СПОСОБ КЛОНИРОВАНИЯ IN VITRO РЕГИОНАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2007 года по МПК A61K35/39 C12N5/02 A61P5/50 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Известно большое количество способов культивирования in vitro клеточных элементов многих тканей в культуральных средах различного состава, с различными добавками, при этом чаще всего используют инкубацию клеточного материала в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха [1, 2].

Однако недостатком существующих способов является то, что их использование не дает возможности клонировать in vitro регионарные стволовые клетки поджелудочной железы.

Разработка данного способа является актуальной задачей, решение которой необходимо для научных целей: проведения фундаментальных исследований по изучению пролиферативно-дифференцировочного баланса регионарных стволовых клеток in situ в поджелудочной железе и закономерностей их функционирования и жизнедеятельности, а также для поиска и создания лекарственных средств, способных влиять на функциональную активность данной фракции резидентных клоногенных клеточных элементов железистой ткани с целью повышения эффективности терапии заболеваний поджелудочной железы и, в первую очередь, сахарного диабета различного генеза.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Поставленная задача достигается тем, что диссоциацию ткани поджелудочной железы лабораторных животных проводят с помощью гомогенизатора, а в раствор добавляют вещество с антипротеазной активностью. В качестве вещества с антипротеазной активностью используют контрикал. Полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду и инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут. Культуральная среда имеет следующий, предлагаемый нами состав: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов,.

Новым в предлагаемом способе является использование веществ с антипротеазной активностью в ходе механической диссоциации ткани поджелудочной железы и состав культуральной среды.

Заболевания поджелудочной железы являются весьма распространенными во всем мире и занимают значительное место в структуре заболеваемости и инвалидности населения нашей страны. Особую опасность для здоровья и социальную значимость патологии данного органа представляет сахарный диабет. При этом, несмотря на то, что существует значительное количество медикаментозных средств лечения данного заболевания, на сегодняшний день нет способов радикального излечения от его различных форм. Пациентам приходится постоянно, в течение всей жизни, принимать заместительную терапию либо другие сахароснижающие препараты. Кроме того, весьма сложно и далеко не всегда с успехом проводится лечение недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Вместе с тем, благодаря современному развитию клеточных технологий и связанному с этим обнаружению в различных органах резидентных мультипотентных стволовых клеток (назначением которых является регенерация тканей в ответ на физиологическую убыль клеток либо их гибель, вызванную повреждающим фактором) [3], появилась возможность поиска новых путей разработки патогенетически обоснованных методов лечения заболеваний поджелудочной железы [4], основанных на стимуляции функций стволовых клеток. Однако, как было описано выше, для разработки таких методов необходим способ клонирования регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, позволяющий в условиях in vitro изучать действие на них различных препаратов и веществ.

Факт применения культуральной среды из используемых компонентов и их концентрация, в том числе добавление в среду указанной совокупности полифункциональных цитокинов, представляющих собой раннедействующие факторы роста с разнонаправленными механизмами действия на функциональное состояние клеточных элементов, и использование вещества с антипротеазной активностью в ходе механической диссоциации ткани поджелудочной железы с достижением нового результата: создание способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, для специалиста является неочевидным.

Используемый в предлагаемом изобретении способ диссоциации ткани поджелудочной железы и состав среды в совокупности являются оптимальными для клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют клонировать in vitro регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей

На фиг.1 А - ацинусоподобные образования на фоне гетерогенных клеточных элементов, выросшие на 14-е сут культивирования (нативный препарат), ув. 250 х; на фиг.1 Б - ацинусоподобное образование, выросшее на 21-е сут культивирования (нативный препарат), ув. 600 х.

На фиг.2 - ацинусоподобное образование, выросшее на 21-е сут культивирования, окр. азур II-эозин, ув. 600 х.

Способ осуществляют следующим образом.

