СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕНАТУРИРОВАННЫХ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ Российский патент 2007 года по МПК C07K1/02 

Изобретение относится к биотехнологии, генной и белковой инженерии, а именно к способу ренатурирования мембранных белков, которые могут найти применение в получении новых лекарственных препаратов.

Известно, что около четверти генома прокариотов и эукариотов кодируют мембранные белки [Wallin, E., von Heijne, G. 1998. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science 7: 1029-1038]. Многие из этих белков находятся в плазматической мембране и обеспечивают обмен информацией и веществами между цитозолем и внеклеточной средой. Нарушения в функционировании мембранных белков приводят к возникновению и развитию различных паталогий, таких как диабет, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и другие. Действие многих современных лекарств направлено на мембранные белки-мишени, в первую очередь мембранные рецепторы и ионные каналы. Полученные в нативном виде такого рода белки используются для создания биосенсоров для скрининга лекарственных препаратов [Patent PCT № WO 2004079337, МКЛ G01N, опубл. 16:09:2004]. Кроме того, для целенаправленного создания новых классов лекарств необходимо знание пространственной структуры мембранных белков, что позволяет использовать для поиска высокоэффективных лигандов мембранных белков современные технологии in silico. Однако на сегодняшний день количество мембранных белков, полученных в нативном виде и, как следствие этого, данные о пространственной структуре этих белков ограничены.

В первую очередь это обусловлено с трудностью получения мембранных белков в нативном виде. Большинство мембранных белков невозможно выделить в достаточных количествах из их нативного окружения, так как мембранные белки обычно присутствуют в биологических мембранах в низкой концентрации. Возможный путь решения этой проблемы состоит в экспрессии мембранных белков в бактериальных клетках и последующей экстракции белков из мембран. Однако этот подход зачастую не приносит желаемых результатов из-за токсичности экспрессируемых мембранных белков. Экспрессия мембранных белков в тельца включения позволяет решить эту проблему. При этом требуется ренатурация (рефолдинг) мембранных белков в нативную структуру in vitro путем солюбилизации мембранных белков в мицеллах, бицеллах или липидных бислоях [Kiefer, Н. 2003 In vitro folding of alpha-helical membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta 1610: 57-62]. К настоящему времени не существует универсальных приемов рефолдинга мембранных. Особую сложность представляет собой рефолдинг олигомерных мембранных белков, к которым относится большинство рецепторов и ионных каналов.

Известен способ ренатурации мембранных белков, полученных из телец включения, путем последовательной замены детергентов в мицеллярном окружении мембранных белков [Patent EP №1359155, МКЛ С07K 1/113, опубл. 05:11:2003]. Однако такой подход имеет серьезные ограничения в случае ренатурации олигомерных мембранных белков, так как в случае мицеллярных систем межмолекулярные белок-белковые контакты затруднены. Как следствие этого, эффективность олигомеризации падает.

Известен способ ренатурации мембранного белка KcsA из бактерии Streptomyces lividans в нативную тетрамерную форму непосредственным включением биосинтезируемого белка в фосфолипидные везикулы [van Dalen, A. et al. 2002. Influence of lipids on membrane assembly and stability of the potassium channel KcsA. Febs Lett. 525: 33-38]. Однако данный способ является трудоемким и выход тетрамера не превышает 30%.

Известен наиболее близкий к заявляемому способ, основанный на включении мембранного белка KcsA в искусственные липидные бислои [Valiyaveetil, F.I. et al., 2002. Lipids in the structure, folding, and function of the KcsA K + channel. Biochemistry 41: 10771-10777]. Способ включает стадии солюбилизации денатурированного белка детергентом, формирования смешанных белок/детергент/фосфолипид мицелл, удаления детергента диализом и получения искусственных липосом. Однако при данном подходе выход тетрамера KcsA составляет величины 25-30% вне зависимости от типа использовавшихся фосфолипидов. Кроме того, в данном способе получения липосом невозможно полностью исключить из бислоев детергент, который может ингибировать образование олигомеров мембранных белков.

Изобретение решает задачу получения ренатурированных мембранных белков с высоким выходом.

Поставленная задача решается за счет того, что способ получения ренатурированных мембранных белков включает получение гомогенного раствора мембранного белка и фосфолипида или смеси фосфолипидов в смеси органических растворителей или смеси органического растворителя и воды, удаление растворителей и полное гидратирование полученной липид-белковой смеси.

Способ осуществляют следующим образом.

