КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ РАКА ЛЕГКИХ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/17 A61K39/395 C07K14/47 C12N15/12 C12Q1/68 G01N33/574 

Техническая область изобретения

Настоящее изобретение главным образом относится к лечению и диагностике злокачественной опухоли, такой как рак легких. Изобретение, более определенно, относится к полипептидам, включающим по крайней мере часть белка опухоли легких, и к полинуклеотидам, кодирующим такие полипептиды. Такие полипептиды и полинуклеотиды применяются в фармацевтических композициях, например в вакцинах, и в других композициях для диагностики и лечения рака легких.

Предпосылки изобретения

Рак легких является основной причиной смерти от злокачественных опухолей в США как среди мужчин, так и среди женщин, причем, по оценкам, в 1994 году сообщали о 172000 новых случаях. Отношение выживших в течение пяти лет составляет только 13% среди всех пациентов с раком легких, независимо от стадии заболевания при диагностике. Это контрастирует с отношением выживших в течение пяти лет, равным 46%, среди случаев, выявленных в то время, когда заболевание пока было локализовано. Однако до распространения заболевания обнаруживают только 16% раков легких.

Раннее выявление затруднено, поскольку часто клинические симптомы не заметны до достижения заболеванием развернутой стадии. В настоящее время, в помощь диагностике применяют рентген грудной клетки, анализ типа клеток, содержащихся в мокроте, и исследование бронхиальных путей посредством волоконной оптики. Режимы лечения определяются типом и стадией заболевания, и включают хирургическое вмешательство, радиационную терапию и/или химиотерапию. Несмотря на значительные исследования, направленные на терапию заболевания, рак легких остается трудноизлечимым.

В соответствии с этим, в данной области остается необходимость в улучшенных вакцинах, способах лечения и способах диагностики рака легких.

Сущность изобретения

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полинуклеотидным композициям, выбранным из группы, включающей:

(а) последовательности, представленные SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420 422-424, 428-433 и 440-583;

(b) последовательности, комплементарные последовательностям SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583;

(с) последовательности, состоящие по крайней мере из 20 последовательных остатков последовательности, представленной SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420 422-424, 428-433 и 440-583;

(d) последовательности, которые гибридизуются с последовательностью, представленной SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583,

(e) последовательности, имеющие по крайней мере 75% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583;

(f) последовательности, имеющие по крайней мере 90% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583; и

(g) вырожденные варианты последовательности, представленной SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583.

В одном из предпочтительных осуществлений полинуклеотидные композиции по изобретению экспрессируются по крайней мере в 20%, предпочтительнее, по крайней мере в 30%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере в 50% тестируемых образцов опухолей легких, в концентрации, по крайней мере, примерно в 2 раза, предпочтительнее, по крайней мере, примерно в 5 раз, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, примерно в 10 раз более высокой, чем в нормальных тканях.

Настоящее изобретение в ином аспекте относится к полипептидным композициям, включающим аминокислотную последовательность, что кодируется описанной выше полинуклеотидной последовательностью.

В конкретных осуществлениях настоящее изобретение относится к полипептидным композициям, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, приведенных в SEQ ID NO: 391, 393, 395, 397, 421, 425-427, 434-439 и 584-587.

В определенных предпочтительных осуществлениях полипептиды и/или полинуклеотиды по настоящему изобретению являются иммуногенными, то есть они способны вызывать иммунный ответ, в частности гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, как описано здесь далее.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к фрагментам, вариантам и/или производным описанных полипептидных и/или полинуклеотидных последовательностей, где фрагменты, варианты и/или производные предпочтительно характеризуются уровнем биологической активности, составляющим по крайней мере 50%, предпочтительнее, по крайней мере 70%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере в 90% от уровня иммуногенной активности полипептидной последовательности, установленной в SEQ ID NO: 391, 393, 395, 397, 421, 425-427, 434-439 и 584-587, или полинуклеотидной последовательности, установленной в SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420 422-424, 428-433 и 440-583.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к полинуклеотидам, которые кодируют вышеописанный полипептид, к экспрессионным векторам, кодирующим такие полнуклеотиды, и клеткам хозяина, трансформированным или трансфицированным такими экспрессионными векторами.

В других аспектах настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим вышеописанные полипептид или полинуклеотид и физиологически приемлемый носитель.

В связанном аспекте настоящего изобретения предоставляются фармацевтические композиции, например, вакцинные композиции, для профилактических или терапевтических способов применения. Такие композиции, главным образом, включают иммуногенный полипептид или полинуклеотид по изобретению, и иммуностимулятор, такой как адъювант.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, которые включают (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающийся с полипептидом по настоящему изобретению, или его фрагментом; и (b) физиологически приемлемый носитель.

В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим (a) антиген-презентирующие клетки, которые экспрессируют вышеописанный полипептид и (b) фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Иллюстративные антиген-презентирующие клетки включают дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-клетки.

В связанных аспектах предоставляются фармацевтические композиции, которые включают: (а) антиген-презентирующую клетку, экспрессирующую вышеописанный полипептид и (b) иммуностимулятор.

Настоящее изобретение, кроме того, в других аспектах относится к слитым белкам, которые включают по крайней мере один вышеописанный полипептид, а также к полинуклеотидам, кодирующим такие слитые белки, обычно в форме фармацевтических композиций, например вакцинных композиций, включающих физиологически приемлемый носитель и/или иммуностимулятор. Слитые белки могут включать множественные иммуногенные полипептиды или их части/варианты, как описано здесь, или, кроме того, могут включать один или несколько полипептидных сегментов, способствующих экспрессии, очистке и/или иммуногенности полипептида(ов).

В дальнейших аспектах настоящее изобретение относится к способам стимуляции у пациента иммунного ответа, предпочтительно, Т-клеточного ответа у человека, включающим введение описанной здесь фармацевтической композиции. Пациент может страдать раком легких, и в этом случае способы относятся к лечению заболевания, или пациенты, которые, как считается, подвергаются риску развития такого заболевания, могут получать профилактическое лечение.

В дальнейших аспектах настоящее изобретение относится к способам ингибирования развития у пациента злокачественной опухоли, включающим введение пациенту вышеуказанной фармацевтической композиции. Пациент может страдать раком легких, и в этом случае способы относятся к лечению заболевания, или пациенты, которые, как считается, подвергаются риску развития такого заболевания, могут получать профилактическое лечение.

Настоящее изобретение, кроме того, относится, в других аспектах, к способам удаления опухолевых клеток из биологического образца, включающим взаимодействие биологического образца с Т-клетками, которые специфично реагируют с полипептидом по настоящему изобретению, где стадия взаимодействия проводится при достаточных условиях и в течение достаточного времени для возможности удаления из образца клеток, экспрессирующих данный белок.

В связанных аспектах предоставляются способы ингибирования развития у пациента злокачественной опухоли, включающие введение пациенту биологического образца, обработанного, как описано выше.

Кроме того, в других аспектах предоставляются способы стимуляции и роста Т-клеток, специфичных по отношению к полипептиду по настоящему изобретению, включающие взаимодействие Т-клеток с одним или несколькими: (i) описанными выше полипептидами; (ii) полинуклеотидами, кодирующими такой полипептид; и/или (iii) антиген-презентирующими клетками, которые экспрессируют такой полипептид; при достаточных условиях и в течение достаточного времени для возможности стимуляции и роста Т-клеток. Также предоставляются изолированные популяции Т-клеток, включающие Т-клетки, полученные, как описано выше.

В дальнейших аспектах настоящее изобретение относится к способам ингибирования развития у пациента злокачественной опухоли, включающим введение пациенту эффективного количества описанной выше популяции Т-клеток.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к способам ингибирования развития у пациента злокачественной опухоли, включающим стадии: (а) инкубирования CD4⁺- и/или CD8⁺-Т-клеток, выделенных от пациента, с одним или несколькими: (i) полипептидами, включающими по крайней мере иммуногенную часть описанного здесь полипептида; (ii) полинуклеотидами, кодирующими такой полипептид; и (iii) антиген-презентирующими клетками, которые экспрессируют такой полипептид; и (b) введения пациенту эффективного количества пролиферировавших Т-клеток, и ингибирования таким образом развития у пациента злокачественной опухоли. Пролиферировавшие клетки могут быть клонированы перед введением пациенту, но это не является необходимым.

В дальнейших аспектах настоящее изобретение относится к способам определения у пациента наличия или отсутствия злокачественной опухоли, предпочтительно, рака легких, включающим: (a) взаимодействие биологического образца, полученного от пациента, со связывающим агентом, который связывает вышеуказанный полипептид; (b) детектирование в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) связывание количества полипептида с предварительно определенным уровнем отсечения, и отсюда определение наличия или отсутствия у пациента злокачественной опухоли. В предпочтительных осуществлениях связывающим агентом является антитело, более предпочтительно, моноклональное антитело.

Настоящее изобретение также относится, в других аспектах, к способам мониторинга прогрессирования у пациента злокачественной опухоли. Такие способы включают стадии: (а) взаимодействия биологического образца, полученного от пациента в первый момент времени, со связывающим агентом, который связывает вышеуказанный полипептид; (b) детектирования в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (с) повторения стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (d) сравнения количества полипептида, выявленного на стадии (с) с количеством, выявленным на стадии (b) и отсюда - мониторинга прогрессирования у пациента злокачественной опухоли.

Настоящее изобретение, кроме того, относится, в других аспектах, к способам определения наличия или отсутствия у пациента злокачественной опухоли, включающим стадии: (а) взаимодействия полученного от пациента биологического образца с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует полипептид по настоящему изобретению; (b) определения в образце уровня полинуклеотида, предпочтительно, мРНК, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и (с) сравнения уровня полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с предварительно определенным уровнем отсечения, и отсюда определение наличия или отсутствия у пациента злокачественной опухоли. В конкретных осуществлениях количество мРНК выявляют путем полимеразной цепной реакции, с использованием, например, по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим вышеуказанный полипептид, или с комплементарной такому полинуклеотиду последовательностью. В других осуществлениях определяют количество мРНК с использованием способа гибридизации, задействуя олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим вышеуказанный полипептид, или с комплементарной такому полинуклеотиду последовательностью.

В связанных аспектах предоставляются способы мониторинга прогрессирования у пациента злокачественной опухоли, включающие стадии: (а) взаимодействия полученного от пациента биологического образца с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, который кодирует полипептид по настоящему изобретению; (b) определения в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом; (с) повторения стадий (а) и (b) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (d) сравнения количества полинуклеотида, выявленного на стадии (с) с количеством, выявленным на стадии (b) и отсюда - мониторинга прогрессирования у пациента злокачественной опухоли.

В дальнейших аспектах настоящее изобретение относится к антителам, таким как моноклональные антитела, которые связывают вышеописанный полипептид, а также к диагностическим наборам, включающим такие антитела. Также предоставляются диагностические наборы, включающие одно или несколько описанных выше олигонуклеотидных зондов или праймеров.

Данные и другие аспекты настоящего изобретения станут понятны по обращении к следующему подробному описанию. Все описанные здесь ссылки включены сюда в качестве ссылки полностью, как если каждая была бы включена индивидуально.

Идентификаторы последовательностей

SEQ ID NO: 1 представляет собой установленную последовательность кДНК для L363C1.cons.

SEQ ID NO: 2 представляет собой установленную последовательность кДНК для L263C2.cons.

SEQ ID NO: 3 представляет собой установленную последовательность кДНК для L263C2c.

SEQ ID NO: 4 представляет собой установленную последовательность кДНК для L263C1.cons.

SEQ ID NO: 5 представляет собой установленную последовательность кДНК для L263C1b.

SEQ ID NO: 6 представляет собой установленную последовательность кДНК для L164C2.cons.

SEQ ID NO: 7 представляет собой установленную последовательность кДНК для L164C1.cons.

SEQ ID NO: 8 представляет собой установленную последовательность кДНК для L366C1a.

SEQ ID NO: 9 представляет собой установленную последовательность кДНК для L260C1.cons.

SEQ ID NO: 10 представляет собой установленную последовательность кДНК для L163C1c.

SEQ ID NO: 11 представляет собой установленную последовательность кДНК для L163C1b.

SEQ ID NO: 12 представляет собой установленную последовательность кДНК для L255C1.cons.

SEQ ID NO: 13 представляет собой установленную последовательность кДНК для L255C1b.

SEQ ID NO: 14 представляет собой установленную последовательность кДНК для L355C1.cons.

SEQ ID NO: 15 представляет собой установленную последовательность кДНК для L366C1.cons.

SEQ ID NO: 16 представляет собой установленную последовательность кДНК для L163C1a.

SEQ ID NO: 17 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-1.

SEQ ID NO: 18 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-2.

SEQ ID NO: 19 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-3.

SEQ ID NO: 20 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-4.

SEQ ID NO: 21 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-5.

SEQ ID NO: 22 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-6.

SEQ ID NO: 23 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-7.

SEQ ID NO: 24 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-8.

SEQ ID NO: 25 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-9.

SEQ ID NO: 26 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-10.

SEQ ID NO: 27 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-11.

SEQ ID NO: 28 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-12.

SEQ ID NO: 29 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-13.

SEQ ID NO: 30 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-14.

SEQ ID NO: 31 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT86-15.

SEQ ID NO: 32 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-1.

SEQ ID NO: 33 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-2.

SEQ ID NO: 34 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-3.

SEQ ID NO: 35 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-4.

SEQ ID NO: 36 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-5.

SEQ ID NO: 37 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-6.

SEQ ID NO: 38 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-7.

SEQ ID NO: 39 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-8.

SEQ ID NO: 40 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-9.

SEQ ID NO: 41 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-10.

SEQ ID NO: 42 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-11.

SEQ ID NO: 43 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-12.

SEQ ID NO: 44 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-13.

SEQ ID NO: 45 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-14.

SEQ ID NO: 46 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-15.

SEQ ID NO: 47 представляет собой (dT)₁₂AG праймер.

SEQ ID NO: 48 представляет собой праймер.

SEQ ID NO: 49 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-3.

SEQ ID NO: 50 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-12.

SEQ ID NO: 51 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-16.

SEQ ID NO: 52 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-25.

SEQ ID NO: 53 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-36.

SEQ ID NO: 54 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-40.

SEQ ID NO: 55 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-46.

SEQ ID NO: 56 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-3.

SEQ ID NO: 57 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-12.

SEQ ID NO: 58 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-16.

SEQ ID NO: 59 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-25.

SEQ ID NO: 60 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-36.

SEQ ID NO: 61 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-40.

SEQ ID NO: 62 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-46.

SEQ ID NO: 63 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-30.

SEQ ID NO: 64 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-41.

SEQ ID NO: 65 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для 5'-конца LT86-9.

SEQ ID NO: 66 представляет собой установленную расширенную последовательность кДНК для LT86-4.

SEQ ID NO: 67 представляет собой предсказанную расширенную аминокислотную последовательность для LT86-4.

SEQ ID NO: 68 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для LT86-20.

SEQ ID NO: 69 представляет собой установленную последовательность 3'-кДНК для LT86-21.

SEQ ID NO: 70 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для LT86-22.

SEQ ID NO: 71 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для LT86-26.

SEQ ID NO: 72 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для LT86-27.

SEQ ID NO: 73 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-20.

SEQ ID NO: 74 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-21.

SEQ ID NO: 75 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-22.

SEQ ID NO: 76 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-26.

SEQ ID NO: 77 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для LT86-27.

SEQ ID NO: 78 представляет собой установленную расширенную последовательность кДНК для L86S-12.

SEQ ID NO: 79 представляет собой установленную расширенную последовательность кДНК для L86S-36.

SEQ ID NO: 80 представляет собой установленную расширенную последовательность кДНК для L86S-46.

SEQ ID NO: 81 представляет собой предсказанную расширенную аминокислотную последовательность для L86S-12.

SEQ ID NO: 82 представляет собой предсказанную расширенную аминокислотную последовательность для L86S-36.

SEQ ID NO: 83 представляет собой предсказанную расширенную аминокислотную последовательность для L86S-46.

SEQ ID NO: 84 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-6.

SEQ ID NO: 85 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-11.

SEQ ID NO: 86 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-14.

SEQ ID NO: 87 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-29.

SEQ ID NO: 88 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-34.

SEQ ID NO: 89 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-39.

SEQ ID NO: 90 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-47.

SEQ ID NO: 91 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-49.

SEQ ID NO: 92 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для L86S-51.

SEQ ID NO: 93 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-6.

SEQ ID NO: 94 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-11.

SEQ ID NO: 95 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-14.

SEQ ID NO: 96 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-29.

SEQ ID NO: 97 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-34.

SEQ ID NO: 98 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-39.

SEQ ID NO: 99 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-47.

SEQ ID NO: 100 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-49.

SEQ ID NO: 101 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L86S-51.

SEQ ID NO: 102 представляет собой установленную последовательность ДНК для SLT-T1.

SEQ ID NO: 103 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T2.

SEQ ID NO: 104 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T3.

SEQ ID NO: 105 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T5.

SEQ ID NO: 106 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T7.

SEQ ID NO: 107 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T9.

SEQ ID NO: 108 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T10.

SEQ ID NO: 109 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T11.

SEQ ID NO: 110 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SLT-T12.

SEQ ID NO: 111 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SLT-T1.

SEQ ID NO: 112 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SLT-T2.

SEQ ID NO: 113 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SLT-T3.

SEQ ID NO: 114 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SLT-T10.

SEQ ID NO: 115 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SLT-T12.

SEQ ID NO: 116 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SALT-T3.

SEQ ID NO: 117 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SALT-T4.

SEQ ID NO: 118 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SALT-T7.

SEQ ID NO: 119 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SALT-T8.

SEQ ID NO: 120 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SALT-T9.

SEQ ID NO: 121 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SALT-T3.

SEQ ID NO: 122 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SALT-T4.

SEQ ID NO: 123 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SALT-T7.

SEQ ID NO: 124 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SALT-T8.

SEQ ID NO: 125 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SALT-T9.

SEQ ID NO: 126 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-1.

SEQ ID NO: 127 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-2.

SEQ ID NO: 128 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-7.

SEQ ID NO: 129 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-13.

SEQ ID NO: 130 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-27.

SEQ ID NO: 131 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-28.

SEQ ID NO: 132 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-30.

SEQ ID NO: 133 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-40.

SEQ ID NO: 134 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-69.

SEQ ID NO: 135 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-71.

SEQ ID NO: 136 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-73.

SEQ ID NO: 137 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-79.

SEQ ID NO: 138 представляет собой установленную

последовательность кДНК для PSLT-03.

SEQ ID NO: 139 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-09.

SEQ ID NO: 140 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-011.

SEQ ID NO: 141 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-041.

SEQ ID NO: 142 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-62.

SEQ ID NO: 143 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-6.

SEQ ID NO: 144 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-37.

SEQ ID NO: 145 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-74.

SEQ ID NO: 146 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-010.

SEQ ID NO: 147 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-012.

SEQ ID NO: 148 представляет собой установленную последовательность кДНК для PSLT-037.

SEQ ID NO: 149 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-3.

SEQ ID NO: 150 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-24.

SEQ ID NO: 151 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-25.

SEQ ID NO: 152 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-33.

SEQ ID NO: 153 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-50.

SEQ ID NO: 154 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-57.

SEQ ID NO: 155 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-66.

SEQ ID NO: 156 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-82.

SEQ ID NO: 157 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-99.

SEQ ID NO: 158 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-104.

SEQ ID NO: 159 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-109.

SEQ ID NO: 160 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-5.

SEQ ID NO: 161 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-8.

SEQ ID NO: 162 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-12.

SEQ ID NO: 163 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-14.

SEQ ID NO: 164 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-16.

SEQ ID NO: 165 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-23.

SEQ ID NO: 166 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-26.

SEQ ID NO: 167 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-29.

SEQ ID NO: 168 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-32.

SEQ ID NO: 169 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-39.

SEQ ID NO: 170 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-42.

SEQ ID NO: 171 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-43.

SEQ ID NO: 172 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-44.

SEQ ID NO: 173 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-48.

SEQ ID NO: 174 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-68.

SEQ ID NO: 175 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-72.

SEQ ID NO: 176 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-77.

SEQ ID NO: 177 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-86.

SEQ ID NO: 178 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-88.

SEQ ID NO: 179 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-93.

SEQ ID NO: 180 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-100.

SEQ ID NO: 181 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для SAL-105.

SEQ ID NO: 182 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-3.

SEQ ID NO: 183 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-24.

SEQ ID NO: 184 представляет собой первую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-25.

SEQ ID NO: 185 представляет собой вторую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-25.

SEQ ID NO: 186 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-33.

SEQ ID NO: 187 представляет собой первую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-50.

SEQ ID NO: 188 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-57.

SEQ ID NO: 189 представляет собой первую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-66.

SEQ ID NO: 190 представляет собой вторую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-66.

SEQ ID NO: 191 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-82.

SEQ ID NO: 192 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-99.

SEQ ID NO: 193 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-104.

SEQ ID NO: 194 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-5.

SEQ ID NO: 195 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-8.

SEQ ID NO: 196 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-12.

SEQ ID NO: 197 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-14.

SEQ ID NO: 198 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-16.

SEQ ID NO: 199 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-23.

SEQ ID NO: 200 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-26.

SEQ ID NO: 201 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-29.

SEQ ID NO: 202 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-32.

SEQ ID NO: 203 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-39.

SEQ ID NO: 204 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-42.

SEQ ID NO: 205 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-43.

SEQ ID NO: 206 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-44.

SEQ ID NO: 207 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-48.

SEQ ID NO: 208 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-68.

SEQ ID NO: 209 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-72.

SEQ ID NO: 210 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-77.

SEQ ID NO: 211 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-86.

SEQ ID NO: 212 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-88.

SEQ ID NO: 213 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-93.

SEQ ID NO: 214 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-100.

SEQ ID NO: 215 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-105.

SEQ ID NO: 216 представляет собой вторую предсказанную аминокислотную последовательность для SAL-50.

SEQ ID NO: 217 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-4.

SEQ ID NO: 218 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-9.

SEQ ID NO: 219 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-10.

SEQ ID NO: 220 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-12.

SEQ ID NO: 221 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-19.

SEQ ID NO: 222 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-31.

SEQ ID NO: 223 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-38.

SEQ ID NO: 224 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-2.

SEQ ID NO: 225 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-3.

SEQ ID NO: 226 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-22.

SEQ ID NO: 227 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-24.

SEQ ID NO: 228 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-37.

SEQ ID NO: 229 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-39.

SEQ ID NO: 230 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-40.

SEQ ID NO: 231 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-41.

SEQ ID NO: 232 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-49.

SEQ ID NO: 233 представляет собой установленную последовательность 3'-кДНК для LT4690-55.

SEQ ID NO: 234 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для LT4690-55.

SEQ ID NO: 235 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-59.

SEQ ID NO: 236 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-63.

SEQ ID NO: 237 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-71.

SEQ ID NO: 238 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-3.

SEQ ID NO: 239 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-6.

SEQ ID NO: 240 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-22.

SEQ ID NO: 241 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-25.

SEQ ID NO: 242 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-26.

SEQ ID NO: 243 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-31.

SEQ ID NO: 244 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-36.

SEQ ID NO: 245 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-42.

SEQ ID NO: 246 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-44.

SEQ ID NO: 247 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-54.

SEQ ID NO: 248 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-55.

SEQ ID NO: 249 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-57.

SEQ ID NO: 250 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-58.

SEQ ID NO: 251 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-59.

SEQ ID NO: 252 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-62.

SEQ ID NO: 253 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-63.

SEQ ID NO: 254 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-65.

SEQ ID NO: 255 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-66

SEQ ID NO: 256 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-70.

SEQ ID NO: 257 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-73.

SEQ ID NO: 258 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-74.

SEQ ID NO: 259 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-76.

SEQ ID NO: 260 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-77.

SEQ ID NO: 261 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-78.

SEQ ID NO: 262 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-80.

SEQ ID NO: 263 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-85.

SEQ ID NO: 264 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-87.

SEQ ID NO: 265 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-89.

SEQ ID NO: 266 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-94.

SEQ ID NO: 267 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-95.

SEQ ID NO: 268 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-98.

SEQ ID NO: 269 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-100.

SEQ ID NO: 270 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-103.

SEQ ID NO: 271 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-105.

SEQ ID NO: 272 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-107.

SEQ ID NO: 273 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-108.

SEQ ID NO: 274 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-109.

SEQ ID NO: 275 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-118.

SEQ ID NO: 276 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-120.

SEQ ID NO: 277 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-121.

SEQ ID NO: 278 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-122.

SEQ ID NO: 279 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-124.

SEQ ID NO: 280 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-126.

SEQ ID NO: 281 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-127.

SEQ ID NO: 282 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-128.

SEQ ID NO: 283 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-129.

SEQ ID NO: 284 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-133.

SEQ ID NO: 285 представляет собой установленную последовательность кДНК для 2LT-137

SEQ ID NO: 286 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-71.

SEQ ID NO: 287 представляет собой установленную последовательность кДНК для LT4690-82.

SEQ ID NO: 288 представляет собой установленную полноразмерную последовательность кДНК для SSLT-74.

SEQ ID NO: 289 представляет собой установленную последовательность кДНК для SSLT-78.

SEQ ID NO: 290 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-8.

SEQ ID NO: 291 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-12.

SEQ ID NO: 292 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-336.

SEQ ID NO: 293 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-344.

SEQ ID NO: 294 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-345.

SEQ ID NO: 295 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-346.

SEQ ID NO: 296 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-348.

SEQ ID NO: 297 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-350.

SEQ ID NO: 298 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-352.

SEQ ID NO: 299 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-354.

SEQ ID NO: 300 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-355.

SEQ ID NO: 301 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-356.

SEQ ID NO: 302 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-357.

SEQ ID NO: 303 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-501.

SEQ ID NO: 304 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-503.

SEQ ID NO: 305 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-513.

SEQ ID NO: 306 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-516.

SEQ ID NO: 307 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-518.

SEQ ID NO: 308 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-519.

SEQ ID NO: 309 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-522.

SEQ ID NO: 310 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-523.

SEQ ID NO: 311 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-525.

SEQ ID NO: 312 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-527.

SEQ ID NO: 313 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-529.

SEQ ID NO: 314 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-530.

SEQ ID NO: 315 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-531.

SEQ ID NO: 316 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-532.

SEQ ID NO: 317 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-533.

SEQ ID NO: 318 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-536.

SEQ ID NO: 319 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-538.

SEQ ID NO: 320 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-539.

SEQ ID NO: 321 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-541.

SEQ ID NO: 322 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-542.

SEQ ID NO: 323 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-546.

SEQ ID NO: 324 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-549.

SEQ ID NO: 325 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-551.

SEQ ID NO: 326 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-552.

SEQ ID NO: 327 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-554.

SEQ ID NO: 328 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-558.

SEQ ID NO: 329 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-559.

SEQ ID NO: 330 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-561.

SEQ ID NO: 331 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-562.

SEQ ID NO: 332 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-564.

SEQ ID NO: 333 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-565.

SEQ ID NO: 334 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-566.

SEQ ID NO: 335 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-567.

SEQ ID NO: 336 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-568.

SEQ ID NO: 337 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-570.

SEQ ID NO: 338 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-572.

SEQ ID NO: 339 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-575.

SEQ ID NO: 340 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-576.

SEQ ID NO: 341 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-577.

SEQ ID NO: 342 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-578.

SEQ ID NO: 343 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-582.

SEQ ID NO: 344 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-583.

SEQ ID NO: 345 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-586.

SEQ ID NO: 346 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-588.

SEQ ID NO: 347 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-590.

SEQ ID NO: 348 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-591.

SEQ ID NO: 349 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-592.

SEQ ID NO: 350 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-593.

SEQ ID NO: 351 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-594.

SEQ ID NO: 352 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-595.

SEQ ID NO: 353 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-596.

SEQ ID NO: 354 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-598.

SEQ ID NO: 355 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-599.

SEQ ID NO: 356 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-602.

SEQ ID NO: 357 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-604.

SEQ ID NO: 358 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-605.

SEQ ID NO: 359 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-606.

SEQ ID NO: 360 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-607.

SEQ ID NO: 361 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-608.

SEQ ID NO: 362 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC1-610.

SEQ ID NO: 363 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T1.

SEQ ID NO: 364 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T2.

SEQ ID NO: 365 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T3.

SEQ ID NO: 366 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T5.

SEQ ID NO: 367 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T6.

SEQ ID NO: 368 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T7.

SEQ ID NO: 369 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T9.

SEQ ID NO: 370 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T10.

SEQ ID NO: 371 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона DMS79T11.

SEQ ID NO: 372 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T1.

SEQ ID NO: 373 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T2.

SEQ ID NO: 374 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T3.

SEQ ID NO: 375 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T4.

SEQ ID NO: 376 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T5.

SEQ ID NO: 377 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T7.

SEQ ID NO: 378 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T9.

SEQ ID NO: 379 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T10.

SEQ ID NO: 380 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T11.

SEQ ID NO: 381 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 128T12.

SEQ ID NO: 382 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T3.

SEQ ID NO: 383 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T5.

SEQ ID NO: 384 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T6.

SEQ ID NO: 385 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T7.

SEQ ID NO: 386 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T9.

SEQ ID NO: 387 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T10.

SEQ ID NO: 388 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T11.

SEQ ID NO: 389 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона NCIH69T12.

SEQ ID NO: 390 представляет собой полноразмерную последовательность кДНК для 128T1.

SEQ ID NO: 391 представляет собой аминокислотную последовательность для 128T1.

SEQ ID NO: 392 представляет собой полноразмерную последовательность кДНК для 2LT-128.

SEQ ID NO: 393 представляет собой аминокислотную последовательность для 2LT-128.

SEQ ID NO: 394 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона SCC1-542.

SEQ ID NO: 395 представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 394.

SEQ ID NO: 396 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона SCC1-593.

SEQ ID NO: 397 представляет собой аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 396.

SEQ ID NO: 398 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55508.1.

SEQ ID NO: 399 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55509.1.

SEQ ID NO: 400 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54243.1.

SEQ ID NO: 401 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54251.1.

SEQ ID NO: 402 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54252.1.

SEQ ID NO: 403 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54253.1.

SEQ ID NO: 404 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55518.1.

SEQ ID NO: 405 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54258.1.

SEQ ID NO: 406 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54575.1.

SEQ ID NO: 407 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54577.1.

SEQ ID NO: 408 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54584.1.

SEQ ID NO: 409 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55521.1.

SEQ ID NO: 410 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54589.1.

SEQ ID NO: 411 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54592.1.

SEQ ID NO: 412 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55134.1.

SEQ ID NO: 413 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55137.1.

SEQ ID NO: 414 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55140.1.

SEQ ID NO: 415 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55531.1.

SEQ ID NO: 416 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55532.1.

SEQ ID NO: 417 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54621.1.

SEQ ID NO: 418 представляет собой установленную последовательность кДНК для 55548.1.

SEQ ID NO: 419 представляет собой установленную последовательность кДНК для 54623.1.

SEQ ID NO: 420 представляет собой установленную последовательность кДНК для L39.

SEQ ID NO: 421 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для L39.

SEQ ID NO: 422 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC2-29.

SEQ ID NO: 423 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC2-36.

SEQ ID NO: 424 представляет собой установленную последовательность кДНК для SCC2-60.

SEQ ID NO: 425 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SCC2-29.

SEQ ID NO: 426 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SCC2-36.

SEQ ID NO: 427 представляет собой предсказанную аминокислотную последовательность для SCC2-60.

SEQ ID NO: 428 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 20129, на которую также ссылаются, как на 2LT-3, установленную в SEQ ID NO: 238.

SEQ ID NO: 429 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 20347, на которую также ссылаются, как на 2LT-26, установленную в SEQ ID NO: 242.

SEQ ID NO: 430 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 21282, на которую также ссылаются, как на 2LT-57, установленную в SEQ ID NO: 249.

SEQ ID NO: 431 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 21283, на которую также ссылаются, как на 2LT-58, установленную в SEQ ID NO: 250.

SEQ ID NO: 432 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 21484, на которую также ссылаются, как на 2LT-98, установленную в SEQ ID NO: 268.

SEQ ID NO: 433 представляет собой расширенную последовательность кДНК для клона 21871, на которую также ссылаются, как на 2LT-124, установленную в SEQ ID NO: 279.

SEQ ID NO: 434 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 428.

SEQ ID NO: 435 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 429.

SEQ ID NO: 436 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 430.

SEQ ID NO: 437 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 431.

SEQ ID NO: 438 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 432.

SEQ ID NO: 439 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 433.

SEQ ID NO: 440 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 19A4.

SEQ ID NO: 441 представляет собой установленную полноразмерную последовательность кДНК для клона 14F10.

SEQ ID NO: 442 представляет собой установленную последовательность 5'-кДНК для клона 20E10.

SEQ ID NO: 443 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55153.

SEQ ID NO: 444 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55153.

SEQ ID NO: 445 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55154.

SEQ ID NO: 446 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55154.

SEQ ID NO: 447 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55155.

SEQ ID NO: 448 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55156.

SEQ ID NO: 449 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55156.

SEQ ID NO: 450 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55157.

SEQ ID NO: 451 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55157.

SEQ ID NO: 452 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55158.

SEQ ID NO: 453 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55159.

SEQ ID NO: 454 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55161.

SEQ ID NO: 455 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55161.

SEQ ID NO: 456 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55162.

SEQ ID NO: 457 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55162.

SEQ ID NO: 458 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55163.

SEQ ID NO: 459 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55163.

SEQ ID NO: 460 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55164.

SEQ ID NO: 461 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55164.

SEQ ID NO: 462 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55165.

SEQ ID NO: 463 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55165.

SEQ ID NO: 464 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55166.

SEQ ID NO: 465 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55156.

SEQ ID NO: 466 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55167.

SEQ ID NO: 467 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55167.

SEQ ID NO: 468 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55168.

SEQ ID NO: 469 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55168.

SEQ ID NO: 470 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55169.

SEQ ID NO: 471 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55169.

SEQ ID NO: 472 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55170.

SEQ ID NO: 473 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55170.

SEQ ID NO: 474 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55171.

SEQ ID NO: 475 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55172.

SEQ ID NO: 476 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55173.

SEQ ID NO: 477 представляет собой первую установленную последовательность кДНК для клона 55174.

SEQ ID NO: 478 представляет собой вторую установленную последовательность кДНК для клона 55174.

SEQ ID NO: 479 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55175.

SEQ ID NO: 480 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 55176.

SEQ ID NO: 481 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 525.

SEQ ID NO: 482 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 526.

SEQ ID NO: 483 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 527.

SEQ ID NO: 484 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 528.

SEQ ID NO: 485 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 529.

SEQ ID NO: 486 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 530.

SEQ ID NO: 487 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 531.

SEQ ID NO: 488 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 532.

SEQ ID NO: 489 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 533.

SEQ ID NO: 490 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 534.

SEQ ID NO: 491 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 535.

SEQ ID NO: 492 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 536.

SEQ ID NO: 493 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 537.

SEQ ID NO: 494 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 538.

SEQ ID NO: 495 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 539.

SEQ ID NO: 496 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 540.

SEQ ID NO: 497 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 541.

SEQ ID NO: 498 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 542.

SEQ ID NO: 499 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 543.

SEQ ID NO: 500 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 544.

SEQ ID NO: 501 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 545.

SEQ ID NO: 502 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 546.

SEQ ID NO: 503 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 547.

SEQ ID NO: 504 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 548.

SEQ ID NO: 505 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 549.

SEQ ID NO: 506 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 550.

SEQ ID NO: 507 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 551.

SEQ ID NO: 508 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 552.

SEQ ID NO: 509 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 553.

SEQ ID NO: 510 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 554.

SEQ ID NO: 511 представляет собой установленную последовательность кДНК для контига 555.

SEQ ID NO: 512 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57207.

SEQ ID NO: 513 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57209.

SEQ ID NO: 514 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57210.

SEQ ID NO: 515 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57211.

SEQ ID NO: 516 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57212.

SEQ ID NO: 517 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57213.

SEQ ID NO: 518 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57215.

SEQ ID NO: 519 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57219.

SEQ ID NO: 520 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57221.

SEQ ID NO: 521 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57222.

SEQ ID NO: 522 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57223.

SEQ ID NO: 523 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57225.

SEQ ID NO: 524 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57227.

SEQ ID NO: 525 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57228.

SEQ ID NO: 526 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57229.

SEQ ID NO: 527 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57230.

SEQ ID NO: 528 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57231.

SEQ ID NO: 529 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57232.

SEQ ID NO: 530 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57233.

SEQ ID NO: 531 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57234.

SEQ ID NO: 532 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57235.

SEQ ID NO: 533 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57236.

SEQ ID NO: 534 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57237.

SEQ ID NO: 535 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57238.

SEQ ID NO: 536 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57239.

SEQ ID NO: 537 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57240.

SEQ ID-NO: 538 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57242.

SEQ ID NO: 539 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57243.

SEQ ID NO: 540 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57245.

SEQ ID NO: 541 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57248.

SEQ ID NO: 542 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57249.

SEQ ID NO: 543 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57250.

SEQ ID NO: 544 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57251.

SEQ ID NO: 545 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57253.

SEQ ID NO: 546 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57254.

SEQ ID NO: 547 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57255.

SEQ ID NO: 548 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57257.

SEQ ID NO: 549 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57258.

SEQ ID NO: 550 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57259.

SEQ ID NO: 551 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57261.

SEQ ID NO: 552 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57262.

SEQ ID NO: 553 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57263.

SEQ ID NO: 554 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57264.

SEQ ID NO: 555 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57265.

SEQ ID NO: 556 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57266.

SEQ ID NO: 557 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57267.

SEQ ID NO: 558 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57268.

SEQ ID NO: 559 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57269.

SEQ ID NO: 560 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57270.

SEQ ID NO: 561 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57271.

SEQ ID NO: 562 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57272.

SEQ ID NO: 563 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57274.

SEQ ID NO: 564 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57275.

SEQ ID NO: 565 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57277.

SEQ ID NO: 566 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57280.

SEQ ID NO: 567 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57281.

SEQ ID NO: 568 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57282.

SEQ ID NO: 569 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57283.

SEQ ID NO: 570 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57285.

SEQ ID NO: 571 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57287.

SEQ ID NO: 572 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57288.

SEQ ID NO: 573 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57289.

SEQ ID NO: 574 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57290.

SEQ ID NO: 575 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57292.

SEQ ID NO: 576 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57295.

SEQ ID NO: 577 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57296.

SEQ ID NO: 578 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57297.

SEQ ID NO: 579 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57299.

SEQ ID NO: 580 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57301.

SEQ ID NO: 581 представляет собой установленную последовательность кДНК для клона 57302.

SEQ ID NO: 582 представляет собой установленную последовательность кДНК для бета-цепи специфичного для опухоли легких Т-клеточного рецептора.

SEQ ID NO: 583 представляет собой установленную последовательность кДНК для бета-цепи специфичного для опухоли легких Т-клеточного рецептора.

SEQ ID NO: 584 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 583.

SEQ ID NO: 585 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 582.

SEQ ID NO: 586 представляет собой аминокислотную последовательность, кодируемую 5'-концом 14F10.

SEQ ID-NO: 587 представляет собой аминокислотную последовательность T-клеточного эпитопа, содержащегося внутри SEQ ID NO: 586.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение главным образом относится к композициям и их применению при лечении и диагностике злокачественной опухоли, в частности рака легких. Как описано ниже, иллюстративные композиции по настоящему изобретению включают в качестве неограничивающих примеров полипептиды, в частности иммуногенные полипептиды, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, антитела и другие связывающие агенты, антиген-презентирующие клетки (АРС) и клетки иммунной системы (например, Т-клетки).

Исполнение настоящего изобретения задействует в рамках навыков, имеющихся в данной области, за исключением конкретно обозначенных противоположных случаев, общепринятые способы вирусологии, иммунологии, микробиологии, молекулярной биологии и технологий рекомбинантной ДНК, многие из которых описаны ниже с целью иллюстрации. Такие способы полно раскрыты в литературе. См., например, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).

Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки, выше или ниже, включены сюда полностью в качестве ссылки.

При использовании в данной спецификации и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, кроме тех случаев, где по смыслу явно указывается на другое.

Полипептидные композиции

Используемый здесь термин "полипептид" применяется в его общепринятом смысле, т.е. как последовательность аминокислот. Полипептиды не ограничены конкретной длиной продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включаются в определение полипептида, и такие термины могут использоваться здесь взаимозаменяемо, кроме конкретно определенных по-другому случаев. Данный термин также не относится или исключает пост-экспрессионные модификации полипептида, например гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и тому подобное, а также другие модификации, известные в данной области, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе. Полипептид может представлять собой целый белок или его подпоследовательность. Конкретные интересующие полипептиды в контексте данного изобретения представляют аминокислотные подпоследовательности, включающие эпитопы, т.е. антигенные детерминанты по существу ответственные за иммуногенные свойства полипептида и способные вызывать иммунный ответ.

В частности, иллюстративные пептиды по настоящему изобретению включают те, что кодируются полинуклеотидной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583, или последовательностью, которая гибридизуется в умеренно жестких условиях, или, альтернативно, в высоко жестких условиях с полинуклеотидной последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583. Другие конкретные иллюстративные полипептиды по изобретению включают аминокислотные последовательности, как приведено в любой из SEQ ID NO: 391, 393, 395, 397, 421, 425-427, 434-439 и 584-587.

Полипептиды по настоящему изобретению иногда указываются здесь как белки опухоли легких или полипептиды опухоли легких, в качестве обозначения того, что их идентификация основана по крайней мере частично на повышении уровня их экспрессии в образцах опухоли легких. Таким образом, "полипептид опухоли легких" или "белок опухоли легких" главным образом относится к полипептидной последовательности по настоящему изобретению, или полинуклеотидной последовательности, кодирующей такой полипептид, который экспрессируется в значительной доле образцов опухоли легких, например, предпочтительно, более чем в 20%, предпочтительнее, более чем в 30%, и, наиболее предпочтительно, более чем в 50% и выше от тестированных образцов опухоли легких, на уровне, который по крайней мере вдвое, и предпочтительно, по крайней мере в пять раз превышает уровень экспрессии в нормальных тканях, что определено с использованием представленного здесь репрезентативного анализа. Последовательность полипептида опухоли легких по изобретению, основанная на его повышенном уровне экспрессии в опухолевых клетках, особенно полезна как диагностический маркер, а также как мишень терапии, как дополнительно описано ниже.

В определенных предпочтительных осуществлениях полипептиды по изобретению являются иммуногенными, т.е. они детектируемо реагируют при иммунологическом анализе (таком как ELISA или анализ стимуляции Т-клеток) с антисыворотками и/или Т-клетками пациента с раком легких. Скрининг иммуногенной активности может выполняться с использованием способов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, такой скрининг может выполняться с использованием способов, таких как описанные Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. В одном из иллюстративных примеров полипептид может быть иммобилизован на твердой основе и может контактировать с сыворотками пациентов для связывания антител сыворотки с иммобилизованным полипептидом. Несвязавшаяся сыворотка может затем удаляться, и связанные антитела могут быть детектированы, например, с использованием меченного ¹²⁵I белка А.

Как понятно специалисту в данной области, иммуногенные части описанных здесь полипептидов также относятся к настоящему изобретению. Применяемый здесь термин "иммуногенная часть" представляет фрагмент иммуногенного полипептида по изобретению, который сам по себе является иммунологически реагирующим (т.е., специфично связывает) В-клеточными или Т-клеточными поверхностными рецепторами антигена, распознающими полипептид. Иммуногенные части могут быть в основном идентифицированы с использованием хорошо известных способов, таких как те, что суммируются в Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) и цитируемых здесь ссылках. Такие способы включают скрининг полипептидов на способность взаимодействовать с специфичными к антигену антителами, антисыворотками и/или линиями и клонами Т-клеток. При использовании здесь, антисыворотки и антитела являются "специфичными к антигену", если они специфично связываются с антигеном (т.е., взаимодействуют с белком в ELISA или другом иммунологическом анализе, и не реагируют детектируемо с не имеющими к ним отношения белками). Такие антисыворотки и антитела могут быть получены, как описано здесь, и с использованием хорошо известных способов.

В одном из предпочтительных осуществлений иммуногенная часть полипептида по настоящему изобретению представляет собой часть, которая взаимодействует с антителами и/или Т-клетками на уровне, по существу, не меньшем, чем таковой при взаимодействии полноразмерного полипептида (например, в ELISA и/или анализе взаимодействия Т-клеток). Предпочтительно, уровень иммуногенной активности иммунологической части составляет, по крайней мере, около 50%, предпочтительно, по крайней мере, около 70%, и, наиболее предпочтительно, более около 90% от иммуногенности полноразмерного пептида. В некоторых случаях, идентифицируют предпочтительные иммуногенные части, имеющие уровень иммуногенной активности выше, чем у соответствующего полноразмерного полипептида, например, имеющие более около 100%, или 150%, или более иммуногенной активности.

В других определенных осуществлениях иллюстративные иммуногенные части могут включать пептиды, в которых удалены N-концевая лидерная последовательность и/или трансмембранный домен. Другие иллюстративные иммуногенные части содержат небольшие N-концевую и/или С-концевую делецию (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно, 5-15 аминокислот) по отношению к зрелому белку.

В другом осуществлении полипептидная композиция по изобретению может также включать один или несколько полипептидов, которые иммунологически взаимодействуют с Т-клетками и/или антителами, генерированными против полипептида по изобретению, в частности полипептида, имеющего описанную здесь аминокислотную последовательность, или к его иммуногенному фрагменту или варианту.

В другом осуществлении изобретения предоставляются полипептиды, которые включают один или несколько полипептидов, способных вызывать образование Т-клеток и/или антител, которые иммунологически взаимодействуют с одним или несколькими описанными здесь полипептидами, или одним или несколькими полипептидами, кодируемыми смежными последовательностями нуклеиновых кислот, содержащимися в описанных здесь полинуклеотидных последовательностях, или их иммуногенных фрагментах или вариантах, или одной или несколькими последовательностями нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с одной или несколькими из данных последовательностей в условиях от умеренной до высокой жесткости.

Настоящее изобретение в другом аспекте относится к полипептидным фрагментам, включающим, по крайней мере, около 5, 10, 15, 20, 25, 50 или 100 следующих друг за другом аминокислот, или более, включая все промежуточные размеры приведенных здесь полипептидных композиций, таких как те, что приведены в SEQ ID NO: 391, 393, 395, 397, 421, 425-427, 434-439 и 584-587, или те, что кодируются полинуклеотидной последовательностью, приведенной в последовательности SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к вариантам описанных здесь полипептидных композиций. В основном полипептидные варианты, охваченные настоящим изобретением, обычно проявляют, по крайней мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, или более идентичности (установленной, как описано ниже) по их длине по отношению к приведенным здесь полипептидным последовательностям.

В одном из предпочтительных осуществлений полипептидные фрагменты и варианты, относящиеся к настоящему изобретению, иммунологически взаимодействуют с антителом и/или Т-клеткой, которая реагирует с конкретно установленным здесь полноразмерным полипептидом.

В другом предпочтительном осуществлении полипептидные фрагменты и варианты, относящиеся к настоящему изобретению, проявляют уровень биологической активности, составляющий по крайней мере около 50%, предпочтительно, по крайней мере, около 70%, и, наиболее предпочтительно, по крайней мере, около 90%, или более, от того, что проявляет конкретно установленная здесь полноразмерная полипептидная последовательность.

В качестве используемого здесь термина, полипептидный "вариант" представляет собой полипептид, который обычно отличается от конкретно описанного здесь полипептида одной или несколькими заменами, делециями, дополнениями и/или вставками. Такие варианты могут быть встречающимися в природе или могут быть генерированы синтетически, например, путем модификации одной или нескольких вышеуказанных полипептидных последовательностей по изобретению и оценки их иммуногенной активности, как описано здесь и/или с использованием любого из множества способов, хорошо известных в данной области.

Например, конкретные иллюстративные варианты полипептидов по изобретению включают те, в которых удалены одна или несколько частей, таких как N-концевая лидерная последовательность или трансмембранный домен. Другие иллюстративные варианты включают варианты, в которых от N- и/или С-конца зрелого белка удалена малая часть (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно, 5-15 аминокислот).

Во многих случаях вариант содержит консервативные замены. "Консервативная замена" является той, в которой аминокислота замещена на другую аминокислоту, которая обладает сходными свойствами, так что специалист в области пептидной химии будет ожидать, что вторичная структура и гидропатическая природа полипептида существенно не изменится. Как описано выше, в структуре полинуклеотидов и полипептидов по настоящему изобретению могут быть сделаны модификации, и тем не менее могут быть получены функциональная молекула, которая кодирует вариант или производный полипептид с требуемыми характеристиками, например с иммуногенными характеристиками. Когда требуется изменить аминокислотную последовательность полипептида для создания эквивалентного, или даже улучшенного иммуногенного варианта или части полипептида по изобретению, специалист в данной области обычно меняет один или несколько кодонов кодирующей последовательности ДНК по таблице 1.

Например, конкретные аминокислоты могут быть заменены в белковой структуре на другие аминокислоты без ощутимой потери способности связывания при взаимодействии со структурами, такими как, например, антиген-связывающие области антител или сайты связывания молекул субстрата. Поскольку именно способность к взаимодействию и природа белка определяют биологическую функциональную активность белка, в белковой последовательности и, конечно, в лежащей в ее основе кодирующей последовательности ДНК могут быть сделаны конкретные аминокислотные замены, и, несмотря на это, может быть получен белок с подобными свойствами. Таким образом, предполагается, что в пептидных последовательностях описанных композиций или соответствующих последовательностях ДНК, которые кодируют указанные пептиды, могут быть сделаны различные изменения без ощутимой потери их биологической функциональности или активности.

При внесении таких изменений можно учитывать гидропатический индекс аминокислот. В данной области в целом установлена значимость гидропатического аминокислотного индекса в присвоении белку биологической функции взаимодействия (Kyte and Doolittle, 1982; включено сюда в качестве ссылки). Принято считать, что относительный гидропатический характер аминокислоты вносит вклад во вторичную структуру полученного в результате белка, которая, в свою очередь, определяет взаимодействие белка с другими молекулами, например, ферментами, субстратами, рецепторами, ДНК, антителами, антигенами, и тому подобными. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический индекс на основе гидрофобности и характеристик заряда (Kyte and Doolittle, 1982). Данные значения составляют: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутаминовая кислота (-3,5); глутамин (-3,5); аспарагиновая кислота (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).

В данной области известно, что определенные аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, обладающими сходным гидропатическим индексом или счетом, и, тем не менее, это может приводить к возникновению белка с сходной биологической активностью, т.е. к получению биологически функционально эквивалентного белка. При введении таких изменений предпочтительной является замена аминокислот, гидропатические индексы которых лежат в пределах ±2, особенно предпочтительными являются индексы, лежащие в интервале ±1, и даже более особенно предпочтительными являются индексы, лежащие в интервале ±0,5. В данной области также установлено, что замена подобных аминокислот может быть эффективно сделана на основе гидрофильности. В патенте США 4554101 (конкретно включенном сюда полностью в качестве ссылки) установлено, что наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, определяемая гидрофильностью его следующих друг за другом аминокислот, коррелирует с биологическими свойствами белка.

Как подробно описано в патенте США 4554101, аминокислотным остаткам присвоены следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспарагиновая кислота (+3,0±1); глутаминовая кислота (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин ( -0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5); триптофан (-3,4). Установлено, что аминокислота может замещаться на другую, обладающую сходным значением гидрофильности, и, тем не менее, может быть получен биологически эквивалентный, и, в частности, иммунологически эквивалентный белок. При таких изменениях предпочтительной является замена аминокислот, значения гидрофильности которых которых лежат в пределах ±2, особенно предпочтительными являются значения, лежащие в интервале ±1, и даже более особенно предпочтительными являются значения, лежащие в интервале ±0,5.

Следовательно, как отражено выше, аминокислотные замены, в общем, основаны на относительном сходстве заместителей боковых групп аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и тому подобного. Типовые замены, которые берут в расчет различные вышеупомянутые характеристики, хорошо известны специалистам в данной области и включают: аргинин и лизин; глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту; серин и треонин; глутамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.

Кроме того, любые полинуклеотиды могут далее модифицироваться для увеличения стабильности in vivo. Возможные модификации включают в качестве неограничивающих примеров добавление фланкирующих последовательностей с 5'- и/или 3'-концов; применение фосфоротиокислоты или 2'-О-метила вместо фосфодиэстеразной связи в скелете; и/или включение нетрадиционных оснований, таких как инозин, квеозин и вибутозин, а также ацетил-, метил-, тио- и других модифицированных форм аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина.

Аминокислотные замены, кроме того, могут осуществляться на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; и аминокислоты с незаряженными полярными головными группами, обладающие сходными значениями гидрофильности включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; и серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другие группы аминокислот, которые могут представлять консервативные замены, включают: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; и (5) phe, tyr, trp, his. Вариант может также или альтернативно содержать неконсервативные замены. В предпочтительном осуществлении вариантные полипептиды отличаются от нативной последовательности за счет замены, делеции или добавления пяти аминокислот или менее. Варианты также (или альтернативно) могут быть модифицированы, например, путем делеции или добавления аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на иммуногенность, вторичную структуру и гидропатическую природу полипептида.

Как отмечалось выше, полипептиды могут включать сигнальную (или лидерную) последовательность на N-конце белка, который направляет перенос белка совместно с трансляцией или после нее. Полипептид также может быть конъюгирован с линкером или другой последовательностью для простоты синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, поли-His) или для облегчения связывания полипептида с твердой основой. Например, полипептид может конъюгироваться с Fc-областью иммуноглобулина.

При сравнении полипептидных последовательностей о двух последовательностях говорят, что они "идентичны", если последовательность аминокислот в двух последовательностях совпадает при выравнивании до максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят путем сопоставления последовательностей по окнам сравнения для идентификации и сравнения областей локального сходства последовательностей. При использовании здесь, "окно сравнения" относится к сегменту, состоящему по крайней мере примерно из 20 следующих друг за другом положений, обычно от 30 примерно до 75, от 40 примерно до 50, в котором последовательность может сравниваться с последовательностью сравнения с тем же числом следующих друг за другом положений, после того, как две последовательности подвергли оптимальному выравниванию.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться с использованием программы Megalign в пакете биоинформатических программ Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), применяя параметры по умолчанию. Данная программа реализует несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988), CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) -erical Taxonomy -the Principles and Practice of -erical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.

Альтернативно, оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться по алгоритму локальной идентичности Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, по алгоритму идентичности выравнивания Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity methods of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, путем компьютеризованных осуществлений данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или путем экспертизы.

Одним из предпочтительных примеров алгоритмов, которые подходят для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, соответственно. BLAST и BLAST 2.0 могут, например, использоваться, с описанными здесь параметрами, для определения процентной идентичности последовательностей полинуклеотидов и полипептидов по изобретению. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST является общественно доступным через National Center for Biotechnology Information. В случае аминокислотных последовательностей для вычисления кумулятивного счета может использоваться матрица счета. Расширение коротких участков совпадения (слов) в каждом направлении прекращается, когда кумулятивный счет выравнивания уменьшается на количество Х от его максимально достигнутого значения; когда кумулятивный счет становится равным нулю или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательным счетом; или когда достигается конец каждой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и Х определяют чувствительность и скорость выравнивания.

В одном из предпочтительных подходов "процент идентичности по последовательности" определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей при окне сравнения, включающем по крайней мере 20 положений, где часть полипептидной последовательности в окне сравнения может включать добавления или делеции (т.е., вставки) в количестве 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов, или от 10 до 12 процентов, по отношению к последовательностям сравнения (которые не включают добавления или делеции), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентное отношение рассчитывают путем определения числа положений, в которых идентичный аминокислотный остаток имеет место в обеих последовательностях с получением числа совпавших положений, деления числа совпавших положений на общее число положений в последовательности сравнения (т.е., размер окна), и умножения результатов на 100 с получением процентного выражения идентичности последовательности.

В других иллюстративных осуществлениях полипептид может представлять собой полипептид слияния, который включает множественные описанные здесь полипептиды, или который включает по крайней мере один описанный здесь полипептид и неродственную последовательность, такую как известный опухолевый белок. Партнер слияния может, например, способствовать предоставлению Т-хелперного эпитопа (иммунологический партнер слияния), предпочтительно, Т-хелперного эпитопа, распознаваемого человеком, или может способствовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высоким выходом, чем выход нативного рекомбинантного белка. Конкретные предпочтительные партнеры слияния являются как иммунологическими, так и усиливающими экспрессию партнерами слияния. Другие партнеры слияния могут быть выбраны так, что они увеличивают растворимость полипептида или делают его способным направляться в требуемые внутриклеточные компартменты. Еще одни партнеры слияния включают аффинные метки, которые облегчают очистку полипептида.

Полипептиды слияния могут в основном быть получены с использованием стандартных способов, включая химическую конъюгацию. Предпочтительно полипептид слияния экспрессируется в виде рекомбинантного полипептида, позволяющего осуществлять продукцию в повышенных по отношению к неслитому полипептиду концентрациях в экспрессионной системе. В кратком изложении, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут собираться раздельно и лигироваться в подходящий экспрессирующий вектор. 3'-конец последовательности ДНК, кодирующей первый полипептидный компонент, лигируют с использованием пептидного линкера или без него, с 5'-концом последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, так что рамки считывания последовательностей находятся в фазе. Это позволяет осуществляться трансляции в единственный полипептид слияния, который сохраняет биологическую активность обоих составляющих полипептидов.

Последовательность пептидного линкера может применяться для разделения первого и второго полипептидного компонента дистанцией, существенной для того, чтобы убедиться, что каждый полипептид сворачивается с образованием его вторичной и третичной структуры. Такая последовательность пептидного линкера включена в полипептид слияния с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области. Подходящие последовательности пептидных линкеров могут выбираться, основываясь на следующих факторах: (1) их способности принимать гибкую растянутую конформацию; (2) их неспособности образовывать вторичную структуру, которая может взаимодействовать с функциональными эпитопами на первом и втором полипептиде; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могут взаимодействовать с полипептидными функциональными эпитопами. Предпочтительные последовательности пептидных линкеров содержат остатки Gly, Asn и Ser. Другие, близкие к нейтральным аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут использоваться в линкерной последовательности. Аминокислотные последовательности, которые могут удобно применяться в качестве линкеров, включают те, что описаны Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; в патенте США № 4935233 и патенте США № 4751180. Линкерная последовательность может составлять в основном от 1 примерно до 50 аминокислот в длину. Линкерные последовательности не требуются, когда первый и второй полипептиды обладают несущественными N-концевыми областями, которые могут применяться для разделения функциональных доменов и предотвращения стерического препятствия.

Лигированные последовательности ДНК функционально связаны с транскрипционными или трансляционными регуляторными элементами. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, локализованы только в 5'-направлении от последовательности ДНК, кодирующей первые полипептиды. Сходным образом, стоп-кодоны, требуемые для окончания трансляции и сигналы терминации транкрипции присутствуют только в 3'-направлении от последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид.

Полипептид слияния может включать описанный здесь полипептид вместе с неродственным иммуногенным белком, таким как иммуногенный белок, способный усилить обратный ответ. Примеры таких белков включают белки возбудителей столбняка, туберкулеза и гепатита (см., например, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997).

В одном из предпочтительных осуществлений иммунологический партнер слияния происходит из Mycobacterium sp., как фрагмент Ra12, происходящий из Mycobacterium tuberculosis. Композиции Ra12 и способы их применения для усиления экспрессии и/или иммуногенности последовательностей гетерологических полинуклеотидов/полипептидов описаны в патентной заявке США 60/158585, описание которой включено сюда полностью в качестве ссылки. В кратком изложении, Ra12 относится к полинуклеотидной области, которая представляет собой субпоследовательность нуклеиновой кислоты Mycobacterium tuberculosis MTB32A. MTB32A представляет собой сериновую протеазу с молекулярной массой 32 кДа, кодируемую геном вирулентных и невирулентных штаммов M. tuberculosis. Описаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность MTB32A (например, патентная заявка США 60/158585, см. также Skeiky et al., Infection, and Immun. (1999) 67:3998-4007, включенную сюда в качестве ссылки). C-концевые фрагменты кодирующей последовательности MTB32A экспрессируются в высоких концентрациях и остаются в виде растворимых полипептидов по ходу процедуры очистки. Более того, Ra12 может усиливать иммуногенность гетерологичных иммуногенных полипептидов, с которыми он слит. Один из предпочтительных полипептидов слияния с Ra12 включает 14 кДа C-концевой фрагмент, соответствующий аминокислотным остаткам MTB32A с 192 до 323. Другие предпочтительные полинуклеотиды Ra12 в основном включают, по крайней мере, около 15 следующих друг за другом нуклеотидов, по крайней мере, около 30 нуклеотидов, по крайней мере, около 60 нуклеотидов, по крайней мере, около 100 нуклеотидов, по крайней мере, около 200 нуклеотидов, по крайней мере, около 300 нуклеотидов, которые кодируют часть полипептида Ra12. Полинуклеотиды Ra12 могут включать нативную последовательность (т.е., эндогенную последовательность, которая кодирует полипептид Ra12 или его часть) или может включать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотида Ra12 могут содержать одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок, таких что биологическая активность кодируемого полипептида слияния существенно снижается по отношению к таковой полипептида слияния, включающего нативный полипептид Ra12. Варианты предпочтительно проявляют, по крайней мере, около 70% идентичности, предпочтительнее, по крайней мере, около 80% идентичности, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, около 90% идентичности по отношению к полинуклеотидной последовательности, кодирующей нативный полипептид Ra12 или его часть.

В других предпочтительных осуществлениях иммунологический партнер слияния происходит от белка D, поверхностного белка грамотрицательной бактерии Haemophilus influenza B (WO 91/18926). Предпочтительно, производное от белка D включает приблизительно первую треть белка (например, первые N-концевые 100-110 аминокислот), и производное белка D может быть липидировано. В конкретных предпочтительных осуществлениях первые 109 остатков партнера слияния на основе липопротеина D включены с N-конца для получения полипептида с дополнительными экзогенными T-клеточными эпитопами и для увеличения уровня экспрессии в E. coli (таким образом они функционируют как усилитель экспрессии). Липидный "хвост" обеспечивает оптимальное представление антигена антиген-презентирующим клеткам. Другие партнеры слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа, NS1 (гемаглютинин). Обычно применяют 81 N-концевых аминокислот, хотя могут использоваться разные фрагменты, которые включают Т-хелперные эпитопы.

В другом осуществлении иммунологический партнер слияния представляет собой LYTA или его часть (предпочтительно, C -концевую часть). LYTA происходит из Streptococcus pneumoniae, который синтезирует N-ацетил-L-аланинамидазу, известную как амидаза LYTA (кодируемая геном LytA; Gene 43: 265-292, 1986). LYTA представляет аутолизин, который специфично разрушает некоторые связи в пептидогликановом скелете. C-концевой домен белка LYTA отвечает за сродство к холину или некоторых аналогов холина, таких как DEAE. Данное свойство используется для разработки экспрессирующих C-LYTA плазмид E. coli, которые могут для экспрессии слитых белков. Описана очистка гибридных белков, содержащих фрагмент C-LYTA на N-конце (см. Biotechnology 10:795-798, 1992). В предпочтительном осуществлении часть LYTA с повторами может включаться в полипептид слияния. Часть с повторами обнаружена в C-концевой области, начиная с остатка 178. Особенно предпочтительная часть с повторами включает остатки 188-305.

Еще одно иллюстративное осуществление включает слитые белки и кодирующие их полинуклеотиды, где партнер слияния включает нацеленный сигнал, способный направлять полипептид в эндосомальный/лизосомальный компартмент, как описано в патенте США № 5663234. Иммуногенный пептид по изобретению при слиянии с данным нацеленным сигналом будет более эффективно ассоциироваться с молекулами МНС II класса и таким образом обеспечит усиленную стимуляцию in vivo CD4⁺-Т-клеток, специфичных к данному полипептиду.

Полипептиды по изобретению получают с использованием любого из разнообразных хорошо известных синтетических и/или рекомбинантных способов, последние из которых далее описаны ниже. Полипептиды, части и другие варианты, в основном меньших размеров, чем примерно 150 аминокислот, могут генерироваться синтетическими средствами, с использованием способов, хорошо известных обычным специалистам в данной области. В одном из иллюстративных примеров такие полипептиды синтезируют с использованием любого из коммерчески доступных твердофазных способов, таких как способ твердофазного синтеза Меррифильда, где аминокислоты последовательно добавляют к растущей аминокислотной цепи. См. Merrifield, J Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963. Оборудование для автоматического синтеза полипептидов является коммерчески доступным от таких поставщиков, как Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA), и может управляться по инструкциям производителя.

Вообще, полипептидные композиции (включая полипептиды слияния) по изобретению являются выделенными. "Выделенным" полипептидом является тот, который удален из своего изначального окружения. Например, встречающийся в природе белок или полипептид является выделенным, если он отделен от некоторых или от всех сосуществующих в природной системе веществ. Предпочтительно, такие полипептиды также являются очищенными, например являются чистыми, по крайней мере, примерно на 90%, более предпочтительно, чистыми, по крайней мере, примерно на 95%, и наиболее предпочтительно, чистыми, по крайней мере, примерно на 99%.

Полинуклеотидные композиции

Настоящее изобретение в других аспектах относится к полинуклеотидным композициям. Термины "ДНК" и "полинуклеотид" используются здесь, по существу, взаимозаменяемо, и относятся к молекуле ДНК, которая выделена в отсутствие всей геномной ДНК данного вида. "Выделенная" при использовании здесь означает, что полинуклеотид, по существу, удален от других кодирующих последовательностей, и что молекула ДНК не содержит больших количеств неродственной кодирующей ДНК, таких как большие хромосомные фрагменты или другие функциональные гены или кодирующие полипептид области. Это, конечно, относится к ДНК, которая была изначально выделена, и не исключает генов или кодирующих областей, добавленных к сегменту позже действиями человека.

Как понятно специалистам в данной области, полинуклеотидные композиции по настоящему изобретению могут включать геномные последовательности, внегеномные и кодируемые плазмидами последовательности и меньшие сконструированные генные сегменты, которые экспрессируют, или могут быть приспособлены для экспрессии белков, полипептидов, пептидов и тому подобного. Такие сегменты могут быть выделены из природных источников или модифицированы синтетически действиями человека.

Как также ясно специалисту в данной области, полинуклеотиды по изобретению могут быть одноцепочечными (кодирующая или антисмысловая) или двухцепочечными, и могут представлять собой молекулы ДНК (геномные, кДНК или синтетические) или РНК. Молекулы РНК могут включать молекулы Hn-РНК, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК "один-в-один", молекулы мРНК, не содержащие интронов. В составе полинуклеотида по настоящему изобретению могут быть необязательно представлены дополнительные кодирующие и некодирующие последовательности, и полинуклеотид может быть необязательно связан с другими молекулами и/или материалами подложки.

Полинуклеотиды могут включать природную последовательность (т.е., эндогенную последовательность, которая кодирует полипептид/белок по изобретению или его часть) или может включать последовательность, которая кодирует вариант или производное, предпочтительно, иммуногенный вариант или производное такой последовательности.

Поэтому по другому аспекту настоящего изобретения предоставляются полинуклеотидные композиции, которые включают некоторые или все полинуклеотидные последовательности, приведенные в любом из SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583, последовательности, комплементарные полинуклеотидной последовательности, приведенной в любом из SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583, и вырожденные варианты полинуклеотидной последовательности, приведенной в любом из SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583. В конкретных предпочтительных осуществлениях приведенные здесь полинуклеотидные последовательности кодируют иммуногенные полипептиды, как описано выше.

В других связанных осуществлениях настоящее изобретение относится к полинуклеотидным вариантам, характеризующимся существенной идентичностью по отношению к последовательностям, описанным здесь в SEQ ID NO: 217-390, 392, 394, 396, 398-420, 422-424, 428-433 и 440-583, например, к тем, что включают по крайней мере, 70% идентичности по последовательности, предпочтительно, по крайней мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% или выше идентичности по последовательности по сравнению с полинуклеотидной последовательностью по данному изобретению, с использованием описанных здесь способов (например, BLAST-анализа с применением стандартных параметров, как описано ниже). Специалист в данной области поймет, что данные значения могут подходящим образом видоизменены для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, беря в расчет вырожденность кодонов, аминокислотное сходство, позиционирование рамки считывания и тому подобное.

Обычно, полинуклеотидные варианты содержат одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок, предпочтительно таких, что иммуногенность полипептида, кодируемого вариантным полинуклеотидом, существенно не снижается по отношению к таковой полипептида, кодируемого конкретно приведенной здесь полинуклеотидной последовательностью. Термин "варианты" следует также понимать как охватывающий гомологичные гены чужеродного происхождения.

В дополнительных осуществлениях настоящее изобретение относится к полинуклеотидным фрагментам, содержащим разной длины следующие друг за другом отрезки последовательности, идентичной или комплементарной одной или нескольким описанным здесь последовательностям. Например, к данному изобретению относятся полинуклеотиды, которые включают, по крайней мере, примерно 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 или 1000, или более следующих друг за другом нуклеотидов одной или нескольких описанным здесь последовательностей, а также участки промежуточной между указанными длины. Легко понять, что "промежуточная длина" в данном контексте означает любую длину между приведенными значениями, такую как 16, 17, 18, 19, и т.д.; 21, 22, 23, и т.д.; 30, 31, 32, и т.д.; 50, 51, 52, 53, и т.д.; 100, 101, 102, 103, и т.д.; 150, 151, 152, 153, и т.д.; включая все целые числа между 200-500; 500-1000 и тому подобное.

В другом осуществлении изобретения предоставляются полинуклеотидные композиции, способные гибридизоваться при умеренных до жестких условиях с описанной здесь полинуклеотидной последовательностью или ее фрагментом, или комплементарной ей последовательностью. Способы гибридизации хорошо известны в области молекулярной биологии. В целях иллюстрации, подходящие умеренно жесткие условия для тестирования гибридизации полинуклеотида по данному изобретению с другими полинуклеотидами включают предварительную промывку в растворе 5×SSC, 0,5% SDS, 1,0 мМ EDTA (pH 8,0); гибридизацию при 50°C-60°C, 5×SSC, в течение ночи; с последующей двукратной промывкой при 65°C в течение 20 минут каждый раз 2×, 0,5× и 0,2×SSC, содержащим 0,1% SDS. Специалист в данной области поймет, что жесткостью гибридизации можно легко управлять, например, изменением содержания соли в растворе гибридизации и/или температуры, при которой проводится гибридизация. Например, в другом осуществлении, подходящие высокожесткие условия гибридизации включают те, что описаны выше, за исключением того, что температуру гибридизации повышают, например, до 60-65°C или 65-70°C.

В некоторых предпочтительных осуществлениях вышеописанные полинуклеотиды, например полинуклеотидные варианты, фрагменты и гибридизующиеся последовательности, кодируют полипептиды, которые обладают перекрестной иммунореактивностью с конкретно приведенной здесь полипептидной последовательностью. В других предпочтительных осуществлениях такие полинуклеотиды кодируют полипептиды, характеризуются уровнем иммуногенной активности, составляющим по крайней мере 50%, предпочтительно, по крайней мере 70%, и более предпочтительно, по крайней мере в 90% от уровня иммуногенной активности приведенной здесь полипептидной последовательности.

Полинуклеотиды по настоящему изобретению или их фрагменты независимо от длины кодирующей последовательности как таковой, могут комбинироваться с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты рестикционных ферментов, множественные сайты клонирования, другие кодирующие сегменты, и тому подобное, так что общая длина может заметно варьировать. Поэтому предполагается использование фрагмента нуклеиновой кислоты почти любой длины, с общей длиной, которая предпочтительно должна быть ограничена простотой получения и применением назначенного протокола рекомбинантной ДНК. Например, предполагается, что иллюстративные полинуклеотидные сегменты с общей длиной, составляющей около 10000, около 5000, около 3000, около 2000, около 1000, около 500, около 200, около 100, около 50 пар оснований и тому подобные (включая все промежуточные длины) могут использоваться во многих осуществлениях данного изобретения.

При сравнении полинуклеотидных последовательностей о двух последовательностях говорят, что они "идентичны", если последовательность нуклеотидов в двух последовательностях совпадает при выравнивании до максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят путем сопоставления последовательностей по окнам сравнения для идентификации и сравнения областей локального сходства последовательностей. При использовании здесь, "окно сравнения" относится к сегменту, состоящему по крайней мере примерно из 20 следующих друг за другом положений, обычно от 30 примерно до 75, от 40 примерно до 50, в котором последовательность может сравниваться с последовательностью сравнения с тем же числом следующих друг за другом положений, после того, как две последовательности подвергли оптимальному выравниванию.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться с использованием программы Megalign в пакете биоинформатических программ Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), применяя параметры по умолчанию. Данная программа реализует несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D. G. and Sharp, P. M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E. W. and Muller W. (1988), CABIOS 4:11-17; Robinson, E. D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P. H. A. and Sokal, R. R. (1973) -erical Taxonomy -the Principles and Practice of -erical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W. J. and Lipman, D. J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730.

Альтернативно, оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может проводиться по алгоритму локальной идентичности Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482, по алгоритму идентичности выравнивания Needleman and Wunsch (1970) J Mol. Biol. 48:443, by the search for similarity methods of Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, путем компьютеризованных осуществлений данных алгоритмов (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), или путем экспертизы.

Одним из предпочтительных примеров алгоритмов, которые подходят для определения процентной идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST 2.0, описанные Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 и Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, соответственно. BLAST и BLAST 2.0 могут, например, использоваться, с описанными здесь параметрами, для определения процентной идентичности последовательностей полинуклеотидов по изобретению. Программное обеспечение для выполнения анализов BLAST является общественно доступным через National Center for Biotechnology Information. В одном из иллюстративных примеров значения кумулятивного счета могут быть вычислены, с использованием для нуклеотидных последовательностей параметров М (счет награды за пару совпавших остатков; всегда >0) и N (штрафной счет для не совпавших остатков; всегда <0). Расширение коротких участков совпадения (слов) в каждом направлении прекращается, когда кумулятивный счет выравнивания уменьшается на количество Х от его максимально достигнутого значения; когда кумулятивный счет становится равным нулю или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательным счетом; или когда достигается конец каждой из последовательностей. Параметры алгоритма BLAST W, T и Х определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) применяются в качестве параметров по умолчанию длина слова (W), равная 11, и ожидание (E), равное 10, и выравнивания с матрицей счета BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915), (B), равные 50, ожидание (E), равное 10, M=5, N=-4, и сравнение обеих цепей.

Предпочтительно, "процент идентичности по последовательности" определяется путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей при окне сравнения, включающем по крайней мере 20 положений, где часть полипептидной последовательности в окне сравнения может включать добавления или делеции (т.е., вставки) в количестве 20 процентов или менее, обычно от 5 до 15 процентов, или от 10 до 12 процентов, по отношению к последовательностям сравнения (которые не включают добавления или делеции), для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процентное отношение рассчитывают путем определения числа положений, в которых идентичное основание нуклеиновой кислоты имеет место в обеих последовательностях с получением числа совпавших положений, деления числа совпавших положений на общее число положений в последовательности сравнения (т.е., размер окна), и умножения результатов на 100 с получением процентного выражения идентичности последовательности.

Обычному специалисту в данной области понятно, что из-за вырожденности генетического кода, имеется много нуклеотидных последовательностей, кодирующих описанный здесь полипептид. Некоторые из данных полинуклеотидов имеют минимальную гомологию по отношению к нуклеотидной последовательности какого-либо нативного гена. Несмотря на это, полинуклеотиды, варьирующие вследствие употребления кодонов, конкретно рассматриваются настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, включающих описанные здесь полинуклеотидные последовательности, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые изменяются в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеций, добавлений и/или замен нуклеотидов. Полученные в результате мРНК и белок могут необязательно обладать измененной структурой или функцией. Аллели можно идентифицировать стандартными способами (такими как гибридизация, амплификация и/или сравнение последовательностей из баз данных).

Поэтому в другом осуществлении изобретения применяется подход мутагенеза, такой как сайт-специфический мутагенез, для получения иммуногенных вариантов и/или производных полипептидов, описанных здесь. С помощью этого подхода могут быть получены специфические модификации в последовательности полипептида, посредством мутагенеза основных полинуклеотидов, кодирующих его. Такие способы обеспечивают прямые подходы для приготовления и тестирования вариантов последовательности, например, объединяя одно или несколько предшествующих соображений, путем введения одного или нескольких изменений нуклеотидной последовательности в полинуклеотид.

Сайт-специфический мутагенез позволяет посредством использования специфических олигонуклеотидных последовательностей получать мутанты, которые кодируют последовательность ДНК с требуемой мутацией, а также достаточное число близлежащих нуклеотидов, для обеспечения последовательности праймера с достаточным размером и сложностью последовательности для формирования стабильного дуплекса на обоих сторонах пересекаемого соединения после делеции. Мутации можно применять в выбранной полинуклеотидной последовательности для улучшения, изменения, уменьшения модификации или других способов изменения свойств самого полинуклеотида и/или изменения свойств, активности, строения, стабильности или первичной последовательности кодируемого полипептида.

В определенных воплощениях настоящего изобретения изобретатели предусматривают мутагенез описанной полинуклеотидной последовательности для изменения одного или нескольких свойств кодируемого полипептида, такого как иммуногенность полипептидной вакцины. Способы сайт-специфического мутагенеза хорошо известны в данной области и широко используются для создания вариантов и полипептидов и полинуклеотидов. Например, сайт-специфический мутагенез часто используют для изменения специфической части молекулы ДНК. В таких осуществлениях, праймер, соответствующий обычно примерно 14-25 нуклеотидам в длину или подобный применяется с примерно 5-10 остатками на обеих сторонах контакта изменяемой последовательности.

В способах сайт-специфического мутагенеза часто применяют фаговый вектор, высоко оцененный у специалистов в данной области, который существует и в одноцепочечной и в двухцепочечной форме. Типичные векторы пригодные в сайт-специфическом мутагенезе включают такие векторы как фаг M13. Этот фаг легко доступен коммерчески и его использование вообще хорошо известно у специалистов в данной области. Двухцепочечные плазмиды также регулярно применяются для сайт-специфического мутагенеза, который исключает этап перенесения интересующего гена из плазмиды в фаг.

Вообще, сайт-специфический мутагенез в соответствии с этим проводили у полученного одноцепочечного вектора или разделенных путем плавления двух цепей двухцепочечного вектора, включающего последовательность ДНК, кодирующую требуемый пептид. Получают, главным образом путем синтеза, нуклеотидный праймер, несущий требуемую мутантную последовательность. Этот праймер затем отжигают с одноцепочечным вектором, и подвергают обработке ДНК-полимеризующими ферментами, такими как фрагмент Кленова полимеразы I из E. coli, для того, чтобы закончить синтез несущей мутацию цепи. Таким образом, формируется гетеродуплекс, где одна из цепей кодирует оригинальную немутантную последовательность, а вторая цепь несла требуемую мутацию. Этот гетеродуплексный вектор использовали затем для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки E. coli, у которых отбирали клоны, включившие рекомбинантные векторы, несущие мутантную последовательность.

Получение вариантов последовательностей выбранных областей ДНК, кодирующих пептид, с использованием способа сайт-специфического мутагенеза обеспечивает средства для продукции потенциально полезных разновидностей и, как предполагается, не лимитирует каких-либо других путей, которыми могут быть получены варианты последовательностей пептидов или последовательностей ДНК, кодирующих их. Например, для получения вариантов последовательностей рекомбинантные векторы, кодирующие необходимые пептидные последовательности, можно обработать мутагенными агентами, такими как гидроксиламин. Конкретные детали, касающиеся данных способов и протоколов, обнаружены в руководствах Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; и Maniatis et al., 1982, каждое из которых включено сюда для этой цели.

Используемый здесь термин "способ направленного олигонуклеотидом мутагенеза" относится к матрично-зависимым процессам и опосредованному вектором размножению, результатом которых является увеличение концентрации специфических молекул нуклеиновой кислоты относительно их начальной концентрации или увеличение концентрации детектируемого сигнала, такого как амплификация. Используемый здесь термин "способ направленного олигонуклеотидом мутагенеза" относится к обозначению процесса, включающего матрично-зависимое удлинение молекулы праймера. Термин матрично-зависимый процесс относится к синтезу молекул нуклеиновой кислоты, РНК или ДНК, где последовательность вновь синтезируемой цепи нуклеиновой кислоты диктуется хорошо известными правилами комплементарности пар оснований (смотри, для примера, Watson, 1987). Обычно опосредованные вектором процедуры включают внесение фрагмента нуклеиновой кислоты в ДНК или РНК вектор, амплификацию клонов вектора и выделение амплифицированного фрагмента нуклеиновой кислоты. Примеры таких процедур, описанные патентом США № 4237224, включены сюда полностью в качестве ссылки.

При другом подходе для получения вариантов полипептидов по настоящему изобретению можно применять рекурсивную рекомбинацию последовательностей, как описано в патенте США № 5837458. При этом подходе, повторяющиеся циклы рекомбинации и скрининга или селекции проводят для "развития" индивидуальных полинуклеотидных вариантов по изобретению, обладающих, например, повышенной иммуногенной активностью.

В других осуществлениях настоящего изобретения, полинуклеотидные последовательности, описанные здесь, можно использовать преимущественно как зонды или праймеры для гибридизации нуклеиновых кислот. По существу, предполагается, что будут особенно полезны участки нуклеиновой кислоты, включающие область последовательности, состоящую из последовательности длинной, по крайней мере, примерно 15 смежных нуклеотидов, которая имеет такую же или комплементарную к описанной здесь последовательности длиной в 15 смежных нуклеотидов. Более длинные участки идентичных или комплементарных последовательностей, такие как приблизительно 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (включая все промежуточные длины) и даже до полноразмерных последовательностей, также могут найти применение в определенных осуществлениях.