Поджелудочную железу лабораторных животных (мышей) помещают в гомогенизатор с питательной средой, содержащей 5 ЕД/мл контрикала, и гомогенизируют до получения однородной клеточной взвеси, которую после фильтрации через капроновую сеточку помещают в культуральную среду следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов и инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 27 шт. массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

Способ осуществляют следующим образом. У мыши линии СВА/CaLac массой 20 г, умерщвленной с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) извлекали поджелудочную железу. Поджелудочную железу отмывали от эритроцитов в физиологическом растворе. Затем ее помещали в гомогенизатор с питательной средой DMEM, содержащей 5 ЕД/мл контрикала, и гомогенизировали до получения однородной клеточной взвеси при комнатной температуре. После этого клеточный материал фильтровали через капроновую сеточку для удаления крупных агрегатов, дважды отмывали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 5-10 мин и подсчитывали общее количество нуклеаров, определяя их жизнеспособность с помощью трипанового синего. Затем клетки помещали в среду следующего состава: 80% DMEM ("Serva", ФРГ), 20% неинактивированной ЭТС ("Sigma", США), 10 г/ л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Biochemie", Австрия), 50 мг/л свиного многокомпонентного инсулина ("Novo Nordisk", Дания), 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток ("Sigma", США), 30 нг/мл эпидермального фактора роста ("Sigma", США), 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора ("Sigma", США), 10 нг/мл интерлейкина-6 ("Sigma", США), 10 нг/мл фактора роста фибробластов ("Sigma", США). Доводили концентрацию клеточных элементов до 200 тыс/мл и по 3 мл приготовленной взвеси помещали в пластиковые 6-луночные планшеты ("Costar", США). Культуру инкубировали в течение 14-21 сут в СО₂ инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха. После инкубации с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (ув.56х) подсчитывали число многоклеточных (более 30 клеток) ацинусоподобных образований (фиг.1). Проинкубированный клеточный материал в планшете фиксировали метанолом и окрашивали азур П-эозином в течение 30-40 мин, после чего препараты изучали под иммерсией (фиг.2). При этом инкубация в течение 14-и сут приводит лишь к началу образования в культуре отдельных, преимущественно не до конца сформированных ацинусоподобных структур. Продление инкубации до 21-х сут приводит к образованию не только полностью сформированных ацинусов, но и позволяет зачастую получить их сливной рост.

Предлагаемый способ позволяет in vitro клонировать регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и получать, помимо роста гетерогенных клеточных элементов, органоспецифический рост - ацинусоподобные многоклеточные образования, представляющие собой структурно-функциональные единицы железистой ткани.

Литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

2. Gritti A., Bonfanti L., Doetsch F., Caille I., Alvarez-BuyIla A., Daniel A. Lim, Galli R., Jose Manuel Garcia Verdugo, Daniel G. Herrera, Vescovi A.L. Multipotent Neural Stem Cells Reside into the Rostral Extension and Olfactory Bulb of Adult Rodents // J. Neuroscience. - 2002. - V.22. - P.437-445.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

4. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival // Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - V.98. - P.10344.

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы. Способ осуществляют путем диссоциации ткани поджелудочной железы лабораторных животных с помощью гомогенизатора. В раствор при гомогенизации добавляют вещество с антипротеазной активностью, в качестве которого используют контрикал, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов и инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 14-21 сут. Изобретение позволяет клонировать регионарные стволовые клетки поджелудочной железы и получать, помимо роста гетерогенных клеточных элементов, органоспецифический рост - ацинусоподобные многоклеточные образования, представляющие собой структурно-функциональные единицы железистой ткани. 2 ил.

Способ клонирования in vitro регионарных стволовых клеток поджелудочной железы, заключающийся в инкубировании клеток, помещенных в культуральную среду в СО₂-инкубатор при 37°С, 5% CO₂ и 100%-ной влажности воздуха, отличающийся тем, что при диссоциации ткани поджелудочной железы лабораторных животных с помощью гомогенизатора в раствор добавляют вещество с антипротеазной активностью, в качестве которого используют контрикал, затем полученные клеточные элементы помещают в культуральную среду и инкубируют в течение 14-21 сут, а в качестве культуральной среды используют смесь следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов.