения является создание нового феромона спящего состояния, которое включает в себя экстрагирование C.elegans одним или несколькими растворителями, выбранными из группы, состоящей из воды, спиртов и этилацетата, и хроматографическое разделение с различными растворителями в качестве элюентов.
Другой целью настоящего изобретения является получение 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановой кислоты или ее солей, которые могут быть представлены нижеприведенной формулой I:
Структурная формула I
Еще одной целью настоящего изобретения является получение композиции обладающей активностью, индуцирующей спящее состояние, которая включает в себя 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту или ее соли и фармацевтически приемлемый носитель.
Еще одной целью настоящего изобретения является получение фармацевтической композиции для индуцирования спящего состояния C.elegans или управления процессом старения животных.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание способа для выделения и очистки феромона спящего состояния с использованием нескольких хроматографических процедур.
Способ включает в себя стадии
1) экстрагирования этанолом C.elegans, которые выращены на S.базальной жидкой среде путем скармливания Escherichia coli;
2) экстрагирования этилацетатом этанольных экстрактов, полученных на стадии 1;
3) эффективного удаления примесей из этилацетатных фракций с помощью адсорбционной хроматографии на силикагеле;
4) разделения и очистки феромона спящего состояния с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием различных колонок с аминными группами.
Другие цели и преимущества настоящего изобретения станут ясны из следующего далее описания.
Выше кратко описаны некоторые из наиболее существенных целей настоящего изобретения. Эти цели должны рассматриваться только как иллюстрация некоторых наиболее существенных признаков и применений настоящего изобретения. Многие другие полезные результаты могут быть получены посредством применения описываемого изобретения иным способом или модификации настоящего изобретении в рамках раскрытия в описании. Соответственно, другие цели и более глубокое понимание настоящего изобретения могут быть осуществлены посредством ссылок на подробное описание предпочтительного варианта осуществления, в добавление к рамкам настоящего изобретения, определенным формулой изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет схему, которая иллюстрирует постадийный способ для выделения и очистки соединения феромона по настоящему изобретению из C.elegans;
Фиг.2 представляет собой типичную хроматограмму, которая иллюстрирует обогащение активных фракций посредством ВЭЖХ на колонках с аминными группами, с использованием градиентного элюирования дистиллированной водой и изопропанолом в качестве растворителя;
Фиг.3 представляет собой хроматограмму ВЭЖХ, с выделением по молекулярной массе (W251), которая осуществляется при условиях изократического элюирования, с использованием метанола в качестве растворителя;
Фиг.4 представляет собой график спектра водородного ядерного магнитного резонанса (1H-ЯМР), полученного с помощью использования дейтерированного метанола (CD3OD) в качестве растворителя;
Фиг.5 представляет собой график спектра углеродного ядерного магнитного резонанса (13C-ЯМР), полученного с помощью использования дейтерированного метанола (CD3OD) в качестве растворителя;
Фиг.6 представляет собой график, иллюстрирующий молекулярный масс-спектр, полученный в положительном режиме с использованием масс-спектрометра квадрупольного типа;
Фиг.7 представляет собой график, иллюстрирующий результаты измерения масс-спектра феромона в присутствии ацетата натрия во время процесса измерения в положительном режиме, с использованием масс-спектрометра квадрупольного типа; и
Фиг.8 представляет собой график, иллюстрирующий результат измерения масс-спектра в отрицательном режиме, с использованием масс-спектрометра квадрупольного типа.
Наилучший способ для осуществления изобретения
Здесь, далее, заявка будет иллюстрироваться более подробно.
Выделенный феромон для цели настоящего изобретения представляет собой 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту или ее соли, которые могут быть представлены формулой I, ниже. Соединение формулы I явно индуцирует стадию спящего состояния у червей.
