СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА A В ВОДЕ И СЛЮНЕ МЕТОДОМ ОТ-ПЦР Российский патент 2007 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области вирусологии, может быть использовано в эпидемиологическом надзоре за гепатитом А и научно-исследовательской работе для обнаружения вируса гепатита А.

Известны следующие способы определения вируса гепатита А (ВГА):

1. Метод иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ). Позволяет обнаружить в исследуемых образцах вирусные частицы вследствие обработки их сывороткой, содержащей антитела к вирусу гепатита А [А.Г.Анджапаридзе // Автореф. дис.... докт. мед. наук. - М., 1987. - 36 с.; В.М.Жданов с соавт. // Вирусные гепатиты. - М.: Медицина, 1986. - 256 с.]. ИЭМ был первым серологическим методом, успешно использованным для обнаружения и идентификации возбудителя гепатита А в материалах от больных. Однако порог чувствительности ИЭМ невысок (10⁴-10⁶ частиц в мл), к тому же метод требует для исполнения много времени, высокой квалификации сотрудников, для его проведения необходим электронный микроскоп высокого разрешения. После появления новых более практичных, таких как РИА и ИФА, ИЭМ постепенно утратил диагностическую значимость, но успешно может использоваться в научных целях для морфологической характеристики ВГА.

2. Радиоиммунный анализ (РИА) обладает высокой чувствительностью (0,01-10 нг/мл) и специфичностью при определении антигена вируса гепатита А (Аг ВГА) в клинических образцах, может использоваться при массовых исследованиях. [Н.В.Дорошенко // Автореф. дис.... канд. мед. наук. - М., 1981. - 25 с.; И.В.Шахгильдян // Автореф. дис.... докт. мед. наук. - М., 1980. - 56 с.]. Вместе с тем, для реализации метода необходимы дорогостоящая аппаратура, специальные помещения и условия при работе с радиоизотопами, он не позволяет определять вирусную частицу, что ограничивает его применение в практической медицине.

3. Иммуноферментный метод (ИФА). В образцах клинического материала или объектов окружающей среды проводят детекцию антигена вируса (Аг ВГА). [М.Д.Алейник с соавт. // Вирусные гепатиты. - М., 1980. - С.69-73.; М.С.Балаян // Вирусный гепатит А. Научный обзор. - М., 1983. - 69 с.; Т.Н.Быстрова // Автореф. дисс.... докт. мед. наук. - М., 1999, - 50 с.] ИФА получил широкое применение в лабораторной диагностике ГА и эпидемиологических исследованиях. Метод позволяет определять АгВГА в количестве 0,01-10 нг/мл, характеризуется доступностью, простотой проведения, получением результата в короткие сроки, обеспечивается выпуском отечественных коммерческих тест-систем, что позволяет использовать его для массовых исследований. Но при этом ИФА обладает относительно низкой чувствительностью по сравнению с методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции и не позволяет обнаруживать вирусную частицу.

Наиболее близким предлагаемому изобретению (прототипом) является метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР), который позволяет определять отдельные фрагменты нуклеиновой кислоты вируса гепатита А (РНК ВГА) с помощью специфических праймеров [А.И.Глухов с соавт. // ЖМЭИ. - 2004. - №4. - с.50-54]. ОТ-ПЦР по сравнению со всеми известными на сегодняшний день методами определения ВГА обладает самой высокой чувствительностью. Важным обстоятельством является то, что наряду с лабораторными вариантами, предлагаемыми рядом исследователей, в ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (г.Москва) налажен выпуск коммерческой тест-системы для выявления РНК вируса гепатита А методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции, снабженной к тому же внутренним контрольным образцом (ВКО). Однако данная тест-система предназначена для выявления ВГА в сыворотке крови.

Вместе с тем, предварительные опыты показали принципиальную возможность использования метода ОТ-ПЦР для исследования водных концентратов и слюны. Способ осуществляется следующим образом: пробы речной воды, предварительно сконцентрированные с помощью используемых в практике способов концентрирования вируса гепатита А (далее концентраты речной воды), и образцы слюны, полученные от больных гепатитом А, исследовали методом ОТ-ПЦР с применением тест-системы «АмплиСенс HAV-430» согласно инструкции в четыре этапа, включающие выделение РНК; получение комплементарной ДНК (кДНК) на матрице РНК - реакция обратной транскрипции (ОТ); амплификацию участка кДНК - полимеразная цепная реакция (ПЦР); электрофоретический анализ продуктов ПЦР с учетом результатов ПЦР-анализа. По результатам анализа в ряде проб отсутствовали как специфические полосы, так и сигнал ВКО, что свидетельствовало об ингибировании ОТ-ПЦР. Утверждать о наличии вируса или отсутствии его в пробе не представлялось возможным в связи с получением ложноотрицательного результата исследования.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при обнаружения вируса гепатита А (ВГА) в водных концентратах и слюне.

Сущность изобретения заключается в том, что исследуемые субстраты (концентраты речной воды и слюну) подвергают предварительной обработке, обеспечивающей устранение ингибирования обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при определении РНК ВГА.

Предварительная обработка заключается в следующем:

В микропробирки вносят исследуемые субстраты (концентрат речной воды или слюна), центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин, супернатант (С №1) отбирают в микропробирки, к осадку добавляют стерильную тридистиллированную воду в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивают на вортексе, прогревают в термостате при 60°С 3 мин, повторно перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин, супернатант (С №2) отбирают и объединяют с супернатантом, полученным после первого центрифугирования. Затем в обработанных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР (по прототипу), руководствуясь инструкцией к тест-системе «АмплиСенс HAV-430» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Предварительная обработка при определении РНК вируса гепатита А в воде.

Отбирают те концентраты речной воды, в которых ранее отмечалось ингибирование ОТ-ПЦР. Все образцы предварительно обрабатывают предлагаемым способом: в микропробирки вносят исследуемые субстраты (концентраты речной воды), центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин (10 мин - предпочтительнее), супернатант (С №1) отбирают в микропробирки, к осадку добавляют стерильную тридистиллированную воду в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивают на вортексе, прогревают в термостате при 60°С 3 мин, повторно перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин (10 мин - предпочтительнее), супернатант (С №2) отбирают и объединяют с супернатантом, полученным после первого центрифугирования. Затем в обработанных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР по прототипу, руководствуясь инструкцией к тест-системе «АмплиСенс HAV-430» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва.

По результатам исследования двадцати проб воды во всех присутствовал сигнал ВКО, к тому же в трех из них была обнаружена РНК ВГА, что составило 15,0±7,9%.

Пример 2. Предварительная обработка при определении РНК вируса гепатита А в слюне

Образцы слюны, в которых ранее отмечалось ингибирование ОТ-ПЦР, предварительно обрабатывают предлагаемым способом: в микропробирки вносят исследуемые субстраты (слюна), центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин (10 мин - предпочтительнее), супернатант (С №1) отбирают в микропробирки, к осадку добавляют стерильную тридистиллированную воду в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивают на вортексе, прогревают в термостате при 60°С 3 мин, повторно перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5-10 мин (10 мин - предпочтительнее), супернатант (С №2) отбирают и объединяют с супернатантом, полученным после первого центрифугирования. Затем в обработанных предлагаемым способом пробах проводят определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР по прототипу, руководствуясь инструкцией к тест-системе «АмплиСенс HAV-430» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г.Москва.

По результатам исследования пятидесяти шести проб слюны во всех присутствовал сигнал ВКО, а в тринадцати из них была обнаружена РНК ВГА, что составило 23,2±5,6%.

Способ разработан и апробирован в лаборатории эпидемиологии вирусных гепатитов ФГУН ННИИЭМ им. акад. И.Н.Блохиной Роспотребнадзора.

Предлагаемый способ определения РНК вируса гепатита А с помощью предварительной обработки исследуемых субстратов (концентраты речной воды и слюна) позволяет устранить ингибирование ОТ-ПЦР, увеличить степень эффективности и надежности выявления вируса гепатита А и тем самьм повысить чувствительность и специфичность использованного метода.

Так, при определении РНК ВГА по прототипу отмечается ингибирование ОТ-ПЦР в 95,5±3,1% образцов слюны и 81,8±3,5% воды. В связи с этим утверждать о наличии вируса или отсутствии его в пробе не представляется возможным. Предлагаемый способ путем поэтапного выполнения всех признаков, перечисленных в формуле, позволяет устранить ингибирование ОТ-ПЦР за счет удаления посторонних примесей в исходной пробе и эффекта разбавления. Например, на чертеже представлена полученная электрофореграмма, которая свидетельствует об эффективности использования предлагаемого способа при исследовании слюны.

В целом по результатам исследования предлагаемым способом проб, в которых ранее отмечалось ингибирование ОТ-ПЦР, сигнал ВКО присутствует во всех 20 исследованных образцах воды (100%) и 53 из 56 проб слюны (94,6%). К тому же РНК ВГА обнаружена в 3 пробах воды (15,0±7,9%) и в 13 образцах слюны (23,2±5,6%).

Таким образом, использование предлагаемого способа для определения РНК ВГА в воде и слюне позволяет устранить ингибирование ОТ-ПЦР и объективно оценить полученные результаты исследования как «положительные» или «отрицательные».

Изобретение относится к области вирусологии и направлено на совершенствование методов индикации вируса гепатита А. Исследуемые субстраты (концентраты речной воды и слюну) подвергают предварительной обработке, обеспечивающей устранение ингибирования обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при определении РНК ВГА. Предварительная обработка водных концентратов и слюны включает центрифугирование при 12.000 об/мин в течение 5-10 мин, отбор супернатанта, добавление к осадку стерильной тридистиллированной воды в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивание на вортексе, прогревание до 60°С 3 мин, повторное перемешивание и центрифугирование с последующим объединением полученного супернатанта с первым для последующей детекции РНК вируса гепатита А методом ОТ-ПЦР. Предлагаемый способ определения РНК вируса гепатита А с помощью предварительной обработки исследуемых субстратов (концентраты воды и слюна) позволяет устранить ингибирование ОТ-ПЦР, увеличить степень эффективности и надежности выявления вируса гепатита А и тем самым повысить чувствительность и специфичность использованного метода. 1 ил.

Способ определения РНК вируса гепатита А в воде и слюне методом ОТ-ПЦР, отличающийся тем, что исследуемые субстраты подвергают предварительной обработке, включающей центрифугирование при 12.000 об/мин в течение 5-10 мин, отбор супернатанта, добавление к осадку стерильной тридистиллированной воды в исходном объеме исследуемого субстрата, перемешивание на вортексе, прогревание до 60°С 3 мин, повторное перемешивание и центрифугирование с последующим объединением полученного супернатанта с первым для последующей детекции РНК вируса гепатита А.