Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент нейтральной протеиназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/50 C12N9/50 C12R1/19 

со со

р

|С

4

I Изобретение относится к биотехно- ; логии и представляет собой штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3697..

Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента протениазы специфически расщепляющей актин. I Протеиназа, полученная из штамма I Escherichia coli ВЮШ В-3697, рас- щепляет актин с образованием только одного фрагмента, не подвергающегося I дальнейшему расщеплению. Другие белки эта протеиназа не расщепляет. I Штамм Escherichia coli BKIM : В-3697 вьщелен из раствора, применяемого для вьщеления актина, н.а био- станции Восток Института биологии I моря Дальневосточного научного цент- ра АН СССР.

имеет следующую характеристику .

На различных средах штамм образу- |ет палочковидные клетки, располагающиеся поодиночно или в коротких цепочках. Палочка подвижна, имеет капсулу. Клетки грамотрицательны. Клетки растут на плотных и жидких средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта. Темпера- турный оптимум - 37 с, растут при 22 Яс, при 4 и 40°С роста нет.

Сохраняет жизнеспособность и ферментативную активность при хранении при 4°С. Разлагает глюкозу с обра- зованием кислоты и газа, индол и сероводород не образует.

Ферментирует мальтозу, маннит, сахарозу, сорбит, ксилозу, крахмал. Не разлагает дульцит, лактозу, рам- нозу, инозит, адонит, салицин, мочевину ,

Образует каталазу. Превращает нитраты в нитриты. Не патогенен.

Культивирование клеток Escherichia coli BKIIM В-3697 проводят в колбах емкостью 250-500 мл при 28 и 37°С в течение 2-7 сут. Среда для культивирования: триптический перевар бычьего сердца, плацентарный бульон (настой плаценты) или аминопептид, рН 7,0-7,2. В течение суток культура находится в логарифмической фазе роста, затем выходит на стационарную фазу. Конец культивирования определяют по максимуму эндогенной ферментативной активности, который достигается на 4-5 сут роста.

O 5 0

5 0

0

5

0

5

Ферментативную активность определяют по перевариванию актина. Бактерии разрушают ультразвуком или несколькими циклами замораживания - размораживания. Клеточный экстракт осветляют центрифугированием и добавляют к раствору актина. Смесь инкубируют при 20 С и подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

0величине ферментативной активности судят по интенсивности зоны на геле, соответствующей стабильному фрагменту актина с мол. массой 36 кД.

Пример 1. Для выращивания бактерий в колбу емкостью 500 мл, содержащую 250 мл настоя плаценты, вносят инокулят - суточную культуру E.coli (А-2) ВКПМ B-3697s выросшую на той же среде, из расчета 1 мл культуры на 100 мл свежей среды. Культивирование проводят в термостате при 37 с в течение 5 дней.

Ежедневно из колбы отбирают 10 мл бактериальной культуры для определения количества клеток и ферментативной активности. О количестве бактерий в отобраннЕлх пробах судят по оптической плотности суспензии приД 600 нм, количеству колоний, вьфосших кп твердой среде, и концентрации общего белка в бактериальном экстракте.

Для определения ферментативной акт ивности клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 20 мин, суспендируют в 3 мл раствора для экстракции актина (0,5 мМ -АТФ, 0,2 мМ CaClj, рН 7,5) и разрушают 3 циклами замораживания - размораживания. Полученный экстракт осветляют центрифугированием при 12000 об/ /мин в течение 40 мин.