Структурная формула I
Соединение формулы I может быть приготовлено в виде фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемыми наполнителями или носителями. В частности, композиция может быть желательной для использования в качестве различных экспериментальных реагентов для управления стадией спящего состояния у животных и для исследования механизмов старения, стресса, трансдукции сигналов, неврологических заболеваний и метаболических заболеваний.
Новое соединение феромона или его соль, которая представляет собой физиологически активный материал, который фактически способен индуцировать вхождение C.elegans в стадию спящей личинки, когда этот чистый феромон добавляется в среду обитания. Как обнаружено, оно представляет собой новое соединение феромона, которое имеет указанную выше структурную формулу I, и его химическая формула представляет собой 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту.
Первой целью настоящего изобретения является получение отдельной молекулы Дауэр-феромона спящего состояния C. elegans,высокой степени очистки, в больших количествах, которые могут быть использованы для исследования старения, передачи сигнала, регуляции обмена и стресса. Вторая цель заключается в определении его химической структуры и в проверке того, является ли выделенный чистый феромон спящего состояния новым и содержит ли он биологически функциональное соединение, индуцирующее спящее состояние, используя различные аналитические методики и биологические анализы.
Соединение феромона или его соль, которая выделяется и характеризуется в настоящем изобретении, представляет собой соединение, секретируемое C. elegans, проявляет активность феромона спящего состояния.
Фракция активного феромона, которая в настоящее время используется многими исследователями для изучения старения, передачи сигнала и стресса, представляет собой неочищенный экстракт, который приготавливают посредством экстракции этанолом культуры C. elegans. По этой причине, при доступности чистого феромона спящего состояния, теперь возможным становится исследование старения, передачи сигнала и стресса, в которых участвует феромон спящего состояния.
Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения даже будут описаны более подробно в сочетании с прилагаемыми таблицами и чертежами.
Хотя выше подробно описывались предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, необходимо четко понять, что множество вариаций и/или модификаций основных концепций изобретения, рассматриваемого здесь, которые могут применяться специалистами в данной области, также соответствуют духу и находятся в рамках настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.
Вариант осуществления
После культурирования C. elegans вS.базальной жидкой среде, в течение 5 дней, при температуре 20°C, посредством кормления Escherichia coli (OP50), они дополнительно культурируются в течение дополнительных 10 дней посредством дополнительного питания.
Разделение на центрифуге осуществляется с получением питательной среды, после того как у 70% червей наступает стадия спящей личинки. Жидкая фаза культурных сред получается посредством удаления червей и Escherichia coli путем фильтрования на мембране, с использованием мембранного фильтра 0,45 мкм.
Чистая среда в порошкообразном состоянии может быть получена посредством полного дегидратирования (высушивания) сред с помощью вакуумного испарителя.
Этанол добавляют к порошкообразной форме среды и осуществляют экстракцию этого раствора этанолом. Этот процесс повторяют 3 раза.
Для исследования того, может ли этанольный экстракт (A) индуцировать стадию спящей личинки, осуществляют исследования спящего состояния на червях, которых выращивают в среде S.
Таблица 1 показывает активность A относительно индуцирования спящего состояния. Если А демонстрирует активность в плане индуцирования спящего состояния, ее дополнительно экстрагируют этилацетатом. Вкратце, высушенную А растворяют в дважды дистиллированной воде и экстрагируют равным объемом этилацетата. Эту процедуру экстрагирования повторяют 5 раз.
Таблица 2 показывает результат анализа этилацетатного экстракта (B) на активность относительно индуцирования спящего состояния C.elegans. После подтверждения активности B относительно индуцирования спящего состояния, экстракты, полученные с помощью описанного выше способа, загружают в адсорбционную колонку с силикагелем, которую уравновешивают гексаном:этилацетатом:метанолом = 7:7:1. Активную форму феромона спящего состояния (C), которая адсорбировалась на колонке, элюируют метанолом.
Таблица 3 сводит вместе результаты анализов индуцирования спящего состояния с помощью фракции (C), полученной на колонке с силикагелем. Для дальнейшей очистки C осуществляют разделение посредством ВЭЖХ с использованием колонки с аминными группами. Вкратце, фракция C растворяется в метаноле и разбавляется дважды дистиллированной водой (MeOH:ddH2O = 1:1). Этот раствор, содержащий C, загружается в колонку с аминными группами, которая уравновешивается с помощью раствора изопропанола (изопропанол:вода=1:1). Фракция феромона спящего состояния, связанная с колонкой (фракция D), элюируется с помощью градиентного раствора этого же растворителя. Таблица 4 показывает картину зависимости профиля элюирования от времени, полученную с помощью хроматографии на колонке с аминными группами.
Таблица 5 кратко описывает результат анализа индуцирования спящего состояния с использованием активных фракций D после хроматографии на колонке с аминными группами. Наконец, феромон спящего состояния (E) полностью выделяется и очищается с помощью эксклюзионной колоночной хроматографии (разделения по размерам молекул), с использованием метанола в качестве раствора элюента.
Таблица 6 сводит вместе результаты анализа активности индуцирования спящего состояния очищенного Дауэр-феромона. Чистый феромон спящего состояния, характеризуемый с помощью описанных выше процедур, определяется как структурная формула I, а его химическая формула представляет собой 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту или ее натриевую соль.
6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановая кислота может взаимодействовать с основанием, с получением ее соли своей формы. Основание может быть основанием, образующим соль щелочного или щелочноземельного металла, которая является фармацевтически приемлемой. Например, в качестве основания, могут использоваться натрий, калий, магний или кальций.
Молекулярная масса чистого феромона спящего состояния, 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановой кислоты, равна 276 Дальтон, а ее молекулярная формула представляет собой C13H24O6. Однако молекулярная масса его выделенной формы оказывается равной 299 Дальтон, поскольку связывается с 1 молекулой натрия посредством нековалентной связи, чтобы он проявлял биологическую активность.
Различие в молекулярной массе между чистой формой и выделенной обнаруживается при анализе с помощью квадрупольного тандемного масс-спектрометра, согласно которому 1 молекула натрия нековалентно связывается с кислотной формой. В дополнение к этому, очищенное соединение феромона, 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановая кислота, также может принимать форму аммониевой соли, что приводит к подтверждению ее молекулярной массы, равной 276 Дальтон.
Для определения химической структуры феромона по настоящему изобретению, имеющего формулу I, анализируют спектр водородного ядерного магнитного резонанса (1H-ЯМР), с использованием дейтерированного метанола (CD3OD) в качестве растворителя. И спектр углеродного ядерного магнитного резонанса (13C-ЯМР) также может анализироваться с использованием дейтерированного метанола (CD3OD) в качестве растворителя.
Химический сдвиг представлен с помощью единиц м.д. Определенные химические сдвиги 1H- и 13C-ЯМР получают с помощью методики двухмерного ЯМР, такой как спектры 1H-1H DQF-COSY, 13C-1H HMBC. Результаты представлены в таблице 7. То есть, результат анализа спектров 1H ЯМР (МГц), 13C ЯМР (МГц) феромона спящего состояния подтверждает, что его молекулярная формула представляет собой 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту.
Промышленная применимость
Как описано выше, по настоящему изобретению, авторам удалось получить новый феромон спящего состояния из C.elegans и определить его химическую структуру как 6-(3,5-дигидрокси-6-метилтетрагидропиран-2-илокси)гептановую кислоту, которая может существовать в форме ее различных солей. Так изобретение авторов может привести к исследованиям старения, передачи сигнала, стресса, метаболизма, ожирения и неврологических расстройств. Кроме того, настоящее изобретение приводит авторов к разработке молекул - кандидатов в фармакологически полезные лекарственные средства для многочисленных типов заболеваний.
(мл/мин)
(%)
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
6R-(3,6-ДИДЕЗОКСИ-L-АРАБИНОГЕКСОПИРАНОЗИЛОКСИ)ГЕПТАНОВАЯ КИСЛОТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ СО СТАРЕНИЕМ И СТРЕССОМ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ | 2004 |
|
RU2320653C2 |
ПРОИЗВОДНЫЕ АРИЛПИРРОЛА И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 1990 |
|
RU2037485C1 |
ПРИМЕНЕНИЕ НЕОМЫЛЯЕМОГО ЭКСТРАКТА РАСТИТЕЛЬНОЙ ПУЛЬПЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СТАРЕНИЯ КОЖИ | 2006 |
|
RU2428170C2 |
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОИЗВОДНОЕ ВЕРБЕНОЛА, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ | 2013 |
|
RU2611349C2 |
СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО КОЛОНИИ ГРАНУЛОЦИТОВ, ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ Е. COLI | 2011 |
|
RU2596408C2 |
ПЕСТИЦИДНЫЕ КОМПОЗИЦИИ | 2010 |
|
RU2525312C2 |
ТИАЗОЛО [5, 4-d] ПИРИМИДИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ АГРОХИМИЧЕСКИХ СРЕДСТВ | 2011 |
|
RU2547721C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (3S,4S)-4-((R)-2-(БЕНЗИЛОКСИ)ТРИДЕЦИЛ)-3-ГЕКСИЛ-2-ОКСЕТАНОНА И ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ ЭТОГО НОВОГО ПРОМЕЖУТОЧНОГО СОЕДИНЕНИЯ | 2009 |
|
RU2471790C1 |
КРИСТАЛЛИЧЕСКИЕ ФОРМЫ VI И VII КАЛЬЦИЕВОЙ СОЛИ АТОРВАСТАТИНА | 2002 |
|
RU2304139C2 |
ГЕКСАГИДРОНАФТАЛИНОВЫЕ СЛОЖНОЭФИРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1993 |
|
RU2104997C1 |
Настоящее изобретение относится к новому фармакологически активному соединению нового дауэр-феромона спящего состояния, имеющего следующую структурную формулу I:
и способу его выделения и очистки, а также определению структуры этого вещества, который заключается в том, что приготавливается этанольный экстракт, путем концентрирования жидкой среды в целом этанолом, после культурирования C.elegans на жидкой базальной S.среде, а затем эта этанольная фракция дополнительно экстрагируется этилацетатом. Затем примеси удаляются из этилацетатного экстракта путем адсорбционной хроматографии на силикагеле, и экстракт феромона выделяется и очищается с помощью хроматографических процедур на колонке с аминными группами, с использованием различных растворителей в качестве элюентов. Затем соединение феромона полностью выделяется и характеризуется посредством эксклюзионной ВЭЖХ. Это соединение применяется для передачи спящего состояния. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 8 ил., 7 табл.
или его соли.
,
включающий стадии:
экстрагирования всей культуральной среды С. elegans этанолом (фракция А);
экстрагирования фракции А этилацетатом, с получением фракции В после растворения этанольного экстракта в воде;
удаления примесей из фракции В посредством адсорбционной хроматографии на силикагеле (фракция С);
выделения и очистки фракции С посредством ВЭЖХ с использованием колонки с аминными группами, с получением фракции D; и
полной очистки фракции D с получением чистого соединения феромона спящего состояния с помощью дополнительной колоночной ВЭЖХ для разделения (исключения) молекул по размерам.
для передачи сигнала спящего состояния.
Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
YOSHIKAWA KAZUKO ET AL, J | |||
of Natural Products, 1998, 61(4), p.440-445 | |||
Устройство для контроля смазки реверсивного пневмодвигателя | 1960 |
|
SU136131A1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2-АРОКСИДИГАЛОИДТЕТРАГИДРОПИРАНОВ | 0 |
|
SU218197A1 |
Авторы
Даты
2007-07-27—Публикация
2003-10-07—Подача