Мембранный белок KcsA из бактерии Streptomyces lividans получают любым известным способом, например, экспрессией в Е. coli и последующей экстракцией детергентом из внутренней мембраны Е. coli. Удаление детергента осуществляют диализом против буфера, не содержащего детергент. Осадок белка промывают водой и растворяют в органическом растворителе. По данным спектроскопии КД (фиг.1), в трифторэтаноле KcsA формирует вторичную структуру, которая представлена на 60% альфа-спиралями, аналогично нативному тетрамеру KcsA.

Гомогенный раствор белка и фосфолипида или смеси фосфолипидов получают смешиванием раствора KcsA с раствором фосфолипида или смеси фосфолипидов в смеси органических растворителей. Растворители удаляют в вакууме при температурах, исключающих кристаллизацию белка и фосфолипидов. Гомогенные смеси белка и фосфолипидов получают также их растворением в смеси вода/органический растворитель, быстрого замораживания раствора и удаления растворителей лиофилизацией.

Сухую фосфолипид-белоковую смесь гидратируют водой или буфером, содержащим KCl или другие соли, что приводит к образованию мультиламеллярных липосом. При необходимости, обмен белковыми и фосфолипидными молекулами между отдельными бислоями и липосомами обеспечивают циклами замораживания оттаивания белок-фосфолипидных дисперсий. В случае насыщенных фосфолипидов или их смесей с температурой фазового перехода выше 0°С, изменение толщины бислоя достигают инкубациями при температурах выше и ниже фазового перехода. Контроль за тетрамеризацией KcsA осуществляют с помощью гель-электрофореза, мономер KcsA соответствует полосе с молекулярной массой 18.6 кД, а тетрамер - 74.4 кД (фиг.2).

Заявляемый способ позволяет осуществлять ренатурацию мембранного белка KcsA в нативную тетрамерную форму с практически количественными выходами.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Получение ренатурированного тетрамера мембранного белка KcsA.

Хромосомную ДНК Streptomyces lividans выделяют из мицеллия Streptomyces lividans 66 [Rascher, A. et al. 2003. Cloning and characterization of a gene cluster for geldanamycin production in Streptomyces hygroscopicus. FEMS Microbiology Lett. 218: 223-230]. Амплификацию гена KcsA проводят на приборе DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus, Швеция) методом полимеразной цепной реакции на матрице хромосомной ДНК Streptomyces lividans с помощью химически синтезированных олигонуклеотидных праймеров KsF1 и KsR1:

KsF1, 5'-GGAGTGGCCGAAGGAGTGAA;

KsR1, 5'-GAACGTGCAAATGATGATCTTG.

Структура праймеров соответствует участкам хромосомной ДНК S. lividans в области SphI-SphI-SphI фрагмента, включающего последовательность гена KcsA (EMBL GenBank, accession number Z37969). Реакционная смесь объемом 100 мкл содержит 20 мМ Трис-HCl, рН 8.8 при 25°С, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 10 мМ KCl, 2 мМ MgSO₄, 0.1% Тритон X-100, 0.1 мг/мл, BSA 0.1 мкг хромосомной ДНК, по 100 пмолей каждого праймера, по 0.2 мМ dATP, dTTP, dCTP и dGTP и 2.5 единиц активности Pfu-полимеразы (Fermentas, США). Режим реакции: 96°С/3 мин, затем 30 циклов 94°С/1 мин, 58°С/1 мин, 72°С/2 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле.

Фрагмент KsF1-KsR1 длиной 689 пар оснований клонируют в плазмиду pBluescript SK(+) (Statagene, США) по тупоконечному сайту рестриктазы SmaI. Нуклеотидную последовательность гена KcsA в составе полученной плазмиды pSK-KcsA подтверждают секвенированием с помощью стандартных М13 праймеров.

Ген, кодирующей белок KcsA с С-концевым гексагистидиновым тагом, клонируют в плазмиду pQEKcsA. Схема клонирования KcsA гена по сайтам рестриктаз SphI и BglII вектора pQE70 (Qiagen, США) представлена на фиг.3. На матрице pSK-KcsA в присутствии праймеров KseqF (5'-GTGGTGGTCCGTGGAGA) и KsR3 (5'-CTTCAGATCTGCGGTTGTCGTCGAGC)

синтезируют 3'-концевой фрагмент гена KcsA, в котором отсутствует терминирующий кодон. Реакционная смесь объемом 100 мкл содержит 20 мМ Трис-HCl, рН 8.8 при 25°С, 10 мМ (NH₄)₂SO₄, 10 мМ KCl, 2 мМ MgSO₄, 0.1% Тритон Х-100, 0.1 мг/мл BSA 0.01 мкг ДНК pSK-KcsA, по 100 пмолей каждого праймера, по 0.2 мМ dATP, dTTP, dCTP и dGTP и 2.5 единиц активности Pfu-полимеразы (Fermentas, США). Режим реакции: 96°С/3 мин, затем 25 циклов 94°С/30 с, 50°С/30 с, 72°С/1 мин. Полученный KseqF-KsR3 фрагмент гидролизуют рестриктазами BstEII и BglII, лигируют с 5'-концевым фрагментом гена SphI-BstEII и векторным фрагментом pQE70 SphI-BglII. Лигазная смесь объемом 20 мкл содержит 40 мМ Трис-HCl, рН 7.8, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотреит, 0.5 мМ АТР, 0.3 мкг плазмидной ДНК, по 0.1 мкг фрагментов, 1 ед. акт. Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 1 час при 20°С, трансформируют компетентные клетки XL-1 и высевают на чашки с питательным агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученные клоны выращивают в жидкой среде LB, ДНК клонов выделяют и структуру полученной плазмиды pQEKcsA подтверждают рестриктным анализом и секвенированием с помощью прямого и обратного праймеров pqe2 и pqe4 (Qiagen, США). Полученная плазмида pQEKcsA кодирует рекомбинантный белок KcsA-6xHis, в котором между природной а.к. последовательностью KcsA и His-tag присутствует аминокислотный остаток серина. Расчетный молекулярный вес KcsA-6xHis (мономера) составляет 18,6 кДа.

Рекомбинантный белок KcsA-6xHis выделяют из биомассы клеток XL-1. Клетки, полученные после выращивания 0.5 л культуры, суспендируют в 6.5 мл буфера А, содержащего 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 50 mM Tris, pH 7,5, прибавляют 100 мкл раствора лизоцима (30 мг/мл) и 60 мкл 0.1 М PMSF. Смесь инкубируют в ледяной бане в течение 20 мин, затем озвучивают на приборе Soniprep импульсами по 20 с (всего 5 мин). Между импульсами смесь охлаждают по 2 мин с перемешиванием. Суспензию центрифугируют на центрифуге J2-21, ротор JA-20 (Beckman, США), при 10000 g в течение 25 мин. Осадок сохраняют в ледяной бане, а супернатант центрифугируют на центрифуге L8-55, ротор Ti-60 (Beckman, США), 1 час при 80000 g. Осадки, полученные после первого и второго центрифугирования, суспендируют в 18 мл буфера В, pH 7.0 (0.1 М NaPO₄, 5 mM KCl), содержащего 15 мМ додецилмальтозида, и перемешивают в течение 6 часов при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют на центрифуге L8-55, ротор Ti-60 (Beckman, США) 1 час при 80000 g. К супернатанту прибавляют равный объем буфера В, pH 8.0, и по каплям при перемешивании 8,5 мл раствора 0.5 М Na₂HPO₄ до значения pH около 7.8. Раствор наносят на колонку Ni-NTA (Qiagen, США) объемом 1 мл, уравновешенную буфером В, pH 8.0, содержащим 5 мМ додецилмальтозида. Колонку промывают 8 мл буфера В, pH 7.8, содержащего 5 мМ додецилмальтозида, 50 мМ имидазола. Белок элюируют 4 мл буфера В, рН 7.0, содержащего 5 мМ додецилмальтозида, 400 мМ имидазола. Выход белка 12 мг с 1 литра культуральной жидкости.

Раствор белка (3 мг/мл) объемом 1 мл, полученный после элюции с колонки Ni-NTA и содержащий 0.1 М NaPO₄, 5 mM KCl, 5 мМ додецилмальтозида, 400 мМ имидазола, диализуют в Eluta Tube (Fermentas, США) против 2 раза по 100 мл 50 мМ Na-глицинового буфера в отсутствие детергента при значении рН 9.5, приближенном к значению изоэлектрической точке белка (pI 10.4). В процессе 20-ти часового диализа KcsA-Hisx6 выпдает в осадок в виде мономера. Осадок промывают 3 раза 1 мл дистиллированной водой и растворяют в трифторэтаноле.

Содержание элементов вторичной структуры калиевого канала KcsA в трифторэтаноле определяют методом КД. Спектры КД измеряют с помощью спектрополяриметра J-810 (Jasco, Япония) в кювете с длиной оптического пути 0,01 см в диапазоне длин волн 190-250 нм с шагом 1 нм. Концентрация белка составляет 3 мг/мл. Спектр КД приведен на фиг.2. Оценку содержания элементов вторичной структуры проводят по программе CDSSTR [Whitmore, L., Wallace, B.A. 2004 DICHROWEB, an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data. Nucleic Acids Res. 32: W668-W673]. Содержание элементов вторичной структуры для калиевого канала KcsA в трифторэтаноле: α-спираль - 59%; β-структура 19%; β-изгиб - 5%; неупорядоченная структура - 17%. Анализ полученных данных показывает, что в трифторэтаноле KcsA формирует альфа-спиральную конформацию, аналогично нативному тетрамеру.

Ренатурирование KcsA проводят в составе липосом. 1,2-Диолеоилфосфатидил-этаноламин (Avanti Polar Lipids, США) растворяют в смеси хлороформ/ метанол, 2:1 (по объему). Концентрация фосфолипида составляет 10 мг/мл. 1,2-Диолеоилфосфатидил-глицерин (Avanti Polar Lipids, США) растворяют в смеси хлороформ/метанол, 2:1 (по объему). Концентрация фосфолипида составляет 10 мг/мл. Мембранный белок KcsA растворяют в трифторэтаноле. Концентрация белка 3 мг/мл. Растворы фосфолипидов и белка смешивают в мольном соотношении KcsA: 1,2-диолеоилфосфатидилэтаноламин: 1,2-диолеоилфосфатидилглицерин, 1:200:200. Растворители удаляют в вакууме на приборе SPD1010 SpeedVac (Thermo Savant, США) при 45°С. Полученную белок/фосфолипидную пленку оставляют в вакууме (0.5 мм рт.ст.) на ночь. Высушенную пленку гидратируют буфером (50 мМ Трис, 15 мМ KCl, рН 7,5). Концентрация фосфолипидов 25 мг/мл. Водную белок/фосфолипидную дисперсию подвергают 10 циклам замораживания/оттаивания. Замораживание проводят в жидком азоте, оттаивание - при 30°С и встряхивании в термостате Thermomixer comfort (Eppendorf, Германия). Образование тетрамера KcsA контролируют с помощью гель-электрофореза в SDS-ПААГ [Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685]. Смешивают 5 мкл липосомальной дисперсии, содержащей KcsA, и 5 мкл буфера UTB, содержащем 3% SDS, 20% глицерина, 2% меркаптоэтанола. Наносят на свежеприготовленный гель. Электрофорез проводят в вертикальной камере MiniProtean II (BioRad, США) в режиме 20 В/см, гель фиксируют в растворе 10% уксусной кислоты в течение 10 мин и окрашивают в течение 2 ч в растворе 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола с добавлением 0,1% Кумасси R-250. Гель отмывают в том же растворе без красителя в течение 4 часов. Выход тетрамера составляет 97%.

Пример 2.

Пример 2 проводят как пример 1, но включение KcsA в бислои проводят следующим образом: смешивают раствор KcsA в трифторэтаноле и раствор 1,2-диолеоилфосфатидилглицерина в смеси хлороформ/метанол, 2:1 (по объему). Мольное соотношение белок/фосфолипид, 1:300. Растворители удаляют в вакууме на приборе SPD1010 SpeedVac (ThermoSavant, США) при 45°С. Сухой остаток растворяют в смеси трифторэтанол/вода, 1:1 (по объему). Раствор замораживают в жидком азоте и растворители удаляют лиофилизацией. Полученный порошок смеси KcsA 1,2-диолеоилфосфатидилглицерина гидратируют буфером и подвергают обработке аналогично примеру 1. Концентрация фосфолипида составляет 20 мг/мл. Образование тетрамера KcsA контролируют с помощью гель-электрофореза. Выход тетрамера составляет 93%.

Пример 3.

Пример 3 проводят как пример 2, но гидратацию смеси KcsA и 1,2-диолеоилфосфатидилглицерина осуществляют водой. Образование тетрамера KcsA контролируют с помощью гель-электрофореза. Выход тетрамера составляет 92%.

Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Для ренатурации мембранного белка получают гомогенный раствор указанного белка и фосфолипида или смеси фосфолипидов в смеси органических растворителей или смеси органического растворителя и воды, затем растворители удаляют, а полученную смесь гидратируют. Применение изобретения обеспечивает высокий выход ренатурированного мембранного белка. 3 ил.

Способ получения ренатурированного мембранного белка, включающий получение гомогенного раствора мембранного белка и фосфолипида или смеси фосфолипидов в смеси органических растворителей или смеси органического растворителя и воды, удаление растворителей и полное гидратирование полученной фосфолипид-белковой смеси.