К 1 мл раствора, содержащего актин, с концентрацией общего белка

1мг/мл добавляют равньй объем бактериального экстракта с концентрацией общего белка 1 мг/мл. Смесь инкубируют при 20 С в течение 1 ч и анализируют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. На злектрофо- реграмме видно, что исходный препарат актина содержит одну белковую зону. После добавления бактериального экстракта интенсивность этой зоны уменьшается, и в препарате появляется вторая зона, соответствующая фрагменту актина мол. массой 36 кД. Количество фрагмента при добавлении экстракта 1-суточной культуры 20% от количества актина. Экстракт 2-суточной культуры расщепляет 50% исходного актина. Полностью актин превращается во фрагмент при добавлении экстракта 4-суточной бактериальной культуры. Таким образом, бактерии штамма

из Escherichia coli ВКПМ 8-3697 1 мл бактериального экстракта, полученного по примеру 1, с концентрацией бел ка 1 мг/мл инкубируют с 1 мл разведенных в воде до концентрации 1 мг/м следующих белков: казеин, альбумин, овальбумин, лизоцим, РНКаза, гистон Н2В, тропомиозин, тропонины. С, I

Escherichia coll ВКПМ В-3697 синтези- д смеси инкубируют в течение 1 ч

при 20 С и в течение 1 сут при 4 С.

руют расщепляницую актин протеиназу на стационарной фазе роста культуры.

.П р и м е р 2. Для получения фрагмента актина и определения его стабильности инкубацию актина с бакте- |5 риапьным экстрактом из А-суточной культуры (как описано в примере 1) проводят в течение разных промежутков времени (от 40 мин до 24 ч). Продукты протеолиза так же, как в приме- 20 ре 1, анализируют электрофоретически.

На электрофореграмме видно, что при всех сроках инкубации образуется только один фрагмент актина с мол.

Результаты реакции анализируют элект рофоретически. В то время, как актин за 1 ч инкубации при 20 с полностью превращается во фрагмент с мол.нас-- сой 36 кД, другие белки не расщепляются. Это означает, что актин является единственным субстратом протеи- назы А-2. I

Таким образом, штамм Escherichia coli ВКПМ В-3697 является продуцентом протеиназы, специфически расщепляющей один из основных белков мьшц

массой 36 кД. Дополнительных зон при 25 и цитоскелета актин с образованием

из Escherichia coli ВКПМ 8-3697 1 мл бактериального экстракта, полученного по примеру 1, с концентрацией белка 1 мг/мл инкубируют с 1 мл разведенных в воде до концентрации 1 мг/мл следующих белков: казеин, альбумин, овальбумин, лизоцим, РНКаза, гистон Н2В, тропомиозин, тропонины. С, I

Результаты реакции анализируют электрофоретически. В то время, как актин за 1 ч инкубации при 20 с полностью превращается во фрагмент с мол.нас-- сой 36 кД, другие белки не расщепляются. Это означает, что актин является единственным субстратом протеи- назы А-2. I

Таким образом, штамм Escherichia coli ВКПМ В-3697 является продуцентом протеиназы, специфически расщепляющей один из основных белков мьшц

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новый штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3697. Цель изобретения - получение нового штамма - продуцента нейтральной протеиназы, специфически расщепляющей актин. Бактерии выращивают на средах, приготовленных на основе мясного настоя или экстракта. Максимальная протеолитическая активность достигается через 4-5 суток. Полученный фермент расщепляет актин с образованием только одного стабильного фрагмента с молекулярной массой 36 кД. Другие белки этим ферментом не расщепляются.

увеличении времени инкубации не образуется. Количество фрагмента при увеличении срока инкубации не уменьшается. Это означает, что фрагмент

стабилен и не деградирует на фрагмен-зд ления структуры актина и его свойств

ты меньшей молекулярной массы.

Таким «эбразом, при инкубации актина с протеиназой из бактериального штамма Escherichia coli ВКПМ В-3697 образуется один фрагмент актина, не подвергающийся дальнейшему проте- олизу.

П р и м е р 3. Для определения субстратной специфичности протеиназы

35

в составе сократительного аппарата клетки.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3697 - продуцент нейтральной протеиназы.

стабильного фрагмента с мол.массой 36 кД, что позволяет использовать этот штамм для получения протеиназы - удобного инструмента для опредев составе сократительного аппарата клетки.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-3697 - продуцент нейтральной протеиназы.