Способность таких зондов нуклеиновой кислоты специфически гибридизоваться с интересующей последовательностью даст возможность использовать их для обнаружения присутствия комплементарных последовательностей в данном образце. Однако можно представить также другие возможности применения, такие как использование информации о последовательности для получения мутантных видов праймеров или праймеров для применения при получении других генетических конструкций.

Полинуклеотидные молекулы, имеющие последовательности, состоящие из областей последовательностей, состоящих из отрезков, следующих друг за другом нуклеотидов из 10-14, 15 -20, 30, 50 или даже 100-200 нуклеотидов или около этого (включая также промежуточные длины), идентичные или комплементарные к полинуклеотидным последовательностям, описанным здесь, конкретно рассматривают как зонды для использования, например, для саузерн- и нозерн-блотинга. Это позволит проанализировать продукт гена или его фрагмента в обоих различных типах клеток, а также в различных бактериальных клетках. Общий размер фрагмента, так же, как и размер комплементарного(ых) отрезка(ов), будет зависеть в основном от предполагаемого использования или применения конкретного сегмента нуклеиновой кислоты. Меньшие фрагменты будут в основном находить применение в осуществлениях гибридизации, где длину прилегающей комплементарной области можно варьировать в таких пределах, как примерно от 15 до 100 нуклеотидов, но можно использовать и более длинные прилегающие комплементарные участки, соответственно длине комплементарным последовательностям, которые требуется обнаружить.

Использование зондов длиной примерно 15-25 нуклеотидов позволяет формировать дуплексную молекулу, которая как стабильна, так и селективна. Молекулы, имеющие прилегающие комплементарные последовательности по отрезкам больше чем 15 оснований в длину, в общем, предпочтительны, хотя бы, для того, чтобы увеличить стабильность и селективность гибрида и улучшить, таким образом, качество и степень полученных специфических гибридных молекул. В основном, предпочтительным является конструировать молекулы нуклеиновой кислоты, имеющие участки, комплементарные генам, из 15-25 следующих друг за другом нуклеотидов или даже длиннее, если необходимо.

Зонды можно отбирать из любой части любой из последовательностей описанных здесь. Все, что требуется, это обзор приведенных здесь последовательностей или любой протяженной часть последовательностей длиной примерно от 15 -25 нуклеотидов и выше, включая полноразмерную последовательность, которую требуется использовать как зонд или праймер. Выбор зонда или последовательности праймера может обуславливаться различными факторами. Например, может возникнуть потребность применять праймеры к концу всей последовательности.

Маленькие полинуклеотидные участки или фрагменты можно легко получить, например, прямым синтезом фрагментов химическими способами, как это обычно и происходит, используя автоматический олигонуклеотидный синтезатор. Фрагменты также можно получить посредством применения способа репродукции нуклеиновой кислоты, такого как PCR™ из патента США 4683202 (включенного сюда в качестве ссылки), посредством введения избранных последовательностей в рекомбинантные векторы для рекомбинантного получения и посредством других способов рекомбинантных ДНК, известных, главным образом, специалистам в области молекулярной биологии.

Нуклеотидные последовательности изобретения можно использовать из-за их способности селективно формировать дуплексные молекулы с комплементарными участками целого гена или интересующих фрагментов гена. В зависимости от предполагаемого использования, обычно требуется применять различные условия гибридизации, для достижения различной степени селективности зонда к целевой последовательности. Для применений, требующих высокой селективности, обычно требуется применять относительно жесткие условия для формирования гибридов, например, необходимо выбрать условия с относительно низкой концентрацией солей и/или высокой температурой, такие, которые обеспечиваются концентрацией соли примерно от 0,02 М до 0,15 М при температуре примерно от 50°C до 70°C. Такие селективные условия почти не допускают, если вообще допускают, несоответствие между зондом и образцом или цепью-мишенью, и особенно подходят для изолирования сходных последовательностей.

Конечно, для некоторых применений, например, где требуется получение мутантов с использованием цепи мутантного праймера, гибридизованного с подлежащим образцом, обычно необходимы менее строгие (сниженная жесткость) условия гибридизации для того, чтобы позволить формирование гетеродуплекса. При этих обстоятельствах, может понадобиться применение условий содержания солей, таких как примерно от 0,15 М до 0,9 М при колебаниях температуры примерно от 20°C до 55°C. Перекрестно-гибридизующиеся виды могут, таким образом, быть легко идентифицированы, как позитивно гибридизующиеся сигналы, по отношению к контрольным гибридизациям. В любом случае, в общем, принимается во внимание, что условия можно привести к более жестким, путем добавления увеличенных количеств формамида, который служит для дестабилизации гибридного дуплекса таким же образом, как и более высокая температура. Так, условиями гибридизации можно легко манипулировать и, таким образом, они, в общем, могут являться методом выбора, в зависимости от требуемых результатов.

Соответственно другому осуществлению настоящего изобретения, предоставляются полинуклеотидные композиции, включающие антисмысловые олигонуклеотиды. Как было показано, антисмысловые олигонуклеотиды являются эффективными и направленными ингибиторами синтеза белка и, следовательно, предоставляют терапевтический подход, посредством которого можно лечить заболевание посредством ингибирования синтеза белков, которые способствуют заболеванию. Эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза белка хорошо доказана. Например, синтез полигалактоуроназы и ацетилхолинового рецептора мускарина 2-го типа ингибируется антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными к их соответствующим последовательностям мРНК (патент США 5739119 и патент США 5759829). Кроме того, примеры антисмыслового ингибирования были показаны с ядерным белком циклином, геном множественной лекарственной устойчивости (MDG1), ICAM-1, E -селектином, STK-1, рецепторе GABA_A полосатых тел и человеческим EGF (Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10; 240(4858):1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989; 1(4):225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Juh 15; 57(2):310-20; патент США 5801154; патент США 5789573; патент США 5718709 и патент США 5610288). Также описанные антисмысловые конструкции ингибируют и могут быть использованы для лечения разнообразных случаев ненормальной клеточной пролиферации, например, злокачественных опухолей (патент США 5747470; патент США 5591317; патент США 5783683).

Поэтому, в определенных осуществлениях, настоящее изобретение относится к олигонуклеотидным последовательностям, которые включают в себя все или части любой последовательности, которая способна специфически связываться с полинуклеотидной последовательностью, описанной здесь, или комплементарной ей последовательностью. В одном осуществлении антисмысловые олигонуклеотиды включают ДНК или ее производные. В другом осуществлении олигонуклеотиды включают РНК или ее производные. В третьем осуществлении олигонуклеотиды являются модифицированными ДНК, содержащими модифицированный фосфоротиокислотой остов. В четвертом осуществлении, олигонуклеотидные последовательности содержат пептидные нуклеиновые кислоты или их производные. В каждом случае, предпочтительные композиции содержат область последовательности, которая комплементарна и, более предпочтительно, высоко комплементарна, и даже более предпочтительно, полностью комплементарна одной или нескольким частям описанных здесь полинуклеотидов. Выбор антисмысловых композиций специфических к данной генной последовательности основывается на анализе выбранной целевой последовательности и определении вторичной структуры, T_m, энергии связывания и относительной стабильности. Антисмысловые композиции можно выбрать, основываясь на их относительной неспособности формировать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые могут ослаблять или препятствовать связыванию к целевой мРНК в клетке-хозяине. Высокопредпочтительны те целевые области мРНК, которые расположены у кодона инициации трансляции AUG или близко от него и те последовательности, которые высококомплементарны к 5'-областям мРНК. Эти анализы вторичных структур и соображения по выбору целевых участков можно провести, например, используя версию 4 программного обеспечения OLIGO для анализа праймеров и/или алгоритмическое программное обеспечение BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402).

Предполагается также использование способа доставки антисмысловой последовательности, применяющего короткий пептидный вектор, называемый MPG (27 остатков). Пептид MPG содержит гидрофобный домен, происходящий из последовательности слияния HIV gp41 и гидрофильного домена из последовательности Т-антигена SV40 с ядерной локализацией (Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15; 25(14):2730 -6). Показано, что несколько молекул пептида MPG покрывают антисмысловые олигонуклеотиды и могут быть доставлены в культивируемые клетки млекопитающих менее чем за 1 час с относительно высокой эффективностью (90%). Более того, взаимодействие с MPG сильно увеличивает как стабильность олигонуклеотида к нуклеазе, так и возможность пересечь плазматическую мембрану.

Соответственно другому осуществлению настоящего изобретения полинуклеотидные композиции, описанные здесь, используют для проектирования и получения молекул рибозимов для подавления экспрессии опухолевых полипептидов и белков настоящего исследования в опухолевых клетках. Рибозимы являются РНК-белковыми комплексами, которые расщепляют нуклеиновые кислоты сайт-специфическим образом. Рибозимы содержат специфические каталитические домены, которые обладают эндонуклеазной активностью (Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Dec; 84(24):8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24; 49(2):211-20). Например, большое число рибозимов ускоряют реакции фосфоэфирного обмена с высокой степенью специфичности, часто расщепляя только один из нескольких фосфоэфиров в олигонуклеотидном субстрате (Cech et al., Cell. 1981 Dec; 27(3 Pt 2):487-96; Michel and Westhof, J. Mol. Biol. 1990 Dec 5; 216(3):585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14; 357(6374):173-6). Такая специфичность объяснялась требованием связывания субстрата посредством взаимодействия пар оснований с внутренней адапторной последовательностью ("IGS") предшествующего химической реакции.

В настоящее время известно шесть вариантов природных энзиматических РНК. В физиологических условиях каждая может катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей РНК в транс-положении (и, таким образом, может расщеплять другие молекулы РНК). Вообще, энзиматические нуклеиновые кислоты действуют посредством первичного связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит с помощью части энзиматических нуклеиновых кислот, связывающей мишень, которая удерживается в непосредственной близости от ферментной части молекулы, которая расщепляет РНК-мишень. Так энзиматическая нуклеиновая кислота сначала распознает, а затем связывает субстратную РНК посредством образования комплементарных пар нуклеотидов и, связавшись с правильным участком, ферментно расщепляет субстратную РНК. Оперативное расщепление таких субстратных РНК разрушает их способность направлять синтез кодируемого белка. После того как энзиматическая нуклеиновая кислота связалась и расщепила РНК-мишень, она освобождается от этой РНК для поиска другой мишени и может повторно связывать и расщеплять новые мишени.

Ферментная природа рибозима имеет преимущества при использовании во многих технологиях, таких как технология антисмысловых последовательностей (где молекула нуклеиновой кислоты просто связывается с целевой нуклеиновой кислотой, блокируя ее трансляцию), так как концентрация рибозима, необходимая для оказания терапевтического воздействия, является более низкой, чем таковая антисмыслового олигонуклеотида. Это преимущество отражает способность рибозима действовать как фермент. Так, одна молекула рибозима способна расщепить многие молекулы РНК-мишени. В дополнение, рибозим является высоко специфичным ингибитором, у которого специфичность ингибирования зависит не только от механизма связывания оснований с РНК-мишенью, но и на механизме расщепления РНК-мишени. Одиночные несоответствия или замены оснований, рядом с участком расщепления могут полностью уничтожить каталитическую активность рибозима. Схожие несоответствия в молекулах антисмысловых последовательностей не мешают их действию (Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 Aug. 15; 89(16):7305-9). Так, специфичность действия рибозима выше, чем у олигонуклеотида антисмысловой последовательности, связывающего тот же самый участок РНК.

Ферментативная молекула нуклеиновой кислоты может образовываться в РНК молотообразной структуры, шпильки, вируса гепатита δ, интрона группы I или РНКазы P (в связи с направляющей последовательностью РНК) или РНК-мотиве Neurospora VS. Примеры мотивов молотообразной структуры описаны Rossi et al., Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20(17):4559-65. Примеры мотивов шпильки описаны Hampel et al. (публикация заявки на выдачу Европейского патента № ЕР 0360257), Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13; 28(12):4929-33; Hampel et al. Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25; 18(2):299-304 и патент США 5631359. Пример мотива вируса гепатита δ описан Perrotta and Been, Biochemistry, 1992 Dec 1; 31(47):11843-52; пример мотива РНКазы P описан Guerrier -Takada et al., Cell. 1983 Dec; 35(3 Pt 2):849-57; мотив РНК рибозима нейроспоры VS описан Collins (Saville and Collins, Cell. 1990 May 18; 61(4):685-96; Saville and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 Oct 1; 88(19):8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar. 23; 32(11):2795-9); и пример интрона группы I описан в патенте США 4987071. Все, что имеет значение в молекуле энзиматической нуклеиновой кислоты по этому изобретению, это то, что она имеет специфический субстрат-связывающий участок, который комплементарен к одному или нескольким участкам РНК гена-мишени, и то, что она имеет нуклеотидную последовательность в пределах этого субстрат-связывающего участка или около него, которая придает молекуле активность в плане расщепления РНК. Таким образом, рибозимные конструкции не должны быть ограничены указанными здесь специфическими мотивами.

Рибозимы можно проектировать, как описано в Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569 и Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595 (каждый специально включен сюда в качестве ссылки) и, как описано, синтезировать для тестирования in vitro и in vivo. Такие рибозимы также могут быть оптимизированы для доставки. Хотя приведены конкретные примеры, специалистам в данной области ясно, что при необходимости могут быть задействованы эквивалентные РНК-мишени других видов.

Рибозимную активность можно оптимизировать изменением длины связывающих плеч рибозима или синтезом рибозимов с модификациями, которые предотвращают их деградацию сывороточными рибонуклеазами (см., например, Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 92/07065; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/15187; Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 91/03162; европейский патент Appl. Publ. No. 92110298.4; патент США 5334711; и Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/13688, которые описывают различные модификации, которые можно проделать с сахарными компонентами молекул энзиматических РНК), с модификациями, которые увеличивают их эффективность в клетках и удалением оснований стебля II для сокращения периодов синтеза РНК и снижения требований к химии.

Sullivan et al. (Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595) описывают основные способы доставки молекул энзиматической РНК. Рибозимы могут быть направлены в клетки различными способами, известными специалистам в этой области, включая, инкапсуляцию в липосомы, ионтофорез (iontophoresis) или помещение в другие транспортеры, такие как гидрогели, циклодекстрины, биодеградируемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы, но не ограничиваясь данными способами. При некоторых показаниях, рибозимы можно доставлять непосредственно в клетки или ткани ex vivo с вышеуказанными носителями или без них. Альтернативно, комбинация РНК/носитель может быть доставлена на место путем непосредственной ингаляции, путем инъекции или путем применения катетера, инфузионного насоса или стента. Другие маршруты доставки включают в качестве неограничивающих примеров внутрисосудистую, внутримышечную, подкожную или внутрисуставную инъекции, ингаляцию аэрозолем, оральный способ (таблетки или пилюли), местную, системную, глазную, внутрибрюшинную и/или интратекальную доставку. Более детальные описания доставки и применения рибозима описаны в Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 94/02595 and Int. Pat. Appl. Publ. No. WO 93/23569, каждый специально включен сюда в качестве ссылки.

Другими способами аккумулирования высоких концентраций рибозима(ов) в клетках является встраивание последовательности, кодирующей рибозим, в экспрессирующий ДНК-вектор. Транскрипция последовательности рибозима управляется промотором для эукариотических РНК-полимеразы I (pol I), РНК-полимеразы II (pol II) или РНК полимеразы III (pol III). Транскрипты с промоторов pol II или pol III будут экспрессироваться в клетках на высоком уровне, уровни для данного промотора pol II в данном типе клеток будут зависеть от природы присутствующих вблизи генных регулирующих последовательностей (энхансеры, сайленсеры и т.д.). Также могут применяться промоторы прокариотической РНК-полимеразы, при условии, что прокариотическая РНК-полимераза экспрессируется в соответствующих клетках. Такие транскрипционные единицы могут быть внедрены в ряд векторов для введения в клетки млекопитающих, включающие векторы ДНК плазмид, векторы ДНК вирусов (таких как аденовирусные и аденоассоциированные векторы) или векторы РНК вирусов (такие как ретровирусные векторы, векторы вирусов semliki forest и sindbis), но не ограничиваясь ими.

В другом осуществлении настоящего изобретения предоставляются пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК). ПНК имитируют ДНК, в которой нуклеотиды присоединены к псевдопептидному остову (Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4):431-37). ПНК возможно применять в ряде методов, которые традиционно применяют ДНК или РНК. Часто последовательности ПНК лучше функционируют в способах, чем соответствующие последовательности РНК или ДНК, и находят применение, которое не свойственно РНК или ДНК. Обзор ПНК, включая способы получения, ее характеристики и способы применения предоставлен Corey (Trends Biotechnol 1997 Jun; 15(6):224-9). По существу, в некоторых осуществлениях, можно получить последовательности ПНК, комплементарные к одной или нескольким частям последовательности ACE мРНК, и такие композиции ПНК можно применять для регуляции, изменения, снижения или уменьшения трансляции ACE-специфических мРНК и, таким образом, изменять уровень активности ACE в клетке-хозяине, к которой применена такая композиция ПНК.

ПНК содержат 2-аминоэтил-глициновые связи, замещающие нормальный фосфодиэфирный скелет ДНК (Nielsen. et al., Science 1991 Dec 6; 254(5037):1497-500; Hanvey et al., Science. 1992 Nov 27; 258(5087):1481-5; Hyrup and Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Jan; 4(1):5-23). Данная химия имеет три важных следствия: во-первых, в противоположность ДНК или фосфоротиоатным олигонуклеотидам, ПНК являются нейтральными молекулами, во-вторых, ПНК ахиральны, что позволяет избежать необходимости разрабатывать стереоселективный синтез, и, в-третьих, синтез ПНК использует стандартные протоколы Boc или Fmoc для твердофазного пептидного синтеза, несмотря на то, что используются другие способы, включая модифицированный способ Merrifield.

Мономеры ПНК или готовые олигомеры коммерчески доступны в PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). Синтез ПНК по каждому из протоколов Boc или Fmoc проводится, непосредственно используя руководства или автоматизированные протоколы (Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3(4):437-45). Протокол руководства служит для получения химически модифицированных ПНК или одновременного синтеза семейств близкородственных ПНК.

Как и при синтезе пептидов, успех конкретного синтеза ПНК зависит от свойств выбранной последовательности. Например, хотя в теории ПНК могут включать любую комбинацию нуклеотидных оснований, присутствие расположенных рядом пуринов может вести в продукте к делециям одного или нескольких остатков. В ожидании такой трудности предложено, что при получении ПНК с расположенными рядом пуринами следует повторять присоединение остатков, которые вероятно добавляются неэффективно. Это может следовать за очисткой ПНК с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии описанных продуктов и очисткой продуктов, подобной той, что проводится при синтезе пептидов.

Модификации ПНК для данных приложений могут быть проведены с помощью присоединения аминокислот в течение твердофазного синтеза или путем добавления соединений, которые содержат карбоксильные кислотные группы на незащищенном N-концевом амине. Альтернативно, ПНК могут быть модифицированы после синтеза путем присоединения к вставленным лизину или цистеину. Простота, с которой ПНК могут быть модифицированы, облегчает оптимизацию для улучшения растворимости или для специфических функциональных требований. После синтеза, идентичность ПНК и их производных можно подтвердить с помощью масс-спектрометрии. В некоторых исследованиях были получены и использованы модификации ПНК (например, Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3(4):437 -45; Petersen et al., J Pept Sci. 1995 May-Jun; 1(3):175-83; Orum et al., Biotechniques. 1995 Sep; 19(3):472 -80; Footer et al:, Biochemistry. 1996 Aug 20; 35(33):10673-9; Griffith et al., Nucleic Acids Res. 1995 Aug 11; 23(15):3003-8; Pardridge et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Jun 6; 92(12):5592-6; Boffa et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Mar 14; 92(6):1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood. 1996 Aug 15; 88(4):1411-7; Armitage et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1997 Nov 11; 94(23):12320-5; Seeger et al., Biotechniques. 1997 Sep; 23(3):512-7). В патенте США № 5700922 обсуждаются химерные молекулы ПНК-ДНК-ПНК и их применение в диагностике, модулировании белков организма и лечении состояний, чувствительных к терапии.

Способы характеристики свойств ПНК по связыванию антисмысловых последовательностей обсуждаются Rose (Anal Chem. 1993 Dec 15; 65(24):3545-9) and Jensen et al. (Biochemistry. 1997 Apr 22; 36(16):5072-7). Rose применяет капиллярный гель-электрофорез для определения связывания ПНК с комплементарным к ним олигонуклеотидом, измерения кинетики относительного связывания и стехиометрии. Простые типы измерений проведены Jensen et al., используя технологию BIAcore™.

Другие описанные применения ПНК, очевидные специалистам в данной области, включают применение во встраивании в ДНК-цепь, ингибировании антисмысловой последовательности, анализе мутаций, усилителях транскрипции, очищении нуклеиновых кислот, изоляции транскрипционно активных генов, блокировании связывания транскрипционных факторов, расщеплении генома, биосенсорах, гибридизации in situ и подобном.

Идентификация полинуклеотидов, характеристика и экспрессия

Полинуклеотидные композиции по настоящему изобретению можно идентифицировать, получить и/или манипулировать ими, используя любой из множества хорошо разработанных способов (в основном, см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 и другие подобные ссылки). Например, полинуклеотиды можно идентифицировать, как описано более детально ниже, скринируя микрополе кДНК для ассоциированной с опухолью экспрессии (то есть экспрессия, которая как минимум вдвое больше в опухоли, чем в нормальной ткани, как определено при применении репрезентативного анализа, описанного здесь). Например, такие скрининги можно проводить, используя технологию микрополей Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA), соответственно инструкциям производителя (и, по существу, как описано у (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 и Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997). Альтернативно, полинуклеотиды можно амплифицировать с кДНК, полученной из клеток, таких как опухолевые клетки, экспрессирующие протеины, описанные здесь.

Для амплификации интересующей последовательности-мишени, присутствующей в образце, доступны многие матрично-зависимые процессы. Одним из наиболее известных способов амплификации является полимеразная цепная реакция (PCR™), которая детально описана в патентах США №№ 4683195, 4683202 и 4800159, каждый из которых включен сюда полностью в качестве ссылки. Коротко, для PCR™ подготавливается две праймерных последовательности, которые комплементарны к областям на противоположных комплементарных цепях последовательности-мишени. К реакционной смеси добавляют избыток дезоксинуклеозидтрифосфатов вместе с ДНК-полимеразой (обычно Taq-полимераза). Если последовательность-мишень присутствует в образце, праймеры связываются с мишенью, и полимераза вызывает удлинение праймеров вдоль последовательности-мишени путем добавления нуклеотидов. Путем повышения и уменьшения температуры реакционной смеси, удлиненные праймеры диссоциируют с целью, формируя продукт реакции, избыток праймеров связывается с мишенью и с продуктом реакции и процесс повторяется. Для подсчета количества амплифицированной мРНК предпочтительно применять обратную транскрипцию и PCR™. Способы полимеразной цепной реакции хорошо известны в данной области.

Некоторое число других матрично-зависимых процессов, многие из которых являются вариантами способа амплификации PCR™, хорошо известны и доступны в данной области. Для демонстрации, некоторые из этих способов включают лигазную цепную реакцию (обозначается как LCR), описанную, например, в публикации европейской заявки на выдачу патента № 320308 и патенте США № 4883750; репликазу Q-бета, описанную в публикации международной патентной заявки PCT № PCT/US87/00880; амплификацию со смещением цепи (SDA) и реакцию восстановления цепи (RCR). Кроме того, другие способы амплификации описаны в заявке на выдачу патента Великобритании № 2202328 и в публикации международной патентной заявки PCT № PCT/US89/01025. Другие процедуры амплификации нуклеиновой кислоты, включают системы амплификации, основанной на транскрипции (TAS) (публикация международной патентной заявки PCT № WO 88/10315), включая амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA) и 3SR публикации европейской патентной заявки № 329822 описывает процесс амплификации нуклеиновой кислоты, вовлекающий циклически синтезируемую одноцепочечную РНК ("цсРНК"), цсДНК, двухцепочечую ДНК (днДНК). Публикации международной патентной заявки PCT № WO 89/06700 описывает схему амплификации последовательности нуклеиновой кислоты, основанную на гибридизации промоторной/праймерной последовательности к одноцепочечной ДНК-мишени ("цсДНК"), следующей за транскрипцией многих РНК-копий последовательности. Другие методы амплификации, такие как "RACE" (Frohman, 1990) и "односторонний PCR" (Ohara, 1989) также хорошо известны специалистам в данной области.

Применяя хорошо известные методы, амплифицированную часть полинуклеотида по настоящему изобретению можно применять для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотека опухолевых кДНК). При данном способе, библиотеку (кДНК или геномную) скринируют с применением одного или многих полинуклеотидных зондов или праймеров, пригодных для амплификации. Предпочтительно, чтобы размер библиотеки был подобран так, что она бы включала большие молекулы. Библиотеки, полученные с использованием случайных праймеров, могут быть предпочтительны для идентификации 5' -областей и областей генов, вверх от точки начала транскрипции генов. Геномные библиотеки предпочтительны для получения интронов и расширенных 5'-последовательностей.

Используя хорошо известные способы, для способов гибридизации могут быть помечены неполные последовательности (например, с использования ник-трансляции или концевого мечения с ³²P). Далее скринируют библиотеки бактерий или бактериофагов в основном путем гибридизации фильтров, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газон, содержащий фаговые бляшки) с мечеными зондами (см. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Выбирают и наращивают гибридизовавшиеся колонии или бляшки и выделяют ДНК для дальнейшего анализа. кДНК клоны можно анализировать чтобы определить количество дополнительных последовательностей с помощью, например, PCR, используя праймер из неполной последовательности и праймер из вектора. Могут быть рестрикционные карты и неполные последовательности получены, чтобы определить один или несколько перекрывающихся клонов. Полную последовательность можно определить, используя стандартные способы, которые могут включать генерацию делеционных клонов. Результирующие перекрывающиеся последовательности затем могут собираться в единственную непрерывную последовательность. Полноразмерная молекула кДНК может быть получена лигированием подходящих фрагментов, используя хорошо известные способы.

Альтернативно, способы амплификации, такие как описанные выше, могут быть полезны для получения полноразмерной кодирующей последовательности из неполных последовательностей кДНК. Одним из таких способов амплификации является инвертированная PCR (смотри Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988), которая использует ферменты рестрикции для получения фрагмента в известном регионе гена. Затем фрагмент циклизуют путем внутримолекулярного лигирования и используют как матрицу для PCR с различными праймерами, полученными из известной области. В пределах альтернативного подхода, последовательности, прилежащие к неполной последовательности, могут быть восстановлены с помощью амплификации с праймером к линкерной последовательности и праймеру специфичному к известной области. Амплифицированные последовательности обычно используют во втором раунде амплификации с таким же линкерным праймером и вторым праймером, специфичным к известной области. Варианты этой процедуры, которые используют два праймера из известной последовательности, которые инициируют расширение в противоположных направлениях, описаны в WO 96/38591. Другой такой способ известен как "быстрая амплификация концов кДНК" или RACE. Этот способ для идентификации 5' или 3' последовательностей известной последовательности включает использование внутреннего и внешнего праймеров, которые гибридизуются с polyA-областью или с векторной последовательностью. Дополнительные подходы включают "захватывающую" PCR (Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991) и "прогулочную" PCR (Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991). Другие подходы, использующие амплификацию, также могут быть применены для получения полноразмерной последовательности кДНК.

В определенных случаях, полноразмерную последовательность кДНК возможно получить с помощью анализа последовательностей, предоставленных в базе данных экспрессирующихся маркерных последовательностей (EST) таких, которые доступны в GenBank. Поиски перекрывающихся EST в общем можно выполнять, используя хорошо известные программы (например, поиски NCBI BLAST), и такие EST могут быть использованы для генерации непрерывной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК можно получить путем анализа геномных фрагментов.

В других осуществлениях изобретения, полинуклеотидные последовательности или их фрагменты, которые кодируют полипептиды по изобретению, или слитые белки или их функциональные эквиваленты, могут быть использованы в молекулах рекомбинантных ДНК, чтобы направлять экспрессию полипептидов в соответствующих клетках-хозяевах. Благодаря вырожденности, присущей генетическому коду, можно получить другие последовательности ДНК, кодирующие, по существу, такие же или функционально эквивалентные последовательности аминокислот и эти последовательности можно применять для клонирования и экспрессии данных полипептидов.

Как понимают специалисты в данной области, в некоторых случаях может быть полезно производить нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, содержащие не встречающиеся в природных условиях кодоны. Например, можно выбрать кодоны, предпочтительные у конкретных прокариотических или эукариотических хозяев, чтобы увеличить уровень экспрессии белка или чтобы получить рекомбинантный РНК-транскрипт обладающих необходимыми свойствами, такие как более длительное время полужизни, чем транскрипт, образующийся с встречающейся в природных условиях последовательности.

Более того, полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению могут сконструированы с применением широко известных в данной области способов для того, чтобы изменить кодирующие полипептиды последовательности по многим причинам, включающим изменения, модифицирующие клонирование, процессинг и/или экспрессию продукта гена, но не ограничивающимися ими. Например, ДНК, "перетасованную" (смешанную) случайной фрагментацией и снова собранную с помощью PCR генных фрагментов с синтетическими олигонуклеотидами, можно использовать для конструирования нуклеотидных последовательностей. В дополнение, сайт-специфический мутагенез можно использовать для вставки новых рестрикиционных участков, изменения паттернов гликозилирования, изменения предпочтения кодона, получения вариантов сплайсинга или внесения мутаций и так далее.

В другом осуществлении изобретения естественные, модифицированные или рекомбинантные, последовательности нуклеиновой кислоты могут быть лигированы с гетерологичной последовательностью для кодирования слитого белка. Например, для скрининга в пептидных библиотеках ингибиторов полипептидной активности, может быть удобно кодировать химерный протеин, который может быть узнан коммерчески доступным антителом. Слитый белок можно конструировать так, чтобы он содержал участок расщепления, находящийся между последовательностью, кодирующей полипептид и гетерологичной белковой последовательностью так, чтобы полипептид можно было расщепить и очистить от гетерологичной части.

Последовательности, кодирующие требуемый полипептид можно синтезировать целиком или частично, применяя хорошо известные в данной области химические способы (смотри Caruthers, M. H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232). Альтернативно, можно получить сам белок, используя химические способы синтеза аминокислотной последовательности полипептида или его части. Например, пептидный синтез может быть проведен с применением различных твердофазных способов (Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204) и где может быть достигнут автоматический синтез, например, применяя пептидный синтезатор ABI 431A (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Вновь синтезированный пептид можно в значительной степени очистить с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (например, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.) или другим сопоставимым способом, доступным в данной области. Состав синтетического пептида можно подтвердить с помощью анализа аминокислот или секвенирования (например, реакция деградации Эдмана). Дополнительно, аминокислотную последовательность полипептида или любой его части в течение прямого синтеза можно изменить и/или, применяя химические способы, комбинировать с последовательностью другого пептида или его частью, для получения вариантов полипептида.

Чтобы получить требуемый полипептид, нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид или функциональные эквиваленты, можно вставить в соответствующий экспрессирующий вектор, то есть вектор, содержащий необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленных кодирующих последовательностей. Способы, хорошо известные специалистам в данной области, можно использовать для конструирования экспрессирующих векторов, содержащих последовательности кодирующих интересующие полипептиды и подходящие элементы контроля транскрипции и трансляции. Эти способы включают способы рекомбинантной ДНК in vitro, способы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Такие способы описаны, например, у Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.

Можно использовать множество систем экспрессирующий вектор/хозяин для удержания и экспрессии полинуклеотидных последовательностей. Они включают микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантными бактериофаговыми, плазмидными или космидными экспрессирующими ДНК-векторами; дрожжи, трансформированные дрожжевыми экспрессирующими векторами; системы клеток насекомых, инфицированные вирусными экспрессирующими векторами (например, бакуловирус); системы клеток растений, трансформированные вирусными экспрессирующими векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или бактериальными экспрессирующими векторами (например, плазмиды Ti или pBR322); системы животных клеток, но не ограничиваются ими.

"Контрольные элементы" или "регуляторные последовательности", существующие в экспрессирующих векторах, являются нетранслируемыми областями вектора - энхансерами, промоторами 5'- и 3'-нетранслируемыми областями - которые взаимодействуют с белками клетки-хозяина для проведения транскрипции и трансляции. У таких элементов может меняться их сила и специфичность. В зависимости от применяемых системы вектора и хозяина, может использоваться несколько подходящих транскрипиционных и трансляционных элементов, включая конститутивные и индуцибельные промоторы. Например, для клонирования в бактериальных системах, можно использовать индуцибельные промоторы, такие как гибридный промотор lacZ фазмиды PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) или плазмиды PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) или подобные. В системах клеток млекопитающих, в общем, предпочтительными являются промоторы из генов млекопитающих или из вирусов млекопитающих. Если это необходимо, для создания клеточной линии, содержащей множественные копии последовательности, кодирующей полипептид, преимущественно можно использовать векторы, базирующиеся на SV40 или EBV, с подходящим селективным маркером.

В бактериальных системах можно выбрать любой из множества экспрессирующих векторов, в зависимости от предполагаемого использования экспрессируемого полипептида. Например, когда необходимы большие количества, например, для индукции антител, можно применять векторы, которые направляют высокий уровень экспрессии слитых белков, которые легко очищаются. Такие векторы включают мультифункциональные клонирующие и экспрессирующие векторы E. coli, такие как BLUESCRIPT (Stratagene), в которых последовательность, кодирующую интересующий полипептид, можно лигировать в вектор в рамку с последовательностями для аминоконцевого Met и последующих 7 остатков бета-галактозидазы так, что продуцируется гибридный протеин; pIN-векторы (Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem; 264:5503-5509) и им подобные, но не ограничиваются ими. Для экспрессии чужеродных полипептидов как слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST) можно также применять pGEX-векторы (Promega, Madison, Wis.). Вообще, такие слитые белки растворимы и могут быть легко выделены из лизированных клеток, путем адсорбции к глутатион-агарозным гранулам после элюции в присутствии свободного глутатиона. Белки, полученные в таких системах, могут быть сконструированы так, что будут включать гепарин, тромбин или участки расщепления протеазой фактора XA так, чтобы интересующие клонированные полипептиды, если потребуется, можно было освободить от GST-части.

В дрожжах Saccharomyces cerevisiae можно использовать ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, такие как альфа-фактор, алкоголь-оксидазу, и PGH. Для обзора, см. Ausubel et al. (supra) and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

В случаях, где используются экспрессирующие векторы растений, экспрессия последовательностей, кодирующих полипептиды, может вестись с любого из множества промоторов. Например, можно применять вирусные промоторы, такие как промоторы 35S и 19S CaMV по одному или в комбинации с омега-лидерной последовательностью из TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). Альтернативно, можно использовать промоторы растений, такие как промоторы малой субъединицы RUBISCO или промоторы теплового шока (Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; и Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Такие конструкции можно ввести в клетки растений с помощью прямой трансформации ДНК или опосредованной патогеном трансфекции. Такие способы описаны в нескольких широко доступных обзорах (смотри, например, Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N. Y.; pp. 191-196).

Для экспрессии интересующих полипептидов можно также использовать системы насекомых. Например, в одной такой системе, применяется вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV), как вектор для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или личинках Trichoplusia. Последовательности, кодирующие полипептид, можно клонировать в несущественных областих вируса, такого как ген полиэдроза и помещен под контроль полиэдринового промотора. Успешная вставка последовательности, кодирующей полипептид, приводит к инактивации гена полиэдроза и продукции рекомбинантного вируса, лишенного оболочечного белка. Рекомбинантные вирусы затем можно использовать для заражения, например, клеток S. frugiperda или личинок Trichoplusia, в которых могут быть экспрессированы интересующие полипептиды (Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227).

Для клеток хозяина-млекопитающего широко доступны несколько экспрессирующих систем, основанных на вирусах. Например, в случае, где в качестве экспрессирующего вектора используется аденовирус, последовательности, кодирующие интересующий полипептид, можно лигировать в аденовирусный транскрипционно/трансляционный комплекс, содержащий поздний промотор и тройную лидирующую последовательность. Для получения жизнеспособных вирусов, которые будут способны к экспрессии полипептидов в клетках-хозяевах может быть использована вставка в несущественную область вирусного генома E1 или E3 (Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). В дополнение, для усиления экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих могут быть использованы транскрипционные энхансеры, такие как энхансер вируса саркомы Рауса (RSV).

Могут быть также использованы специфические сигналы инициации для достижения более эффективной трансляции последовательностей, кодирующих интересующий полипептид. Такие сигналы включают кодон инициации ATG и прилежащие последовательности. В случаях, где последовательности, кодирующие полипептид, их кодон инициации и последовательности, расположенные против хода транскрипции, вставлены в подходящий экспрессирующий вектор, не нужно дополнительных сигналов контроля транскрипции или трансляции. Однако в случаях, где вставлена только кодирующая последовательность или ее часть, должны быть обеспечены экзогенные сигналы контроля трансляции, включающие инициаторный кодон ATG. Более того, инициаторный кодон должен находиться в правильной рамке считывания, чтобы гарантировать трансляцию целой вставки. Экзогенные трансляционные элементы и инициаторные кодоны могут быть различного происхождения: как натурального, так и синтетического. Эффективность экспрессии может быть увеличена с помощью включения энхансеров, которые подходят для конкретной клеточной системы, которая используется, такие как описаны в литературе (Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125 -162).

В дополнение, штаммы клеток-хозяев можно выбрать по их способности модулировать экспрессию вставленной последовательности или требуемым образом процессировать экспрессированный белок. Такие модификации полипептида включают ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липоилирование и ацилирование, но не ограничиваются ими. Посттрансляционный процессинг, расщепляющий "препро" формы белков, тоже может быть использован для облегчения коррекции вставки, фолдинга и/или функции. Можно выбрать различные клетки хозяина, такие как CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 и WI38, которые имеют специфический клеточный аппарат и характерные механизмы посттрансляционной активности, для обеспечения правильной модификации и процессинга чужеродного белка.

Для долгосрочного, высокопродуктивного получения рекомбинантных белков, как правило, предпочтительна стабильная экспрессия. Например, клеточные линии, которые стабильно экспрессируют интересующие полинуклеотиды, можно трансформировать, используя экспрессирующие векторы, которые могут содержать элементы репликации вирусного происхождения и/или эндогенные экспрессионные элементы и селективный ген-маркер на том же или на отдельном векторе. После введения вектора, можно позволить клеткам расти 1-2 дня на обогащенной среде перед переключением на селективную среду. Назначение селективного маркера - обеспечивать устойчивость к селекции и его присутствие делает возможным рост и получение клеток, которые успешно экспрессируют введенную последовательность. Устойчивые клоны стабильно трансформированных клеток могут пролиферировать с использованием способа тканевой культуры соответственно типу клеток.

Некоторые из систем отбора можно применять для получения трансформированных клеточных линий. Они включают гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23), которые могут быть применены в tk.sup.- или aprt. sup.-клетках, соответственно, но не ограничиваются ими. Также, как основание для отбора может использоваться резистентность к антиметаболитам, антибиотикам или гербицидам; например, dhfr, который дает резистентность к метротрексату (Wigler, M. et al. (1980) Poc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, который дает устойчивость к аминогликозидам, неомицину и G-418 (Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) и als или pat, которые дают устойчивость к хлорсульфурону и фосфоинотрицинацетилтрансферазе, соответственно (Murry, supra). Описаны дополнительные селективные гены, например trpB, который позволяет клеткам утилизировать индол вместо триптофана или hisD, который позволяет клеткам утилизировать гистинол вместо гистидина (Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Приобрело популярность использование видимых маркеров с такими маркерами, как антоцианин, бета-глюкуронидаза и ее субстрат GUS, люцифераза и ее субстрат люциферин, которые широко используются не только для идентификации трансформантов, но также и для подсчета количества кратковременной или стабильной экспрессии белков, относящихся к специфической векторной системе (Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol, Biol. 55:121-131).

Несмотря на то, что присутствие/отсутствие экспрессии маркерных генов означает, что интересующий ген также представлен, его присутствие и экспрессия могут нуждаться в подтверждении. Например, если последовательность, кодирующая полипептид, вставлена в последовательность маркерного гена, рекомбинантные клетки, содержащие последовательности могут быть идентифицированы по отсутствию функции маркерного гена. Альтернативно, маркерные гены могут быть расположены в тандеме с последовательностью, кодирующей полипептид под контролем одного промотора. Экспрессия маркерного гена в ответ на индукцию или селекцию обычно означает также экспрессию тандемного гена.

Альтернативно, клетки-хозяева, которые содержат и экспрессируют необходимую полинуклеотидную последовательность, могут быть идентифицированы множеством способов, известным специалистам в данной области. Эти способы включают ДНК-ДНК- или ДНК-РНК-гибридизации и способы белкового биоанализа или иммуноанализа, которые включают в качестве неограничивающих примеров, например, способы, основанные на применении мембран, растворов или чипов для детекции и/или подсчета нуклеиновой кислоты или белков.

В данной области известно множество протоколов, использующих какие-либо поликлональные или моноклональные антитела специфичных к продукту для детекции и измерения экспрессии продуктов, кодируемых полинуклеотидами. Примеры включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) и флюоресцентно-активируемую клеточную сортировку (FACS). Для некоторых применений может быть предпочтительным двухсайтный иммунологический анализ, базирующийся на применении моноклональных антител, использующий моноклональные антитела, реагирующие с двумя неперекрывающимися эпитопами данного полипептида, но также может быть применен анализ конкурентного связывания. Эти и другие анализы описаны, наряду с другими позициями, в Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) и Maddox, D. E. et al. (l983, J. Exp. Med. 158:1211-1216).

В различных анализах аминокислот или нуклеиновых кислот можно использовать широкое разнообразие способов мечения и конъюгации, известных специалистам в данной области. Способы для получения меченых зондов или PCR-праймеров для детекции последовательностей связанных с полинуклеотидами включают мечение олигонуклеотидов, ник-трансляцию, концевое мечение или амплификацию PCR с использованием меченых нуклеотидов. Альтернативно, последовательности или любую их часть можно клонировать в вектор для получения мРНК-зонда. Такие векторы, хорошо известные в данной области, коммерчески доступны и могут быть использованы для синтеза РНК-зондов in vivo путем добавления соответствующей РНК-полимеразы, такой как T7, T3 или SP6 и меченых нуклеотидов. Такие процедуры могут быть проведены, используя множество коммерчески доступных наборов. Подходящие репортерные молекулы или метки, которые можно использовать, включают радионуклиды, ферменты, флуоресцентные, хемилюминесцентные или хромогенные агенты, а также субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и тому подобное.

Клетки-хозяева, трансформированные интересующими полинуклеотидными последовательностями, могут быть культивированы в условиях, подходящих для экспрессии и получения белка из клеточной культуры. Белок, продуцируемый рекомбинантной клеткой, может быть секретируемым или находится внутриклеточно, в зависимости от использованных последовательности и/или вектора. Как поймут специалисты в данной области, экспрессирующие векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению, могут быть сконструированы, чтобы содержать сигнальные последовательности, которые направляют секрецию кодируемого полипептида через прокариотическую или эукариотическую клеточную мембрану. Другие рекомбинантные конструкции могут быть использованы для связывания последовательностей, кодирующих интересующие полипептиды с нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептидный домен, который облегчает очищение растворимых белков. Такие облегчающие очистку домены включают метал-хелатирующие пептиды, такие как гистидин-триптофановые модули, позволяющие проводить очистку на иммобилизованных металлах, домены белка A, которые позволяют проводить очистку на иммобилизованных иммуноглобулинах и домен, применяющийся в системах исключения/аффинной очистки FLAGS, но не ограничиваются ими. Включение расщепляющихся линкерных последовательностей, специфичных для фактора XA или энтерокиназы (Invitrogen. San-Diego, Calif.), между доменом очистки и кодируемым полипептидом можно использовать для облегчения очистки. Один из таких экспрессирующих векторов предусматривает экспрессию слитого белка, содержащего интересующий полипептид и нуклеиновую кислоту, кодирующую 6 гистидиновых остатков, предшествующую участку расщепления тиоредоксина или энтерокиназы. Гистидиновые остатки облегчают очистку с помощью IMIAC (металлоаффинная хроматография) как описано у Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281), тогда как сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает способы для очистки необходимого полипептида от слитого белка. Подробное обсуждение векторов, содержащих слитые белки, предоставлено Kroll, D. J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453).

В дополнение к способам продукции рекомбинантов, полипептиды по изобретению или их фрагменты можно получить прямым пептидным синтезом, используя способы твердофазного синтеза (Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Белковый синтез может быть выполнен, используя руководства или автоматические способы. Автоматический синтез может быть выполнен, например, с применением пептидного синтезатора Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Альтернативно, различные фрагменты могут быть синтезированы отдельно и соединены, используя химические способы для синтеза полноразмерной молекулы.

Композиции антител, их фрагментов и другие связывающие агенты

По другому аспекту настоящее изобретение далее относится к связывающим агентам, таким как антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые характеризуются иммунологическим связыванием с описанными здесь опухолевыми белками, их частями, вариантами или производными. Говорят, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент "специфически связывается" или "иммунологически связывается" и/или "иммунологически реактивно" к полипептиду по изобретению, если оно реагирует на детектируемом уровне (например, с помощью анализа ELSIA) с полипептидом и детектируемо не взаимодействует с неродственными полипептидами при тех же условиях.

Иммунологическое связывание при использовании в данном контексте обычно относится к нековалентным взаимодействиям того типа, которое встречается между молекулой иммуноглобулина и антигена, к которому иммуноглобулин специфичен. Сила или аффинность взаимодействий иммунологического связывания может быть выражена в терминах константы диссоциации (K_d) взаимодействия, где меньшая K_d представляет большую аффинность. Свойства иммунологического связывания выбранных полипептидов могут быть подсчитаны, используя способы, хорошо известные в этой области. Один из таких методов связан с измерением скоростей формирования и диссоциации комплексов антигенсвязывающий сайт/антиген, где эти скорости зависят от концентраций партнеров, образующих комплекс, аффинности взаимодействия и геометрических параметров, которые в равной степени влияют на скорость в обоих направлениях. Так, и "константа скорости в прямом направлении" (K_on) и "константа скорости в обратном направлении" (K_off) можно определить подсчетом концентрации и текущих скоростей ассоциации и диссоциации. Отношение K_on/K_off делает возможным сокращение всех параметров, не связанных с аффинностью, и эквивалентно константе диссоциации K_d. В основном, см. Davies. et. al. (1990) Annual Rev. Biochem.

59:439-473.

"Антиген-связывающий сайт" или "связывающая часть" антитела обозначает части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. Антиген-связывающий сайт формируется аминокислотными остатками N-концевых вариабельных ("V") областей тяжелых ("Н") и легких ("L") цепей. Три сильно различающихся участка в V-областих тяжелых и легких цепей обозначает к "гипервариабельным областям", которые располагаются между более консервативными краевыми участками, известными как "структурные области" или "FR". Так термин "FR" обозначает аминокислотные последовательности, которые в иммуноглобулинах обнаружены в природе между и рядом с гипервариабельными областями. В молекуле антитела три гипервариабельных области легкой цепи и три гипервариабельных области тяжелой цепи расположены относительно друг друга в трехмерном пространстве так, чтобы формировать антигенсвязывающую поверхность. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна к трехмерной поверхности связываемого антигена, а три гипервариабельных области каждой из тяжелых и легких цепей относятся к "областим, определяющим комплементарность" или "CDR".

Связывающие агенты могут способствовать возможности различить пациентов со злокачественной опухолью, такой как рак легкого, и без нее, используя описанные здесь репрезентативные анализы. Например, антитела или другие связывающие агенты, которые связываются с опухолевым белком, предпочтительно генерируют сигнал, указывающий на присутствие злокачественной опухоли, по крайней мере, у примерно 20% пациентов с заболеванием, более предпочтительно, у 30% пациентов. Альтернативно или в дополнение, антитело будет генерировать сигнал, указывающий на отсутствие заболевания как минимум у 90% индивидов без онкологического заболевания. Для определения того, что связывающий агент удовлетворяет этому условию, биологические образцы (например, кровь, сыворотки, мокрота, моча и/или опухолевые биопсии) пациентов с онкологическим заболеванием и без него (что определяется используя стандартные клинические тесты) могут быть проанализированы как описано выше на присутствие полипептидов которые связываются со связывающими агентами. Предпочтительно проанализировать статистически значимое количество образцов с заболеванием и без. Каждый связывающий агент должен удовлетворять критериям, указанным выше, однако, обычным специалистам в данной области ясно, что эти связывающие агенты могут быть использованы в комбинации для повышения чувствительности.

Любой агент, который удовлетворяет указанным выше условиям, может быть связывающим агентом. Например, связывающим агентом может быть рибозим, с пептидным компонентом или без, молекула РНК или полипептид. В предпочтительном осуществлении, связывающим агентом является антитело или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела могут быть получены с помощью любого из множества известных специалистам в данной области способов. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Вообще, антитела могут быть продуцированы с помощью способов культуры клеток, включая производство моноклональных антител, как описано здесь, или с помощью трансфекции генов антител в подходящие клетки-хозяева бактерий или млекопитающих, для того чтобы сделать возможным получение рекомбинантных антител. В одном способе, иммуноген, содержащий полипептид, сначала вводится в любое из обширного множества млекопитающих (например, мыши, крысы, кролики, овцы или козы). На этом шаге, полипептиды по изобретению могут служить как иммуноген без модификации. Альтернативно, особенно для относительно коротких полипептидов, первичный иммунный ответ может быть вызван, если полипептид связан с несущим белком, таким как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин морского блюдца. Иммуноген вводится животному-хозяину, предпочтительно по определенному протоколу, включающему одну или больше поддерживающих иммунизаций с периодическим забором крови у животного. Поликлональные антитела, специфичные к полипептиду, могут быть потом очищены из такой антисыворотки с помощью, например, аффинной хроматографии, используя связанные с подходящей твердой основой полипептиды.

Моноклональные антитела специфичные к интересующему антигенному пептиду могут быть получены, например, используя способ Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976 и его усовершенствования. Коротко, эти способы включают получение бессмертных клеточных линий, способных продуцировать антитела, обладающие необходимой специфичностью (например, реагирующие с интересующим полипептидом). Такие клеточные линии могут быть приготовлены, например, из клеток селезенки, полученных от животных, иммунизированных как описано выше. Клетки селезенки затем иммортализуют, например, путем слияния с партнером слияния из клеток миеломы, предпочтительно сингенного с иммунизированным животным. Может быть применено множество способов слияния. Например, клетки селезенки и клетки миеломы можно объединить на несколько минут с неионным детергентом и затем поместить с низкой плотностью на селективную среду, которая поддерживает рост гибридных, но не миеломных клеток. Предпочтительный способ селекции использует селекцию на HAT (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). После достаточного времени, обычно около 1-2 недель, наблюдаются колонии гибридов. Выбираются единичные колонии и супернатант их культур тестируется на связывающую активность в отношении полипептида. Предпочтительными являются гибридомы с высокой реактивностью и специфичностью.

Моноклональные антитела могут быть изолированы из супернатантов растущих колоний гибридом. В дополнение, можно использовать различные способы для увеличения выхода, такие как введение линии гибридомной клетки в брюшную полость подходящего позвоночного хозяина, такого как мышь. Моноклональные антитела могут быть затем собраны из асцитной жидкости или крови. Загрязняющие вещества можно удалить из антител традиционными способами, такими как хроматография, гель-фильтрацией, преципитацией и экстракцией. Полипептиды по изобретению могут быть использованы в процессе очистки, например, на этапе аффинной хроматографии.

В данной области известен ряд применяемых при лечении молекул, включающих антигенсвязывающие участки, которые способны проявлять свойства иммунологического связывания молекулы антитела. Протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG на несколько фрагментов, два из которых ("F(ab)"-фрагменты) содержат ковалентный гетеродимер, включающий интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с получением нескольких фрагментов, включая "F(ab')₂"-фрагменты, которые содержат оба антигенсвязывающих сайта. "Fv"-фрагмент может быть получен путем предпочтительного протеолитического расщепления иммуноглобулиновой молекулы IgM и в редких случаях IgG или IgA. Однако, Fv-фрагменты чаще всего получают, используя рекомбинантные способы, известные в данной области. Fv -фрагмент включает нековалентно связанный димер V_H::V_L, включающий антигенсвязывающий сайт, который сохраняет большинство способностей распознавания и связывания антигена естественной молекулы антитела. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman rt al. (1976) Biochem 15:2706-2710 и Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096.

Полипептид, состоящий из одной цепи Fv ("sFv") - ковалентно связанный гетеродимер V_H::V_L, который экспрессируется с гена слияния, включающего гены, кодирующие V_H- и V_L-, связанные путем кодирующего пептид линкера. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883. Описан ряд способов выбора химических структур для преобразования естественно агрегированных, но химически разделенных легких и тяжелых полипептидных цепей из V-области антитела в молекулу sFv, которая сложится в трехмерную структуру в основном подобную структуре антигенсвязывающего сайта. См., например, патенты США №№ 5091513 и 5132405, выданные Huston et al.; и патент США № 4946778, выданный Landner et al.

Каждая из описанных выше молекул включает набор CDR тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно расположенных между набором FR тяжелой цепи и легкой цепи, которые обеспечивают поддержку CDRS и определяют пространственные связи CDR относительно друг друга. Используемый здесь термин "набор CDR" обозначает три гипервариабельных области V-области тяжелой и легкой цепей. Начиная от N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначаются "CDR1", "CDR2" и "CDR3", соответственно. Следовательно, антигенсвязывающий сайт, содержащий набор CDR каждой из тяжелой и легкой цепи V -области, включает шесть CDR. Полипептид, содержащий единственный CDR (например, CDR1, CDR2 или CDR3) обозначает здесь "единицу молекулярного узнавания". Кристаллографический анализ ряда комплексов антиген-антитело показал, что аминокислотные остатки CDR формируют пространственный контакт со связанным антигеном, где наиболее большой контакт антигена имеет место с CDR3 тяжелой цепи. Так, единицы молекулярного узнавания первично ответственны за специфичность V антигенсвязывающего сайта.

Используемый здесь термин "набор FR" обозначает четыре боковых последовательности аминокислот, которые обрамляют CDR набора CDR тяжелой и легкой цепи V-области. Некоторые остатки FR могут контактировать со связанным антигеном, однако FR в основном ответственны за свертывание V-области в антигенсвязывающий сайт, в особенности, остатки FR, непосредственно прилегающие к CDRS. В пределах FR некоторые аминокислотные остатки и некоторые структурные особенности высококонсервативны. В этом отношении все последовательности V-области содержат внутреннюю дисульфидную петлю примерно из 90 аминокислотных остатков. Когда V-области сворачиваются в связывающий сайт, CDR выставляются как выступающие петлевые мотивы, которые формируют антигенсвязывающую поверхность. Вообще ясно, что существуют консервативные структурные области FR, которые влияют на фолдинг петель CDR в определенные "канонические" структуры независимо от точной аминокислотной последовательности CDR. Более того, известно, что некоторые остатки FR участвуют в нековалентных междоменных контактах, которые стабилизируют взаимодействие тяжелых и легких цепей антитела.

Описан ряд молекул "гуманизированных" антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, происходящий из нечеловеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, содержащие V-области грызунов и ассоциированные с ними CDR, слитые с человеческими константными доменами (Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; и Brown et al. (1987). Cancer Res. 47:3577-3583), CDR грызунов, привитые в поддерживающие человеческие FR, перед слиянием с константным доменом соответствующего человеческого антитела (Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) Nature 321:522-525) и CDR грызунов, поддерживаемые путем рекомбинантно защищенных FR грызунов (European Patent Publication № 519596, опубликованная 23 декабря 1992 года). Эти "гуманизированные" молекулы предназначены для минимизации нежелательного иммунного ответа к молекулам античеловеческих антител грызунов, который ограничивает длительность и эффективность терапевтических применений таких компонентов у реципиентов-людей.

Используемый здесь термины "защищенные FR" и "рекомбинантно защищенные FR" относятся к выборочной замене остатков FR, например, V-области тяжелой и легкой цепи грызунов, на остатки FR человека, для сохранения ксеногенетической молекулы, содержащей антигенсвязывающий сайт, которая в общем сохраняет всю природную структуру укладки полипептида FR. Способы защиты основываются на понимании того, что характеристики связывания лиганда антигенсвязывающего сайта в основном определяются структурой и относительным расположением наборов CDR тяжелой и легкой цепи в пределах антигенсвязывающей поверхности. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473. Так, в гуманизированном антителе специфичность связывания антигена может быть сохранена только там, где структуры CDR, их взаимодействие друг с другом и их взаимодействие с основой доменов V-области тщательно сохранены. Путем использования способов защиты наружные (например, доступные растворителю) остатки FR, которые легко узнаются иммунной системой, выборочно заменяются остатками, характерными для человека, с получением гибридной молекулы, которая содержит либо слабоиммуногенную, либо в значительной степени неиммуногенную защищенную поверхность.

В процедуре защиты используют доступные данные о последовательности вариабельных доменов человеческих антител, собранные Kabat et al., в Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U. S. Dept. of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office, 1987), обновления базы данных Kabat и другие доступные американские и иностранные базы данных (как нуклеиновой кислоты так и белка). Доступность для растворителя аминокислот V-области можно вывести из известной трехмерной структуры фрагментов человеческих и мышиных антител. Существует два главных шага в защите мышиного антигенсвязывающего сайта. Сначала FR вариабельных доменов интересующей молекулы антитела сравнивается с соответствующей последовательностью FR человеческих вариабельных доменов, полученных из идентифицированных выше источников. V-области с наибольшей гомологией затем сравниваются остаток за остатком с соответствующими мышиными аминокислотами. Остатки в мышиных FR, которые отличаются от человеческой копии, заменяются остатками, присутствующими в человеческой части, используя рекомбинантные способы, известные в данной области. Замена остатков производится в группах, которые как минимум частично открыты (доступны растворителю), а при замене аминокислотных остатков, которые могут иметь значимый эффект на третичную структуру доменов V-области, таких как пролин, глицин и заряженные аминокислоты, требуется проявлять осторожность.

Таким образом, результирующие "защищенные" мышиные антигенсвязывающие сайты предназначены для того, чтобы удерживать остатки мышиных CDR, остатки, главным образом примыкающие к CDR, остатки, идентифицированные как закрытые или по большей части закрытые (недоступные растворителю), остатки, предположительно участвующие в нековалентных (например, электростатических или гидрофобных) контактах между доменами тяжелых и легких цепей, и остатки консервативных структурных областей FR, которые, как предполагается, влияют на "канонические" третичные структуры петель CDR. Эти расчетные критерии используют для получения рекомбинантных последовательностей нуклеотидов, которые объединяют CDR тяжелой и легкой цепи мышиного антигенсвязывающего сайта с человеческими FR и которые можно использовать для трансфекции клеток млекопитающих для экспрессии рекомбинантных человеческих антител, которые обнаруживают антигенную специфичность молекулы мышиного антитела.

В другом осуществлении настоящего изобретения моноклональные антитела можно связать с одним или несколькими терапевтическими агентами. Подходящие в этом отношении агенты включают радионуклиды, индукторы дифференцировки, лекарственные препараты, токсины и их производные. Предпочтительные радионуклиды включают ⁹⁰Y, ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹¹At и ²¹²Bi. Предпочтительные лекарства включают метотрексат и аналог пиримидина и пурина. Предпочтительные индукторы дифференцировки включают форболовый эфир и масляную кислоту. Предпочтительные токсины включают рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, экзотоксин Pseudomonas, токсин Shigella и антивирусный белок фитолакии.

Терапевтические агенты могут быть присоединены (например, ковалентно связаны) к подходящему моноклональному антителу или непосредственно или опосредованно (например, посредством линкерной группы). Прямая реакция между агентом и антителом возможна, когда каждый обладает заместителем способным к реакции с другим. Например, нуклеофильная группа, такая как амино- или сульфгидрильная группа, на одном может быть способна к реакции с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенид кислоты или с алкильной группой, содержащей хорошо уходящую группу (например, галогенид) на другом.

Альтернативно, может быть необходимо присоединить терапевтический агент к антителу через линкерную группу. Линкерная группа может функционировать как разделитель для отдаления антитела от агента для того, чтобы избежать помех связывающим способностям. Линкерная группа может также служить для усиления химической активности заместителя на агенте или антителе и, так, усиливать эффективность связывания. Увеличение химической активности может также содействовать использованию агентов или функциональных групп на агентах, которое иначе невозможно.

Специалистам в данной области очевидно, что множество бифункциональных и многофункциональных реагентов, или гомо- или гетерофукнциональных (таких, какие описаны в каталоге Pierce Chemical Co., Rockford, IL) можно применять как линкерные группы. Соединение может быть осуществлено, например, через аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы или окисленные углеводные остатки. Имеются многочисленные ссылки на то, где описываются такие способы, например, патент США № 4671958, выданный Rodwell et al.

В тех случаях, когда терапевтическое средство более эффективно, если освободится от части иммуноконьюгата по настоящему изобретению, содержащей антитело, может быть необходимо использовать линкерную группу, которая расщепляется во время интернализации в клетку. Описан ряд различных расщепляющихся линкерных групп. Механизмы для внутриклеточного освобождения агента от этих линкерных групп включают расщепление восстановлением дисульфидной связи (например, патент США № 4489710 выданный Spitler), облучением светочувствительной связи (например, патент США № 4625014, выданный Senter et al.), гидролизом дериватизированных боковых цепей аминокислот (например, патент США № 4638045, выданный Kohn et al.), сывороточным комплемент-опосредованным гидролизом (например, патент США № 4671958, выданный Rodwell et al.) и кислотным гидролизом (например, патент США № 4569789, выданный Blattler et al.).

Может быть необходимо присоединить к антителу более одного агента. В одном осуществлении множество молекул агента присоединены к одной молекуле антитела. В другом осуществлении более чем один тип агентов может быть присоединен к одному антителу. Независимо от конкретного осуществления, иммуноконъюгаты с более чем одним агентом можно получить множеством путей. Например, более чем один агент может быть присоединен прямо к молекуле антитела или можно применить линкеры, которые обеспечивают множество участков для присоединения. Альтернативно, могут быть использованы носители.

Носитель может нести агенты множеством способов, включающих ковалентное связывание каждого непосредственно или через линкерную группу. Применяемые носители включают белки, такие как альбумины (например, патент США № 4507234, выданный Kato et al.), пептиды и полисахариды, такие как аминодекстран (например, патент США № 4699784, выданный Shih et al.). Носитель может также нести агент с помощью нековалентного связывания или путем инкапсуляции, так как в липосомной везикуле (например, патенты США №№ 4429008 и 4873088). Носители, специфичные для радионуклидных агентов, включают радиогалогенированные малые молекулы и хелатирующие соединения. Например, патент США № 4735792 описывает типичные радиогалогенированные малые молекулы и их синтез. Радионуклидный хелат может быть сформирован из хелатирующих соединений, которые включают радионуклид, который содержит атомы азота и серы как донорные атомы для связывания металла или оксида металла. Например, патент США № 4673562, выданный Davison et al., описывает типичные хелатирующие соединения и их синтез.

Композиции Т-клеток

Настоящее изобретение, в другом аспекте, относится к Т-клеткам, специфичным к опухолевому полипептиду, описанному здесь, или к его варианту, или производному. Такие клетки можно обычно получить in vitro или ex vivo, используя стандартные процедуры. Например, Т-клетки могут быть выделены из костного мозга, периферической крови или части костного мозга или периферической крови пациента, используя коммерчески доступные системы разделения клеток, такие как Isolex^TM System, доступная в Nexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; смотри также патент США № 5240856; патент США № 5215926; WO 89/06280; WO 91/16116 и WO 92/07243). Альтернативно, Т-клетки могут быть получены у родственников или неродственных людей, других млекопитающих, клеточных линий или культур.

Т-клетки могут быть стимулированы полипептидом, полинкулеотидом, кодирующим полипептид и/или антиген-презентирующей клеткой (APC), которая экспрессирует такой полипептид. Такая стимуляция проводится в условиях и такое время, чтобы позволить генерацию Т-клеток, которые специфичны к интересующему полипептиду. Предпочтительно, опухолевый полипептид или полинуклеотид по изобретению находятся в доставляющем носителе, таком как микросфера, для облечения генерации специфичных Т-клеток.

Полагают, что Т-клетки являются специфичными к полипептиду по настоящему изобретению, если Т-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или убивают клетки-мишени, покрытые полипептидом, или экспрессирующие гены, кодирующие полипептид. Т-клеточная специфичность может быть оценена любым из множества стандартных способов. Например, в анализе потери хрома или анализе пролиферации, увеличение индекса стимуляции более чем в два раза при лизисе и/или пролиферации, по сравнению с отрицательными контролями, означает Т-клеточную специфичность. Такие анализы могут быть проведены, например, как описано у Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994. Альтернативно, детекцию пролиферации Т-клеток можно проводить путем множества известных способов. Например, пролиферацию Т-клеток можно детектировать путем измерения увеличенной скорости синтеза ДНК (например, путем пульс-мечения культур Т-клеток тимидином с тритием и измерением количества тимидина с тритием, включенного в ДНК). Контакт с опухолевым полипептидом (100 нг/мл -100 мкг/мл, предпочтительно 200 нг/мл -25 мкг/мл) в течение 3-7 дней обычно приводит как минимум к двукратному увеличению пролиферации Т-клеток. Такой, как описано выше, контакт в течение 2-3 часов приводил к активации Т-клеток, как измерено, используя стандартный анализ цитокинов, в котором двукратное увеличение уровня высвобождения цитокинов (например, TNF или IFN-γ) означает активацию Т-клеток (смотри Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)). Т-клетки, которые были активированы в ответ на опухолевый полипептид, полинуклеотид или экспрессирующие полипептид APC могут быть CD4⁺ и/или CD8⁺. Количество Т-клеток, специфичных к опухолевому полипептиду, можно увеличить, используя стандартные способы. В предпочтительном осуществлении, Т-клетки получают у пациента и родственного или неродственного донора и вводятся пациенту после стимуляции и увеличения количества.

Для терапевтических целей число CD4⁺ или CD8⁺ Т-клеток, которые пролиферируют в ответ на опухолевый полипептид, полинуклеотид или APC можно увеличить или in vitro или in vivo. Пролиферация таких Т-клеток in vivo может быть выполнена различными путями. Например, Т-клетки можно повторно подвергнуть действию опухолевого полипептида или короткого пептида, соответствующего иммуногенной части такого полипептида, с добавлением или без добавления факторов роста Т-клеток, таких как интерлейкин-2 и/или стимуляторных клеток, которые синтезируют опухолевый полипептид. Альтернативно, число одной или нескольких Т-клеток, которые пролиферируют в присутствии опухолевого полипептида, может быть увеличено путем клонирования. Способы клонирования клеток хорошо известны в данной области и включают лимитирующие разведения.

Фармацевтические композиции

В дополнительных осуществлениях настоящее изобретение относится к препарату одного или нескольких описанных здесь композиций полинуклеотидов, полипептидов, Т-клеток и/или антител в фармацевтически приемлемых носителях для введения в клетку или животному, или отдельно, или в комбинации с одним или несколькими другими видами терапии.

Очевидно, что, если требуется, описанная здесь композиция может вводиться также в комбинации с другими средствами, например, с другими белками или полипептидами, или различными фармацевтически активными средствами. Фактически, число других компонентов, которые могут также включаться, в сущности, не ограничено, при том, что дополнительные средства не будут вызывать значимого неблагоприятного воздействия при контакте с клетками-мишенями или тканями хозяина. Таким образом, композиции могут доставляться с различными другими средствами, как потребуется в частном случае. Такие композиции могут быть очищены от клеток хозяина или других биологических источников, или, альтернативно, могут быть синтезированы химически, как описано здесь. Сходным образом, такие композиции могут далее включать композиции замещенной или модифицированной РНК или ДНК.

Поэтому в другом аспекте настоящего изобретения описаны фармацевтические композиции, включающие одну или несколько описанных здесь композиций полинуклеотидов, полипептидов, антител и/или Т-клеток в комбинации с физиологически приемлемым носителем. В некоторых предпочтительных осуществлениях фармацевтические композиции по изобретению включают композиции иммуногенных полинуклеотидов и/или полипептидов по изобретению для использования в применении профилактических и терапевтических вакцин. Препараты вакцин в общем описаны, например, M. F. Powell and M. J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Ple - Press (NY, 1995). Как правило, такие композиции включают одну или несколько композиций полинуклеотидов и/или полипептидов по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими иммуностимуляторами.

Очевидно, что любая из описанных здесь фармацевтических композиций может содержать фармацевтически приемлемые соли полинуклеотидов и полипептидов по изобретению. Такие соли могут быть получены, например, из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая органические основания (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганические основания (например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния).

В другом осуществлении иллюстративные иммуногенные композиции по настоящему изобретению, например, вакцинные композиции, включают ДНК, кодирующую один или несколько описанных выше полипептидов, такую, что полипептид генерируется in situ. Как было отмечено выше, полинуклеотид может вводиться в составе любой из различных систем доставки, известных в обычной практике данной области. Действительно, в данной области хорошо известно множество способов доставки гена, такие как описанные Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, и в цитируемых здесь ссылках. Подходящие полинуклеотидные экспрессирующие системы, конечно, содержат необходимые регуляторные последовательности ДНК для экспрессии в организме пациента (такие как подходящие промоторы и сигналы терминации). Альтернативно, бактериальные системы доставки могут предусматривать введение бактерии (такой как Bacillus-Calmette-Guerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на своей клеточной поверхности или секретирует такой эпитоп.

Поэтому в некоторых осуществлениях полинуклеотиды, кодирующие описанные здесь иммуногенные полипептиды, вводят в подходящие клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии с использованием любой из некоторого количества основанных на вирусах систем. В одном из иллюстративных осуществлений ретровирусы предоставляют удобную и эффективную платформу для систем доставки генов. Выбранная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению, может вводиться в вектор и упаковываться в ретровирусные частицы с использованием известных в данной области способов. Затем рекомбинантный вирус может быть выделен и доставлен субъекту. Описано некоторое количество иллюстративных ретровирусных систем (например, патент США № 5219740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.

Кроме того, описано некоторое количество иллюстративных систем, основанных на аденовирусах. В отличие от ретровирусов, которые интегрируются в геном хозяина, аденовирусы персистируют вне хромосомы, таким образом сводя к минимуму риск, связанный с инсерционным мутагенезом (Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; и Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476).

Также для доставки полинуклеотидов были разработаны различные аденоассоциированные вирусные (AAV) векторные системы. Векторы AAV могут легко конструироваться с использованием способов, хорошо известных в данной области. См., например, патенты США № 5173414 и 5139941; International Publication № WO 92/01070 и WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; и Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Дополнительные вирусные векторы, которые могут применяться для доставки полинуклеотидов, кодирующих полипептиды по настоящему изобретению путем переноса генов включают те, что происходят из семейства поксвирусов, таких как вирус коровьей оспы и птичий поксвирус. К примеру, рекомбинанты вируса коровьей оспы, экспрессирующие новые молекулы, могут конструироваться следующим образом. ДНК, кодирующая полипептид, вначале подлежит вставке в подходящий вектор, так что она прилегает к промотору вируса коровьей оспы и фланкирующим последовательностям ДНК вируса коровьей оспы, таких как последовательность, кодирующая тимидинкиназу (ТК). Затем данный вектор используют для трансфекции клеток, которые одновременно инфицируют коровьей оспой. Гомологичная рекомбинация служит для вставки промотора вируса коровьей оспы вместе с геном, кодирующим интересующий полипептид, в вирусный геном. Полученный в результате рекомбинант TK.sup.( -) может быть выбран путем культивирования клеток в присутствии 5-бромдезоксиуридина и захвата резистентных к нему вирусных бляшек.

Основанная на вирусе коровьей оспы система инфекции/трансфекции может удобно использоваться для предоставления индуцируемой временной экспрессии или совместной экспрессии одного или нескольких описанных здесь полипептидов в клетках организма хозяина. В данной конкретной системе клетки вначале инфицируют in vitro рекомбинантом вируса коровьей оспы, который кодирует РНК-полимеразу бактериофага Т7. Данная полимераза проявляет исключительную специфичность в том, что она транскрибирует только матрицы, несущие промоторы Т7. После инфекции клетки трансфицируют интересующим полинуклеотидом или полинуклеотидами, сопровождаемыми промотором Т7. Полимераза, экспрессированная в цитоплазме с рекомбинанта вируса коровьей оспы, транскрибирует трансфицированную ДНК в РНК, которая затем транслируется в полипептид посредством трансляционной системы хозяина. Способ предоставляет временную цитоплазматическую продукцию в высокой концентрации больших количеств РНК и продуктов ее трансляции. См., например, Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126.

Альтернативно, поксвирусы птиц, такие как поксвирусы домашней птицы и канареек, также могут использоваться для доставки интересующих кодирующих последовательностей. Известно, что рекомбинантные поксвирусы птиц, экспрессирующие иммуногены из патогенов млекопитающих, обеспечивают протективный иммунитет при введении видам, не относящимся к птицам. Применение вектора Avipox у человека и других видов млекопитающих является особенно желательным, поскольку члены рода Avipox могут продуктивно реплицироваться только у чувствительных к ним видов птиц и поэтому не являются инфекционными в отношении клеток млекопитающих. Способы получения рекомбинантных поксвирусов птиц известны в данной области и задействуют генетическую рекомбинацию, как описано выше в отношении продукции вирусов коровьей оспы. См., например, WO 91/12882; WO 89/03429; и WO 92/03545.

Любые из некоторого количества альфавирусных векторов также могут использоваться для доставки полинуклеотидных композиций по настоящему изобретению, такие как те векторы, что описаны в патентах США № 5843723; 6015686; 6008035 и 6015694. Также могут использоваться некоторые векторы, основанные на вирусе венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), и их иллюстративные примеры можно найти в патентах США № 5505947 и 5643576.

Более того, для доставки генов по изобретению также могут использоваться векторы на основе молекулярных конъюгатов, такие как химерные аденовирусные векторы, описанные Michael et al., J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 и Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103.

Дополнительная иллюстративная информация по известным основанным на вирусах системам доставки может быть найдена, например, в Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; U.S. Patent №№ 4603112, 4769330 и 5017487; WO 89/01973; патенте США № 4777127; GB 2200651; EP 0345242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzrnan et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; и Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993.

В некоторых осуществлениях полинуклеотид может интегрироваться в геном клетки-мишени. Данная интеграция может произойти в конкретной локализации и ориентации посредством гомологичной рекомбинации (замена гена), или он может интегрироваться в случайном, неспецифическом участке (приращение гена). В дальнейших осуществлениях полинуклеотид может стабильно поддерживаться в клетке в виде отдельного эписомного сегмента ДНК. Такие полинуклеотидные сегменты или "эписомы" кодируют последовательности, достаточные для возможности поддержания и репликации независимо или синхронно с клеточным циклом хозяина. Способ, по которому экспрессирующая конструкция доставляется в клетку, и где в клетке пребывает данный полинуклеотид, зависит от типа применяемой экспрессирующей конструкции.

В другом осуществлении изобретения полинуклеотид вводится/доставляется в виде "голой" ДНК, например, как описано Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 и в обзоре Cohen, Science 259:1691-1692, 1993. Захват голой ДНК может усиливаться за счет покрытия ДНК деградирующих в биологической среде гранул, которые эффективно транспортируются в клетку.

Еще в одном осуществлении композиция по настоящему изобретению может быть доставлена путем подходов бомбардировки частицами, многие из которых были описаны. В одном из иллюстративных примеров, направленное газом ускорение частиц может достигаться с помощью устройств, таких как производимое Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) и Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), некоторые их примеры описаны в патентах США № 5846796; 6010478, 5865796; 5584807; и патенте EP № 0500799. Данный подход предполагает безыгольный способ доставки, где высушенный порошкообразный препарат микроскопических частиц, таких как частицы полинуклеотида или полипептида, ускоряется до высокой скорости струей газообразного гелия, генерируемой ручным устройством, распыляющим частицы в интересующую ткань-мишень.

В связанном осуществлении другие устройства и способы, которые могут применяться для направленной газом безыгольной инъекции композиций по настоящему изобретению включают те, что предоставляются Bioject, Inc. (Portland, OR), некоторые их примеры описаны в патентах США 4790824; 5064413; 5312335; 5383851; 5399163; 5520639 и 5993412.

По другому осуществлению описанные здесь фармацевтические композиции включают один или несколько иммуностимуляторов в дополнение к композиции иммуногенных полинуклеотидов, полипептидов, антител, Т-клеток или АРС по данному изобретению. Иммуностимулятор относится по существу к любому веществу, которое усиливает или способствует иммунному ответу (опосредованному антителами и/или клетками) на чужеродный антиген. Один из предпочтительных типов иммуностимуляторов включает адъювант. Многие адъюванты содержат вещество, сконструированное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунного ответа, такой как липид А, белки, происходящие из Bortadella pertussis или Mycobacterium tuberculosis. Некоторые адъюванты являются коммерчески доступными, например, неполный и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, MI); адъювант Merck 65 (Merck and Company, Inc,, Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; модифицированные катионами или анионами полисахариды; полифосфазены; деградирующие в биологической среде микросферы; монофосфориллипид А и Quil A. Цитокины, такие как GM-CSF, интерлейкин-2, -7, -12, и другие подобные факторы роста, также могут использоваться в качестве адъювантов.

В некоторых осуществлениях изобретения предпочтительной является та композиция адъюванта, которая индуцирует иммунный ответ преимущественно по Th1-типу. Высокие концентрации цитокинов Th1-типа (например, IFN-γ, TNFα, IL-2 и IL-12) склонны к индукции клеточно-опосредованных иммунных реакций на введенный антиген. Высокие концентрации цитокинов Th2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10), наоборот, склонны к индукции гуморальных иммунных реакций. После применения описанной здесь вакцины у пациента поддерживается иммунный ответ, включающий реакции Th1- и Th2-типа. В предпочтительном осуществлении, в котором ответ преимущественно относится к Th1-типу, концентрация цитокинов Th1-типа возрастает в большей степени, чем концентрация цитокинов Th2-типа. Концентрации данных цитокинов можно легко оценить с использованием стандартных способов анализа. Для обзора семейств цитокинов см. Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Некоторое предпочтительные адъюванты для того, чтобы вызывать преимущественно ответ Th1-типа включают, например, комбинацию монофосфориллипида A, предпочтительно, 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида A, с солью алюминия. Доступны адъюванты MPL® от корпорации Corixa (Seattle, WA; см., например, патент США № 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). CpG-содержащие олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG не метилирован) также индуцируют преимущественно ответ Th1-типа. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и патентами США № 6008200 и 5856462. Иммуностимуляторные последовательности ДНК также описаны, например, Sato et al, Science 273:352, 1996. Другой предпочтительный адъювант включает сапонин, такой как Quil A, или его производные, включая QS21 и QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); эсцин; дигитонин; или сапонины Gypsophila или Chenopodium quinoa. Другие предпочтительные препараты включают более одного сапонина в комбинации адъювантов по настоящему изобюретению, например, в комбинации по крайней мере двух из следующей группы, включающей QS21, QS7, Quil A, β-эсцин или дигитонин.

Альтернативно, препараты сапонинов могут комбинироваться с носителями вакцины, состоящими из хитозана или других поликатионных полимеров, полиактидами и полиактид-когликалидами, частицами, полимерным матриксом на основе поли-N-ацетилглюкозамина, частицами, состоящими из полисахаридов или химически модифицированных полисахаридов, липосомами и частицами на основе липидов, частицами, состоящими из моноэфиров глицерина, и т.д. Сапонины также могут составлять композицию в присутствии совместно с холестерином, с образованием структур в виде частиц, таких как липосомы или ISCOM. Более того, сапонины также могут составлять композицию в присутствии сложного или простого эфира полиоксиэтилена, представляющую собой как раствор без частиц, так и суспензию, или структуру в виде частиц, такую как слаболамеллярные липосомы или ISCOM. Сапонины могут также составлять композицию с наполнителями, такими как Carbopol®, для увеличения вязкости, или композиции могут быть получены в виде сухого порошка с порошковым наполнителем, таким как лактоза.

В одном из предпочтительных осуществлений система адъювантов включает комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, такую как комбинация QS21 и адъюванта 3D-MPL®, как описано в WO 94/00153, или менее реактогенную композицию, где QS21 гасят холестерином, как описано в WO 96/33739. Другие предпочтительные композиции включают эмульсию масла в воде и токоферол. Другой особенно предпочтительный препарат адъюванта с использованием QS21, адъюванта 3D-MPL и токоферола эмульсии масла в воде описан в WO 95/17210.

Другая усиленная система адъювантов включает комбинацию CpG-содержащего олигонуклеотида и производного сапонина, в частности, комбинация CpG и QS21 описана в WO 00/09159. Предпочтительно, препарат дополнительно включает эмульсию масла в воде и токоферол.

Дополнительные иллюстративные адъюванты для применения в фармацевтических композициях по изобретению включают Montanide ISA 720 (Seppic, Франция), SAF (Chiron, Калифорния, Соединенные Штаты), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), серию адъювантов SBAS (например, SBAS-2 или SBAS-4, доступные от SmithKline Beecham, Rixensart, Бельгия), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) и другие аминоалкилглюкозаминид-4-фосфаты (AGP), такие как описанные в находящихся на рассмотрении заявках на патент США за серийными номерами 08/853826 и 09/074720, описания которых включены сюда полностью в качестве ссылки, и адъюванты на основе полиоксиэтиленовых простых эфиров, таких как описанные в WO 99/52549A1.

Другие предпочтительные адъюванты включают адъювантные молекулы общей формулы:

(I): НО(CH₂CH₂O)_n-A-R,

где n составляет 1-50, A представляет собой связь или -С(O)-, R представляет собой C_1-50-алкил или фенил-C_1-50-алкил.

Одно из осуществлений настоящего изобретения состоит из препарата вакцины, включающего полиоксиэтиленовый простой эфир общей формулы (I), где n лежит между 1 и 50, предпочтительно, в интервале 4-24, наиболее предпочтительно, составляет 9; компонент R представляет собой C_1-50, предпочтительно, C₄-C₂₀-алкил и, наиболее предпочтительно C₁₂ -алкил, и A представляет собой связь. Концентрация полиоксиэтиленовых простых эфиров лежит в интервале 0,1-20%, предпочтительно, 0,1-10%, и, наиболее предпочтительно, в интервале 0,1-1%. Предпочтительные полиоксиэтиленовые простые эфиры выбраны из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый простой эфир, полиоксиэтилен-9-стеариловый простой эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый простой эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый простой эфир, полиоксиэтилен-35- лауриловый простой эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый простой эфир. Полиоксиэтиленовые простые эфиры, такие как полиоксиэтиленлауриловый простой эфир, описаны в каталоге Merck (12 издание: статья 7717). Данные молекулы адъюванта описаны в WO 99/52549.

Полиоксиэтиленовый простой эфир по вышеуказанной общей формуле (I), если требуется, может быть комбинирован с другим адъювантом. Например, предпочтительной комбинацией адъювантов предпочтительно является комбинация CpG, как описано в находящейся на рассмотрении заявке на патент Великобритании GB 9820956.2.

По другому осуществлению данного изобретения описанная здесь иммуногенная композиция доставляется хозяину посредством антиген-презентирующих клеток (APC), таких как дендритные клетки, макрофаги, B-клетки, моноциты и другие клетки, которые могут быть подобраны в качестве эффективных APC. Такие клетки могут необязательно быть генетически модифицированы для увеличения способности представления антигена, для улучшения активации и/или поддержания Т-клеточного ответа, для того, чтобы они обладали противоопухолевым действием сами по себе и/или были иммунологически совместимы с реципиентом (т.е., совпадающий гаплотип HLA). APC в основном могут быть выделенными из любых различных биологических жидкостей и органов, включая опухолевые и околоопухолевые ткани, и могут являться аутологичными, аллогенными, сингенными или ксеногенными.

В некоторых предпочтительных осуществлениях настоящего изобретения применяются дендритные клетки или их предшественники, такие как антиген-презентирующие клетки. Дендритные клетки представляют собой мощные APC (Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998) и, как показано, являются эффективными в качестве физиологических адъювантов для индукции профилактического или терапевтического противоопухолевого иммунитета (см. Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med 50:507-529, 1999). Вообще, дендритные клетки могут быть идентифицированы на основе их их типичной формы (звездчатые in situ, с заметными цитоплазматическими отростками (дендритами), видимыми in vitro), их способности с высокой эффективностью захватывать, процессировать и представлять, и их способности активировать ответы наивных T-клеток. Конечно, могут быть сконструированы дендритные клетки, экспрессирующие специфичные рецепторы или лиганды клеточной поверхности, которые обычно не обнаруживаются на дендритных клетках in vivo или ex vivo, и модифицированные таким образом дендритные клетки рассматриваются по настоящему изобретению. В качестве альтернативы дендритным клеткам, с вакциной могут использоваться секретируемые везикулы нагруженных антигеном дендритных клеток (называемые экзосомами) (см. Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998).

Дендритные клетки и предшественники могут быть получены из периферической крови, костного мозга, околоопухолевых инфильтрирующих опухоль клеток, лимфатических узлов, селезенки, кожи, пуповинной крови или из любой другой ткани или жидкости. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ex vivo путем добавления комбинации цитокинов, таких как GM-CSF, IL-4, IL-13 и/или TNFα, к культурам моноцитов, собранных из периферической крови. Альтернативно, CD34-позитивные клетки, собранные из периферической крови, пуповинной крови или костного мозга могут дифференцироваться в дендритные клетки путем добавления к культуральной среде комбинации GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 -лиганда, LPS, flt3-лиганда и/или другого(их) соединения(ий), которые индуцируют дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток.

Дендритные клетки принято подразделять на "незрелые" и "зрелые" клетки, что позволяет простым путем разделять два хорошо охарактеризованные фенотипа. Однако данная номенклатура не должна быть истолкована как исключающая все возможные промежуточные стадии дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как APC с высокой способностью к захвату и процессингу антигена, который коррелирует с высоким уровнем экспрессии Fcγ-рецептора и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется как более низкой экспрессией данных маркеров, но более высокой экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию T-клеток, таких как MHC I и II классов, молекулы адгезии (например, CD54 и CD11) и костимуляторные молекулы (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1BB).

Как правило, APC могут трансфицироваться полинуклеотидом по изобретению (или его частью, или его другим вариантом), таким что кодируемый им полипептид или его иммуногенная часть экспрессируются на клеточной поверхности. Такая трансфекция может происходить ex vivo, и фармацевтическая композиция, включающая такие трансфицированные клетки, может затем использоваться для терапевтических целей, как описано здесь. Альтернативно, носитель доставки генов, мишенью которого являются дендритные или другие антиген-презентирующие клетки, может вводиться пациенту, что в результате приводит к трансфекции, которая происходит in vivo. Трансфекция дендритных клеток in vivo и ex vivo, например, может в основном проводиться с использованием любых способов, известных в данной области, таких как те, что описаны в WO 97/24447, или как подход генной пушки, описанный Mahvi et al., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997. Загрузка дендритных клеток антигеном может достигаться путем инкубирования дендритных клеток или клеток-предшественников с опухолевым полипептидом, ДНК (голой или в составе плазмидного вектора) или РНК; или экспрессирующими антиген рекомбинантными бактериями или вирусами (например, векторы на основе вируса коровьей оспы, поксвируса домашней птицы, аденовируса или лентивируса). Перед загрузкой полипептид может ковалентно конъюгироваться с иммуногенным партнером, который обеспечивает помощь Т-клетки (например, с молекулой носителя). Альтернативно, дендритная клетка может быть стимулирована неконъюгированным иммунологическим партнером, отдельно или в присутствии полипептида.

Хотя в фармацевтических композициях по изобретению может использоваться любой подходящий носитель, известный обычным специалистам в данной области, тип носителя обычно изменяется в зависимости от способа введения. Композиции по настоящему изобретению могут составляться для любого подходящего способа введения, включая, например, местное, пероральное, назальное, введение на слизистую, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное и внутримышечное введение.

Носители для применения в таких фармацевтических композициях являются биосовместимыми и также могут быть способными к деградации в биологических условиях. В некоторых осуществлениях препарат предпочтительно предоставляет относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. В других осуществлениях может, однако, требоваться более высокая скорость высвобождения немедленно после введения. Составление таких композиций хорошо известно на обычном уровне в данной области и выполняется с использованием известных способов. Иллюстративные носители, применимые в этой связи, включают микрочастицы поли(лактид-когликолида), полиакрилата, латекса, крахмала, целюлозы, декстрана и подобных. Другие иллюстративные носители замедленного высвобождения включают надмолекулярные биовекторы, которые включают нежидкую гидрофильную сердцевину (например, перекрестно связанные полисахариды или олигосахариды) и, необязательно, внешний слой, включающий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и заявки PCT WO 94/20078, WO 94/23701 и WO 96/06638). Количество активного компонента, содержащееся внутри препарата замедленного высвобождения, зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой длительности высвобождения и природы состояния, подлежащего лечению или профилактике.

В другом иллюстративном осуществлении биодеградируемые микросферы (например, полилактат-полигликолят) применяются в качестве носителей для композиций по данному изобретению. Подходящие деградирующие в биологических условиях микросферы описаны, например, в патентах США № 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883; 5853763; 5814344, 5407609 и 5942252. Системы носителя на основе модифицированных коровых белков вируса гепатита В, такие как описанные в WO 99/40934, и цитируемых здесь ссылках, также могут использоваться во многих применениях. Другая иллюстративная система носителя/доставки задействует носитель, включающий комплексы частиц и белков, такие как описанные в патенте США № 5928647, которые способны индуцировать у хозяина рестрикцированные классом I реакции цитотоксических Т-лимфоцитов.

Фармацевтические композиции по изобретению, кроме того, часто включают один или несколько буферов (например, нейтральный солевой буфер или фосфатный солевой буфер), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстран), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатики, хелатирующие средства, такие как EDTA или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия), растворы, приводящие препарат к изотоничному, гипотоничному или слабо гипертоничному состоянию по отношению к крови реципиента, суспендирующие средства, загустители и/или консерванты. Альтернативно, композиции по настоящему изобретению могут быть составлены в виде лиофилизата.

Описанные здесь фармацевтические композиции могут быть представлены в контейнерах, содержащих одну или несколько доз, таких как запечатанные ампулы или пузырьки. Такие контейнеры обычно закрыты таким образом, чтобы сохранить стерильность и стабильность препарата перед исследованием. Вообще, препараты можно хранить в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных носителях. Альтернативно, фармацевтические композиции можно хранить в условиях вымораживания-сушки, что требует лишь добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед исследованием.

Разработка подходящих режимов дозировки и лечения для применения конкретных описанных здесь фармацевтических композиций среди разнообразия режимов лечения, включая, например, пероральное, парентеральное, внутривенное, интраназальное и внутримышечное введение и составление, хорошо известна в данной области, и некоторые из данных режимов вкратце обсуждаются ниже в основном с целью иллюстрации.

В некоторых применениях описанная здесь фармацевтическая композиция может быть доставлена путем перорального введения. В таком случае данные композиции могут составляться в инертном растворителе или в усвояемом съедобном носителе или могут быть помещены внутрь желатиновых капсул с мягкой или жесткой оболочкой, или они могут быть спрессованы в таблетки, или они могут быть включены в состав пищевых продуктов диеты.

Активные соединения даже могут быть объединены с носителями и могут применяться в форме перевариваемых таблеток, сосательных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного (см., например, Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27; 386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998; 15(3):243-84; патент США 5641515; патент США 5580579 и патент США 5792451). Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы, и тому подобное, могут содержать также любую разновидность дополнительных компонентов, например, связывающее средство, такое как трагакантовая камедь, гуммиарабик, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как двухзамещенный фосфат кальция; могут быть добавлены дезинтегрирующие средства, такие как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и тому подобные; смазка, такая как стеарат магния; и подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин, или вкусовые добавки, такие как со вкусом перечной мяты, масла зимолюбки или вишни. Когда форма дозированной единицы представляет собой капсулу, она может содержать жидкий носитель в дополнение к материалам вышеуказанного типа. Различные другие материалы могут быть представлены в виде покрытий или для модификации другим образом физического состояния дозированной единицы. Например, таблетки, пилюли или капсулы могут быть покрыты шеллаком, сахаром или обоими. Конечно, любой материал, применяемый для получения любой формы дозированной единицы должен быть фармацевтически чистым и не проявлять существенной токсичности в применяемых количествах. Кроме того, активные соединения могут быть включены в препараты и композиции с замедленным высвобождением.

Обычно данные композиции содержат, по крайней мере, около 0,1% или более активного компонента, хотя процентное содержание активного(ых) ингредиента(ов) может, конечно, варьировать и может подходящим образом быть примерно от 1 или 2% до около 60% или 70%, или более, по массе или объему от всей композиции. Естественно, количество активного(ых) компонента(ов) в каждой терапевтически применимой композиции может быть приготовлено таким образом, что в каждой введенной единице дозы может быть получена подходящая дозировка. Такие факторы, как растворимость, биодоступность, биологический период полужизни, путь введения, срок хранения продукта, а также другие фармакологические соображения будут учтены специалистом в области получения таких фармацевтических препаратов, и по существу могут потребоваться разнообразные дозировки и режимы лечения.

Для перорального введения композиции по настоящему изобретению могут альтернативно объединяться с одним или несколькими наполнителями в форме полоскания, зубной пасты, сосательной конфеты, спрея для рта или вводимого перорально под язык композиции. Альтернативно, активный ингредиент может вводиться в пероральный раствор, такой как содержащий борат натрия, глицерин и бикарбонат калия, или может диспергироваться в зубной пасте, или может добавляться в терапевтически эффективном количестве в композицию, которая может включать воду, носители, абразивы, вкусовые добавки, пенящие средства и увлажнители. Альтернативно из композиций могут образовывать формы таблетки или раствора, которые могут помещаться под язык или по другому растворяться во рту.

В некоторых обстоятельствах требуется доставлять описанные здесь фармацевтические композиции парентерально, внутривенно, внутримышечно или даже внутрибрюшинно. Такие подходы хорошо известны специалистам в данной области, некоторые из них далее описаны, например, в патенте США 5543158; в патенте США 5641515 и в патенте США 5399363. В некоторых осуществлениях растворы активных соединений в качестве свободных оснований фармацевтически приемлемых солей могут быть получены в воде, подходящим образом смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии также могут быть получены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. В обычных условиях хранения и применения данные препараты, как правило, содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.

Иллюстративные фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для срочного получения стерильных растворов или дисперсий для инъекций (например, см. патент США 5466468). Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до той степени, в которой возможно легкое применение шприца. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна предохраняться от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), их подходящие смеси и/или растительные масла. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размеров частиц в случае дисперсии и/или путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может обеспечиваться путем различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимерозала и тому подобного. Во многих случаях предпочтительным является включать изотоничные средства, например, сахара и хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъецированных композиций может осуществляться применением композиций средств, задерживающих всасывание, например моностеаратов алюминия и желатина.

В одном из осуществлений для парентерального введения в водном растворе данный раствор должен быть, при необходимости, подходящим образом забуференным и жидкий растворитель вначале приводится в изотоничное состояние достаточным количеством солевого раствора или глюкозы. Данные конкретные водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения. В этой связи стерильная водная среда, которая может применяться, известна специалистам в данной области в свете настоящего описания. Например, одна дозировка может быть растворена в 1 мл изотоничного раствора NaCl и может быть либо добавлена к 1000 мл жидкости гиподермоклизиса (hypodermoclysis) или инъецирована в предполагаемый участок инфузии (см., например, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15^ое издание, с. 1035-1038 и 1570-1580). Некоторые вариации в дозировке обязательно имеют место в зависимости от состояния подлежащего лечению пациента. Более того, препараты для введения человеку, конечно, предпочтительно характеризуются стерильностью, пирогенностью и соответствуют стандартам общей безопасности и чистоты по требованиям FDA Office of Biologics standards.

В другом осуществлении изобретения описанные здесь композиции могут составляться в нейтральной или солевой форме. Иллюстративные фармацевтически приемлемые соли включают аддитивные соли кислот (образованные свободными аминогруппами белка), и они образованы неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и подобные. Соли, образованные свободными карбоксигруппами, также могут происходить от неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и подобное. После составления растворы вводят способом, совместимым с дозированным препаратом и в таком количестве, как терапевтически эффективное.

Данные носители могут далее включать любой и все из растворителей, дисперсионных сред, носителей, покрытий, растворителей, антибактериальных и противогрибковых средств, изотоничных средств и средств задержки всасывания, буферов, растворов-носителей, суспензий, коллоидов и тому подобное. Применение таких сред и средств по отношению к фармацевтически активным веществам хорошо известно в данной области. Кроме случая, когда какая-либо общепринятая среда или средство оказываются несовместимыми с активным ингредиентом, их применение в фармацевтической композиции рассматривается. Дополнительные активные ингредиенты также могут входить в состав композиции. Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным образованиям и композициям, которые не приводят к аллергическим и сходным неблагоприятным реакциям при введении человеку.

В некоторых осуществлениях фармацевтические композиции могут доставляться посредством интраназальных спреев, ингаляции и/или других аэрозольных носителей для доставки. Способы доставки генов, нуклеиновых кислот и пептидных композиций для доставки непосредственно в легкие посредством назальных аэрозольных спреев описаны, например, в патенте США 5756353 и патенте США 5804212. Сходным образом, доставка лекарственных средств посредством интраназальных смол на основе микрочастиц (Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2; 52(1 -2):81-7) и соединений лизофосфатидилглицерина (патент США 5725871) также хорошо известны в области фармакологии. Сходным образом, иллюстративная доставка лекарственного средства через слизистую в форме политетрафторэтиленового основного матрикса описана в патенте США 5780045.

В некоторых осуществлениях для введения композиций по настоящему изобретению в подходящие клетки/организмы хозяина используют липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, липидные частицы, везикулы и тому подобное. В частности, композиции по настоящему изобретению могут составляться для доставки инкапсулированными в липидную частицу, липосому, везикулу, наносферу или наночастицу, или тому подобное. Альтернативно, композиции по настоящему изобретению могут быть ковалентно или нековалентно связаны с поверхностью таких везикул носителя.

Получение и применение липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств в основном известно специалистам в данной области (см., например, Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul; 16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug; 35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61; патент США 5567434; патент США 555257; патент США 5565213; патент США 5738868 и патент США 5795587, каждый из которых специфично включен сюда полностью в качестве ссылки).

Липосомы успешно применяли с некоторым количеством клеточных типов, которые обычно трудно трансфицировать другими способами, включая суспензии, Т-клеток, первичные культуры гепатоцитов и клетки PC 12 (Renneisen et al., J. Biol. Chem. 1990 Sep 25; 265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr; 9(3):221-9). Кроме того, липосомы не характеризуются затруднениями, связанными с длиной ДНК, которые типичны для основанных на вирусах систем доставки. Липосомы эффективно применяли для введения генов, различных лекарственных средств, радиотерапевтических средств, ферментов, вирусов, транскрипционных факторов, аллостерических эффекторов и тому подобного в разнообразные линии культивируемых клеток и в разных животных. Более того, оказывается, что применение липосом не ассоциировано с аутоиммунными реакциями или неприемлемой токсичностью после системного введения.

В некоторых осуществлениях липосомы формируют из фософлипидов, которые диспергированы в водной среде и спонтанно образуют мультиламеллярные концентрические двухслойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами (MLV).

Альтернативно, в других осуществлениях изобретение относится к фармацевтически приемлемым нанокапсульным препаратам композиций по настоящему изобретению. Нанокапсулы, как правило, могут захватывать соединения стабильным и воспроизводимым путем (см., например, Quintanar-Guerrero et al., Drug. Dev. Ind. Pharm. 1998 Dec; 24(12):1113-28). Во избежание побочных эффектов вследствие внутриклеточной полимерной перегрузки, такие ультратонкие частицы (размером около 0,1 мкм) могут быть сконструированы с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Такие частицы могут быть получены, как описано, например, Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 1988; 5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 1998 Mar; 45(2):149 -55; Zambaux et al., J. Controlled Release. 1998 Jan 2; 50(1 -3):31-40; и патентом США 5145684.

Способы лечения злокачественных опухолей

В дальнейших аспектах настоящего изобретения описанные здесь фармацевтические композиции могут использоваться для лечения злокачественных опухолей, в частности для иммунотерапии рака легких. При таких способах описанные фармацевтические композиции вводят пациенту, обычно, теплокровному животному, предпочтительно, человеку. Пациент может страдать от злокачественной опухоли или может не страдать. Соответственно, вышеуказанные фармацевтические композиции могут применяться для предотвращения развития злокачественной опухоли или для лечения пациента, страдающего от злокачественной опухоли. Фармацевтические композиции и вакцины могут вводиться либо до, либо после хирургического удаления первичных опухолей и/или лечения, такого как назначение радиотерапии или общепринятых лекарственных средств химиотерапии. Как обсуждалось выше, введение фармацевтических композиций может осуществляться любым подходящим способом, включая введение внутривенным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, интраназальным, внутрикожным, анальным, вагинальным, местным и пероральным путями.

В некоторых осуществлениях иммунотерапия может предсталять собой активную иммунотерапию, при которой лечение основывается на стимуляции in vivo противоопухолевой реакции эндогенной иммунной системы хозяина посредством введения модулирующих иммунный ответ средств (таких как описанные здесь полипептиды и полинуклеотиды).

В других осуществлениях иммунотерапия может являться пассивной иммунотерапией, при которой лечение включает доставку средств с установленной противоопухолевой иммунореактивностью (таких как эффекторные клетки или антитела), которая может прямо или косвенно опосредовать противоопухолевое действие и не обязательно зависит от интактной иммунной системы хозяина. Примеры эффекторных клеток включают обсуждаемые выше Т-клетки, T-лимфоциты (такие как CD8⁺-цитотоксические T-лимфоциты и CD4⁺-T-хелперные, инфильтрирующие опухоль лимфоциты), клетки-киллеры (такие как естественные киллеры и лимфокин-активируемые киллерные клетки), B-клетки и антиген-презентирующие клетки (такие как дендритные клетки и макрофаги), экпрессирующие описанный здесь полипептид. Т-клеточные рецепторы и иммуноглобулиновые рецепторы, специфичные к приведенным здесь полипептидам, могут клонироваться, экспрессироваться и трансфицироваться в другие векторы и эффекторные клетки для адаптивной иммунотерапии. Описанные здесь полипептиды также могут применяться для получения антител и антиидиотипических антител (как описано выше и в патенте США № 4918164) для пассивной иммунотерапии.

Эффекторные клетки, как правило, могут быть получены в достаточных для иммунотерапии количествах путем выращивания in vitro, как описано здесь. В данной области хорошо известны условия культивирования для экспансии единственной специфичной к антигену эффекторной клетки до нескольких миллиардов по численности с сохранением распознавания антигена in vivo. При таких условиях культивирования in vitro обычно применяют перемежающуюся стимуляцию антигеном, часто в присутствии цитокинов (таких, как IL-2) и неделящихся клеток-кормилиц. Как отмечено выше, описанные здесь иммунореактивные полипептиды могут использоваться для быстрой экспансии антиген-специфичных культур Т-клеток, для получения достаточного для иммунотерапии количества клеток. В частности, антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и/или В-клетки могут подвергаться воздействию иммунореактивных полипептидов или трансфицироваться одним или несколькими полинуклеотидами, с использованием стандартных способов, хорошо известных в данной области. Например, антиген-презентирующие клетки могут траснфицироваться полинуклеотидом, имеющим промотор, подходящий для увеличения экспрессии в рекомбинантном вирусе или другой экспрессирующей системе. Культивируемые эффекторные клетки для применения при лечении должны обладать способностью расти и широко распространяться, и в течение длительного времени выживать in vivo. Исследования показали, что можно индуцировать рост in vivo и долгосрочное выживание культивируемых эффекторных клеток в существенных количествах путем повторных стимуляций антигеном, дополненных IL-2 (см., например, Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997).

Альтернативно, вектор, экспрессирующий приведенные здесь полипептиды, может быть введен в антиген-презентирующие клетки, взятые от пациента и подвергшиеся клональной экспансии ex vivo для обратной трансплантации тому же пациенту. Трансфицированные клетки могут повторно водиться пациенту с использованием любых средств, известных в данной области, предпочтительно в стерильной форме, путем внутривенного, внутриполостного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введения.

Пути и частота введения описанных здесь терапевтических композиций, также как дозировка, варьируют от субъекта к субъекту, и могут быть легко установлены с использованием стандартных способов. В основном фармацевтические композиции могут вводиться путем инъекции (например, внутрикожной, внутримышечной, внутривенной или подкожной), интраназально (например, путем аспирации) или перорально. Предпочтительно, от 1 до 10 доз могут вводиться в течение периода 52 недель. Предпочтительно, вводят 6 доз с интервалами в 1 месяц, и после этого могут проводиться поддерживающие вакцинации. Альтернативные протоколы могут применяться по отношению к конкретным пациентам. Подходящая доза представляет собой количество соединения, которое при введении, как описано выше, способно вызвать противоопухолевый иммунный ответ, на уровне по крайней мере на 10-50% выше базального (т.е., необработанного). Такой ответ может отслеживаться путем измерения у пациента количества противоопухолевых антител или путем вакцинозависимого получения цитолитических эффекторных клеток, способных убивать опухолевые клетки пациента in vitro. Такие вакцины также способны вызывать иммунный ответ, который ведет к улучшенному клиническому исходу (например, более частые ремиссии, полное или частичное, или долгое выживание без заболевания) у вакцинированных пациентов по сравнению с невакцинированными пациентами. В общем, для фармацевтических композиций и вакцин, включающих один или несколько полипептидов, количество каждого полипептида, присутствующими в интервалах доз примерно от 25 мкг до 5 мг на кг массы хозяина. Подходящие объемы дозировки варьируют в зависимости от размера пациента, но обычно варьируют примерно от 0,1 мл до 5 мл.

В общем, подходящий режим дозировки и лечения обеспечивает активное(ые) соединение(я) в количестве, достаточном для предоставления терапевтической и/или профилактической пользы. Такой ответ может отслеживаться за счет установления улучшенного клинического исхода (например, более частые ремиссии, полное или частичное, или долгое выживание без заболевания) у подвергавшихся лечению пациентов по сравнению с необработанными пациентами. Повышение предсуществующих иммунных реакций на опухолевый белок, как правило, коррелирует с улучшенным клиническим исходом. Такие иммунные реакции в основном можно оценить с использованием стандартных анализов пролиферации, цитотоксичности или цитокинов, которые можно проводить с использованием образцов, полученных от пациента до и после лечения.

Выявление злокачественной опухоли и диагностические композиции, способы и наборы

Вообще, злокачественную опухоль можно выявить у пациента, основываясь на присутствии одного или нескольких белков опухоли легких и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки в биологическом образце (например, кровь, сыворотки, мокрота, моча и/или биопсии опухоли), полученного от пациента. Иными словами, такие белки могут использоваться в качестве маркеров для индикации наличия или отсутствия злокачественной опухоли, такой как рак легких. Кроме того, такие белки могут использоваться для детекции других злокачественных опухолей. Описывающие здесь связывающие агенты, как правило, позволяют проводить детекцию уровня антигена, который связывается с агентом, в биологическом образце. Полинуклеотидные праймеры и зонды могут использоваться для детекции уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок, который также является индикатором наличия или отсутствия злокачественной опухоли. Вообще, последовательность опухоли легких должна присутствовать в концентрации, по крайней мере втрое большей в опухолевой ткани, чем нормальной ткани.

Имеется разнообразное количество форматов анализа, известных обычным специалистам в данной области, для применения связывающего агента в детекции полипептидных маркеров в образце. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Вообще, наличие или отсутствие злокачественной опухоли у пациента может определяться (a) взаимодействием биологического образца, полученного от пациента со связывающим агентом; (b) детекцией в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнением уровня полипептида с предварительно определенным уровнем отсечения.

В предпочтительном осуществлении анализ включает применение связывающего агента, иммобилизированного на твердой основе для связывания с ним полипептида и удаления полипептида из остатка образца. Связанный полипептид затем может детектироваться с использованием реагента для детекции, который содержит репортерную группу и специфично связывается с комплексом связывающий агент/полипептид. Такие реагенты для детекции могут включать, например, связывающий агент, который специфично связывается с полипептидом или антителом, или другим агентом, который специфично связывается со связывающим агентом, таким как анти-иммуноглобулин, белок G, белок A или лектин. Альтернативно, может применяться конкурентный анализ, при котором полипептид помечен репортерной группой и подлежит связыванию с иммобилизированным связывающим агентом после инкубации связывающего агента с образцом. Степень, до которой компоненты образца ингибируют связывание меченого полипептида со связывающим агентом, является индикатором реакционной способности образца по отношению к иммобилизированному связывающему агенту. Подходящие полипептиды для применения при таких способах анализа включают полноразмерные опухолевые белки и их полипептидные части, с которыми связывается связывающий агент, как описано выше.

Твердая основа может быть из любого материала, известного специалистам в данной области, к которому может привязываться опухолевый белок. Например, твердая основа может быть тестовой лункой планшета для микротитрования или нитроцеллюлозной, или другой подходящей мембраной. Альтернативно, основа может представлять собой гранулу или диск, такой как из стекла, стекловолокна, латекса или пластикового материала, такого как полистирол или поливинилхлорид. Основа также может являться магнитной частицей или оптоволоконным сенсором, таким как те, что описаны, например, в патенте США № 5359681. Связывающий агент может быть иммобилизирован на твердой основе с использованием разнообразных способов, известных специалистам в данной области, которые полно описаны в патентной и научной литературе. В контексте настоящего изобретения термин "иммобилизация" относится как к нековалентной ассоциации, такой как адсорбция, и ковалентному привязыванию (которое может представлять собой прямую связь между агентом и функциональными группами основы или может представлять собой связь посредством агента перекрестного связывания). Иммобилизация путем абсорбции на лунку планшета для микротитрования или на мембрану является предпочтительной. В таких случаях адсорбция может быть достигнута путем взаимодействия связывающего агента с твердой основой в подходящем буфере в течение подходящего периода времени. Время контакта варьирует в зависимости от температуры, но обычно составляет примерно от 1 часа до 1 суток. Вообще, взаимодействие лунки пластикового планшета для микротитрования (такого как из полистирола или поливинилхлорида) с количеством связывающего агента, лежащим в интервале примерно от 10 нг до 10 мкг, и предпочтительно примерно от 100 нг примерно до 1 мкг, является достаточным для иммобилизации адекватного количества связывающего агента.

Ковалентное привязывание связывающего агента к твердой основе, как правило, может быть достигнуто вначале путем взаимодействия основы с бифункциональным реагентом, который будет реагировать как с основой, так и с функциональной группой связывающего агента, такой как гидроксил или аминогруппа. Например, связывающий агент может быть ковалентно привязан к основам, имеющим соответствующее полимерное покрытие, с использованием бензохинона или путем конденсации альдегидной группы основы с амином и активным водородом на партнере связывания (см., например, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13).

В некоторых осуществлениях анализ представляет собой сэндвич-анализ с двумя антителами. Данный анализ может проводиться путем первоначального взаимодействия антитела, которое иммобилизовано на твердой основе, обычно на лунке планшета для микротитрования, с образцом, так что полипептиды в образце имеют возможность связываться с иммобилизированным антителом. Затем несвязавшуюся часть образца удаляют от иммобилизованных комплексов полипептид-антитело, и добавляют реагент для детекции (предпочтительно, вторичное антитело, способное связываться с другим участком полипептида), содержащий репортерную группу. Количество реагента для детекции, которое остается связанным на твердой основе, затем определяют с использованием способа, подходящего для конкретной репортерной группы.

Более конкретно, как только антитело иммобилизируется на основе, как описано выше, оставшиеся на основе участки связывания белка обычно блокируют. Специалистам в данной области известны некоторые подходящие блокирующие агенты, таакие как бычий сывороточный альбумин или Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Иммобилизированное антитело затем инкубируют с образцом, и дают возможность полипептиду связываться с антителом. Образец перед инкубацией может быть разведен подходящим растворителем, таким как фосфатно-солевой буфер (PBS). Вообще, подходящее время контакта (т.е., время инкубации) представляет собой период времени, которого достаточно для детекции наличия полипептида в образце, полученном от субъекта с раком легких. Предпочтительно, время контакта является достаточным для достижения уровня связывания, который составляет по крайней мере 95% от времени достижения равновесия между связанным и несвязанным полипептидом. Обычным специалистам в данной области очевидно, что время, необходимое для достижения равновесия, может легко определяться путем анализа уровня связывания, которое происходит в течение периода времени. При комнатной температуре, как правило, достаточно времени инкубации, примерно равного 30 минутам.

Несвязанный образец затем может удаляться путем отмывки твердой основы подходящим буфером, таким как PBS, содержащий 0,1% Tween 20™. Вторичное антитело, которое содержит репортерную группу, может затем добавляться к твердой основе. Предпочтительные репортерные группы содержат те группы, что описаны выше.

Затем с иммобилизированным комплексом антитело-полипептид инкубируют реагент для детекции в течение периода времени, достаточного для детекции связанного полипептида. Подходящий отрезок времени может, как правило, определяться путем анализа уровня связывания, которое происходит в течение периода времени. Затем удаляют несвязавшийся реагент для детекции, и связанный реагент для детекции детектируют с использованием репортерной группы. Способ, задействующий детекцию репортерной группы, зависит от природы репортерной группы. Для радиоактивных групп, как правило, подходят способы подсчета сцинтилляций или авторадиографии. Спектроскопические способы могут применяться для детекции меток, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Биотин может детектироваться с использованием авидина, связанного с различными репортерными группами (обычно с радиоактивной или флуоресцентной группой или ферментом). Ферментные репортерные группы, как правило, могут детектироваться путем добавления субстрата (в основном, в течение конкретного периода времени), с последующим спектроскопическим или другим анализом продуктов реакции.

Для определения наличия или отсутствия злокачественной опухоли, такой как рак легких, сигнал, детектируемый от репортерной группы, которая осталась связанной с твердой основой, как правило, сравнивают с сигналом, который соответствует предварительно определенному уровню отсечения. В одном из предпочтительных осуществлений уровень отсечения для детекции рака представляет собой среднее значение сигнала, полученного при инкубации иммобилизированного антитела с образцами от пациентов без злокачественной опухоли. Вообще, образец, сигнал от которого на три стандартных отклонения превышает предварительно определенный уровень отсечения, считается положительным в смысле злокачественной опухоли. В альтернативном предпочтительном осуществлении уровень отсечения определяется с использованием Receiver Operator Curve по способу Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7. Коротко, в данном осуществлении уровень отсечения может определяться из графика пар истинно положительных отношений (т.е., чувствительность) и ложноположительных отношений (100% специфичность), которые соответствуют каждому возможному уровню отсечения для результата диагностического теста. Значение отсечения на графике, которое является ближайшим к верхнему левому углу (т.е., значение, покрывающее наибольшую площадь) является наиболее аккуратным уровнем отсечения, и образец, генерирующий сигнал, находящийся выше уровня отсечения, определенного данным способом, может считаться положительным. Альтернативно, уровень отсечения может сдвигаться влево по графику для минимизации ложноположительного отношения или вправо для минимизации ложноотрицательного отношения. Вообще, образец, генерирующий сигнал, находящийся выше уровня отсечения, определенного данным способом, считается положительным в смысле злокачественной опухоли.

В связанном осуществлении проводят анализ в формате теста прохождения потока или теста на полоске, где связывающий агент иммобилизирован на мембране, такой как нитроцеллюлоза. При тесте прохождения потока полипептиды образца связываются с иммобилизированным связывающим агентом во время того, как образец проходит сквозь мембрану. Затем второй, меченый агент связывается с комплексом связывающий агент-полипептид во время того, как раствор, содержащий второй связывающий агент, протекает сквозь мембрану. Детекцию связанного второго связывающего агента можно затем проводить, как описано выше. В формате теста на полоске, один конец мембраны, с которой связан связывающий агент, погружают в раствор, содержащий образец. Образец мигрирует вдоль мембраны через область, содержащую второй связывающий агент и до области расположения иммобилизированного связывающего агента. Концентрация второго связывающего агента в области иммобилизированного антитела указывает на присутствие злокачественной опухоли. Обычно концентрация второго связывающего агента в этом участке приводит к образованию паттерна, такого как линия, который может определяться визуально. Отсутствие такого паттерна указывает на отрицательный результат. Вообще, количество связывающего агента, иммобилизированного на мембране, выбирают так, чтобы образовывался визуально различимый паттерн в случае, когда биологический образец содержит концентрацию полипептида, достаточную для образования положительного сигнала при сэндвич-анализе с двумя антителами, в обсуждаемом выше формате. Предпочтительными связывающими агентами для применения в таком анализе являются антитела и их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительно, количество антител, иммобилизированных на мембране, варьирует примерно от 25 нг до 1 мкг, и более предпочтительно, примерно от 50 нг и до 500 нг. Такие тесты могут обычно проводиться с очень маленьким количеством биологического образца.

Конечно, существует множество других протоколов анализа, которые подходят для применения с опухолевыми белками и связывающими агентами по настоящему изобретению. Предполагается, что вышеуказанные описания являются только типовыми. Например, специалистам в данной области понятно, что вышеуказанные протоколы могут легко модифицироваться для применения опухолевых полипептидов при детекции антител, которые связываются с такими полипептидами в биологическом образце. Детекция таких антител, специфичных к опухолевым белкам, может коррелировать с наличием злокачественной опухоли.

Злокачественна опухоль также или альтернативно, может выявляться, основываясь на наличии Т-клеток, которые специфично реагируют с опухолевым белком в биологическом образце. В рамках конкретных способов, биологический образец, включающий CD4⁺- или CD8⁺-Т-клетки, выделенные из организма пациента, инкубируют с опухолевым полипептидом, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид и/или APC, экспрессирующей по крайней мере иммуногенную часть такого полипептида, и детектируют наличие или отсутствие активации Т-клетки. Подходящие биологические образцы включают в качестве неограничивающего примера выделенные Т-клетки. Например, Т-клетки могут быть выделены из организма пациента рутинными способами (такими как центрифугирование в градиенте плотности Ficoll/Hypaque лимфоцитов периферической крови). Т -клетки могут инкубироваться in vitro в течение 2-9 суток (обычно 4 суток) при 37°С с полипептидом (например, 5 -25 мкг/мл). Может потребоваться инкубирование другой аликвоты образца Т-клеток в отсутствие опухолевого полипептида, которая будет служить контролем. Активацию CD4⁺ -Т-клеток предпочтительно детектируют путем оценки пролиферации Т-клеток. Активацию CD8⁺-Т-клеток предпочтительно детектируют путем оценки цитолитической активности. Уровень пролиферации, который по крайней мере в два раза выше, и/или уровень цитолитической активности, который по крайней мере на 20% выше таковых показателей у здоровых пациентов, указывает на наличие у пациента злокачественной опухоли.

Как отмечено выше, злокачественную опухоль также или альтернативно, можно выявить, основываясь на уровне мРНК, кодирующей опухолевый белок, в биологическом образце. Например, по крайней мере два олигонуклеотидных праймера могут применяться в анализе, основанном на полимеразной цепной реакции (PCR), для амплификации части опухолевой кДНК, выделенной из биологического образца, где по крайней мере один из олигонуклеотидных праймеров является специфичным для полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок (т.е, гибридизуется с ним). Амплифицированную кДНК затем разделяют и детектируют с использованием способов, хорошо известных в данной области, таких как гель-электрофорез. Сходным образом, в анализе гибридизации могут использоваться олигонуклеотидные зонды, которые специфично гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим опухолевый белок, для детекции наличия полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок, в биологическом образце.

Для обеспечения гибридизации в условиях анализа олигонуклеотидные праймеры и зонды должны включать олигонуклеотидную последовательность, обладающую, по крайней мере, примерно 60% идентичностью, предпочтительно, по крайней мере, примерно 75% идентичностью, и более предпочтительно, по крайней мере, примерно 90% идентичностью по отношению к части полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок по изобретению, которая составляет, по крайней мере, 10 нуклеотидов, и предпочтительно, по крайней мере, 20 нуклеотидов в длину. Предпочтительно, олигонуклеотидные праймеры и/или зонды гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим описанный здесь полипептид в умеренно жестких условиях, определенных выше. Олигонуклеотидные праймеры и/или зонды, которые могут пригодно использоваться в описанных здесь способах диагностики, предпочтительно, составляют 10-40 нуклеотидов в длину. В предпочтительном осуществлении олигонуклеотидные праймеры включают, по крайней мере, 10 следующих друг за другом нуклеотидов, более предпочтительно, по крайней мере, 15 следующих друг за другом нуклеотидов из описанной здесь молекулы ДНК. Способы всех видов анализа, основанных на PCR, и анализа гибридизации хорошо известны в данной области (см., например, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Один из предпочтительных способов анализ задействует RT-PCR, при котором PCR применяется в сочетании с обратной транскрипцией. Обычно РНК экстрагируют из биологического образца, такого как ткань биоптата, и подвергают обратной транскрипции с получением молекул кДНК. За счет PCR-амплификации с использованием специфичного праймера генерируют молекулу кДНК, которая может отделяться и визуализироваться, например, с использованием гель-электрофореза. Амплификацию можно проводить на биологических образцах, взятых от тестируемого пациента и от субъекта, не пораженного злокачественной опухолью. Реакцию амплификации можно проводить при различных разведениях кДНК, охватывающих два порядка величин. Двукратное или большее повышение экспрессии в разных разведениях образца от тестируемого пациента по сравнению с теми же разведениями образца от субъекта без злокачественной опухоли обычно считается позитивным.

В другом осуществлении описанные здесь композиции могут использоваться в качестве маркеров прогрессирования злокачественной опухоли. В данном осуществлении вышеописанные способы анализа для диагностики злокачественных опухолей могут проводиться по прошествии времени, и оценивается изменение в концентрации реакционноспособного(ых) полипептида(ов) или полинуклеотида(ов). Например, анализы можно проводить каждые 24-72 часа в течение периода от 6 месяцев до 1 года, и после этого проводить их, как потребуется. Вообще, злокачественная опухоль прогрессирует у тех пациентов, у которых концентрация выявляемого полипептида или полинуклеотида повышается. Наоборот, злокачественная опухоль не прогрессирует, когда концентрация реакционноспособного полипептида или полинуклеотида остается постоянной или снижается с течением времени.

Некоторые диагностические анализы in vivo могут проводиться непосредственно на опухоли. Один из таких анализов включает взаимодействие опухолевых клеток со связывающим агентом. Связанный связывающий агент может затем детектироваться прямо или косвенно через репортерную группу. Такие связывающие агенты также могут использоваться в гистологических применениях. Альтернативно, в таких применениях могут использоваться полинуклеотидные зонды.

Как отмечено выше, для улучшения чувствительности в данном образце могут анализироваться многие опухолевые маркеры. Также понятно, что связывающие агенты, специфичные к разным описанным здесь белкам, могут комбинироваться в одном способе анализа. Кроме того, могут одновременно использоваться разные праймеры или зонды. Выбор маркеров опухолевых белков может основываться на рутинных экспериментах по определению комбинации, которая приводит к оптимальной чувствительности. В дополнение или альтернативно, анализы на описанные здесь опухолевые белки могут комбинироваться с анализами на другие известные опухолевые антигены.

Настоящее изобретение далее относится к наборам для применения в любом из вышеуказанных способов диагностики. Такие наборы обычно включают два или более компонента, необходимых для выполнения диагностического анализа. Компоненты могут представлять собой соединения, реагенты, емкости и/или оборудование. Например, одна из емкостей в наборе может содержать моноклональные антитела или их фрагмент, который специфично связывает опухолевый белок. Такие антитела или фрагменты могут поставляться привязанными к материалу основы, как описано выше. Один или несколько дополнительных компонентов могут включать элементы, такие как реагенты или буферы, подлежащие использованию при анализе. Такие наборы также или альтернативно, могут включать реагент для детекции, как описано выше, который содержит репортерную группу, подходящую для прямой или непрямой детекции связывания антител.

Альтернативно, набор может конструироваться для детекции уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок, в биологическом образце. Такие наборы, главным образом, включают, по крайней мере, один олигонуклеотидный зонд или праймер, как описано выше, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим опухолевый белок. Такой олигонуклеотид, например, может использоваться в анализе PCR или гибридизации. Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать внутри таких наборов, включают второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент, или емкость для обеспечения детекции полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок.

Следующие примеры предлагаются с целью иллюстрации и без цели ограничения.

Пример 1

Получение последовательностей кДНК, специфичных для опухоли легких, с использованием дифференциального дисплея RT-PCR

Данный пример иллюстрирует получение кДНК молекул, кодирующих полипептиды, специфичные для опухоли легких, с использованием скрининга способом дифференциального дисплея.

Из опухолевой и нормальной ткани легких пациента с раком легких, который был подтвержден исследованием патологии после изъятия образцов из пациента, получали образцы ткани. Нормальную РНК и опухолевую РНК экстрагировали из образцов, и выделяли мРНК и преобразовывали в кДНК с использованием заякоренного (dT)₁₂AG (SEQ ID NO: 47) 3'-праймера. Затем выполняли PCR дифференциального дисплея с использованием случайно выбранного праймера (SEQ ID NO: 48). Условия амплификации представляли собой стандартный буфер, содержащий 1,5 мМ MgCl₂, 20 пмоль праймера, 500 пмоль dNTP и 1 единицу ДНК-полимеразы Taq (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Проводили сорок циклов амплификации с использованием денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 42°C в течение 1 минуты и удлинения при 72°C в течение 30 секунд. Полосы, которые по повторным наблюдениям являлись специфичными для паттерна РНК-фингерпринта опухоли, вырезали из окрашенного серебром геля, субклонировали в вектор pGEM-T (Promega, Madison, WI) и определяли последовательность. Выделенные 3'-последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-16.

При сравнении данных последовательностей с таковыми из доступных баз данных с использованием программы BLASTN не выявляли значимой гомологии с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 1-11. По оптимальным сведениям авторов изобретения, ранее не было показано, что какая-либо из выделенных последовательностей ДНК экспрессировалась на высоком уровне в ткани опухоли легких человека в отличие от нормальной легочной ткани.

Пример 2

Применение сывороток пациентов для идентификации последовательностей ДНК, кодирующих антигены опухоли легких

Данный пример иллюстрирует выделение последовательностей кДНК, кодирующих антигены опухоли легких, путем экспрессионного скрининга образцов опухоли легких аутологичными сыворотками пациентов.

Направленная экспрессионная библиотека кДНК опухоли легких человека была сконструирована с использованием экспрессирующей системы на основе фага лямбда ZAP Express (Stratagene, La Jolla, CA). Общую РНК для библиотеки брали из поздней человеческой плоскоклеточной эпителиальной карциномы, которую перевивали мыши со SCID, и выделяли полиА+РНК с использованием набора Message Maker (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Полученную в результате библиотеку подвергали скринингу с использованием абсорбированной E. coli аутологичной сыворотки пациента, как описано Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), со вторичным антителом, представляющим собой антитело козы против человеческих IgG-A-M (H + L), конъюгированное с щелочной фосфатазой, при развитии реакции с NBT/BCIP (Gibco BRL). Очищали позитивные бляшки, экспрессирующие иммунореактивные антигена. Извлекали из бляшек фагемид и определяли нуклеотидные последовательности клонов.

Выделяли пятнадцать клонов, в дальнейшем обозначаемые здесь как LT86-1-LT86-15. Выделенные последовательности кДНК для LT86-1-LT86-8 и LT86-10-LT86-15 представлены в SEQ ID NO: 17-24 и 26-31, соответственно, с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 32-39 и 41-46, соответственно.

Определенная последовательность кДНК для LT86-9 представлена в SEQ ID NO: 25, с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями от 3'- и 5'-концов, представленными в SEQ ID NO: 40 и 65, соответственно. Данные последовательности сравнивали с таковыми из банка генов, как описано выше. Обнаружено, что клоны LT86-3, LT86-6-LT86-9, LT86-11-LT86-13 и LT86-15 (SEQ ID NO: 19, 22-25, 27-29 и 31, соответственно) обнаруживают некоторую гомологию по отношению к ранее идентифицированным меткам экспрессирующихся последовательностей (EST), причем клоны LT86-6, LT86-8, LT86 -11, LT86-12 и LT86-15 оказались сходными или идентичными по отношению друг к другу. Обнаружено, что клон LT86-3 проявляет некоторую гомологию по отношению к репрессору транскрипции человека. Обнаружено, что клоны LT86-6, 8, 9, 11, 12 и 15 проявляют некоторую гомологию по отношению к медиатору транскрипционной регуляции дрожжевой РНК-Pol II. Обнаружено, что клон LT86-13 проявляет некоторую гомологию по отношению к лейцинаминопептидазе C.elegans. Оказалось, что клон LT86-9 содержит две вставки с 5'-последовательностью, проявляющей гомологию по отношению к ранее идентифицированной антисмысловой последовательности индуцируемого интерфероном-альфа P27, и с 3'-последовательностью, сходной с LT86-6. Обнаружено, что клон LT86-14 (SEQ ID NO: 30) проявляет некоторую гомологию по отношению к гену триторакса и имеет последовательность связывания с клетками "RGD", а также участок бета-лактамазы A, функционирующий при гидролизе пенициллина. Обнаружено, что клоны LT86-1, LT86-2, LT86-4, LT86-5 и LT86-10 (SEQ ID NO: 17, 18, 20, 21 и 26, соответственно) проявляют гомологию по отношению к ранее идентифицированным генам. Определенная впоследствии расширенная последовательность кДНК для LT86-4 представлена в SEQ ID NO: 66, с соответствующей предсказанной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 67.

Последующие исследования привели к выделению пяти дополнительных клонов, обозначенных как LT86-20, LT86-21, LT86-22, LT86-26 и LT86-27. Определенные 5'-последовательности кДНК для LT86-20, LT86-22, LT86-26 и LT86-27 представлены в SEQ ID NO: 68 и 70-72, соответственно, с определенными 3'-последовательностями кДНК для LT86-21, которые представлены в SEQ ID NO: 69. Соответствующие предсказанные аминокислотные последовательности для LT86-20, LT86-21, LT86-22, LT86-26 и LT86-27 представлены в SEQ ID NO: 73-77, соответственно. Обнаружено, что LT86-22 и LT86-27 очень сходны друг с другом. Сравнение данных последовательностей с таковыми из банка генов, как описано выше, не выявило значимой гомологии по отношению к LT86-22 и LT86-27. Обнаружено, что LT86-20, LT86 -21 и LT86-26 проявляют гомологию по отношению к ранее идентифицированным генам.

В дальнейших исследованиях получали экспрессионную библиотеку кДНК с использованием мРНК из клеточной линии мелкоклеточной карциномы легких в экспрессирующем векторе ZAP Express (Stratagene) на основе фага лямбда и подвергали скринингу, как описано выше, двумя объединенными сыворотками пациентов с мелкоклеточной карциномой легких. Объединенные сыворотки абсорбировали лизатом E. coli, и к сыворотке добавляли лизат человеческого PBMC для блокирования антител к белкам, находящимся в нормальной ткани. Выделяли семьдесят три клона. Определенные последовательности кДНК для данных клонов представлены в SEQ ID NO: 290-362. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 289-292, 294, 296-297, 300, 302, 303, 305, 307-315, 317-320, 322-325, 327-332, 334, 335, 338-341, 343-352, 354-358, 360 и 362 проявляют некоторую гомологию по отношению к выделенным ранее генам. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 293, 295, 298, 299, 301, 304, 306, 316, 321, 326, 333, 336, 337, 342, 353, 359 и 361 проявляют некоторую гомологию по отношению к идентифицированным ранее EST.

Пример 3

Применение мышиных антисывороток для идентификации последовательностей ДНК, кодирующих антигены опухоли легких

Данный пример иллюстрирует выделение последовательностей кДНК, кодирующих антигены опухоли легких, путем скрининга библиотек кДНК опухоли легких мышиными противоопухолевыми антисыворотками.

Направленную экспрессионную библиотеку кДНК опухоли легких получали, как описано выше в примере 2. Сыворотки получали от мышей со SCID, содержащих привитые плоскоклеточную опухоль и аденокарциному человека. Данные сыворотки объединяли и вводили нормальным мышам для продукции антисыворотки против опухоли легких. Из неамплифицированной библиотеки подвергали скринингу приблизительно 200000 PFU с использованием данной антисыворотки. С использованием вторичного антитела козы против мышиных IgG-A-М (H+L) с щелочной фосфатазой при развитии реакции с NBT/BCIP (BRL Labs.) идентифицировали приблизительно 40 позитивных бляшек. Фаг очищали и вырезали фагемид для 9 клонов с вставками в вектор pBK-CMV для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках.

Определенные последовательности кДНК для 7 из выделенных клонов (здесь и далее обозначенных как L86S-3, L86S-12, L86S -16, L86S-25, L86S-36, L86S-40 и L86S-46), представлены в SEQ ID NO: 49-55, с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 56-62, соответственно. Последовательности 5'-кДНК для оставшихся 2 клонов (здесь и далее обозначенные как L86S-30 и L86S-41) представлены в SEQ ID NO: 63 и 64. Впоследствии определили, что L86S-36 и L86S-46 представляют собой один и тот же ген. Сравнение данных последовательностей с таковыми в доступной базе данных, как описано выше, не выявило значимой гомологии в отношении клонов L86S-30, L86S-36 и L86S-46 (SEQ ID NO:63, 53 и 55, соответственно). Обнаружено, что L86S-16 (SEQ ID NO: 51) проявляет некоторую гомологию в отношении EST, ранее идентифицированной в фетальной опухоли легких и опухоли зародышевой линии. Обнаружено, что остальные клоны проявляют по крайней мере некоторую степень гомологии к ранее идентифицированным генам человека. Определенные впоследствии расширенные последовательности кДНК для L86S-12, L86S-36 и L86S-46 представлены в SEQ ID NO: 78-80, соответственно, с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 81-83.

Последующие исследования привели к определению 5'-последовательностей кДНК для дополнительных девяти клонов, обозначенных как L86S-6, L86S-11, L86S-14, L86S-29, L86S-34, L86S-39, L86S-47, L86S-49 и L86S-51 (SEQ ID NO: 84-92, соответственно). Соответствующие предсказанные аминокислотные последовательности, представлены в SEQ ID NO: 93-101, соответственно. Обнаружено, что L86S-30, L86S-39 и L86S-47 сходны друг с другом. Сравнение данных последовательностей с таковыми из банка генов, как описано выше, не выявило значимой гомологии в отношении L86S-14. Обнаружено, что L86S -29 проявляет некоторую гомологию в отношении ранее идентифицированной EST. Обнаружено, что L86S-6, L86S-11, L86S-34, L86S-39, L86S-47, L86S-49 и L86S-51 проявляют некоторую гомологию в отношении ранее идентифицированных генов.

В дальнейших исследованиях направленную библиотеку кДНК конструировали с использованием набора Stratagene c вектором на основе фага лямбда ZAP Express. Общую РНК для библиотеки брали из двух первичных плоскоклеточных опухолей легких, и полиА+РНК выделяли с использованием колонки олиго-dT. Антисыворотку генерировали в нормальных мышах с использованием объединенных сывороток от 3 мышей со SCID с имплантированными плоскоклеточными карциномами легких человека. Из неамплифицированной библиотеки подвергали скринингу примерно 700000 PFU посредством абсорбированной E. coli противоопухолевой сыворотки мыши со SCID. Позитивные бляшки идентифицировали, как указано выше. Фаг очищали и вырезали фагемид для 180 клонов с вставками в вектор pBK-CMV для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках.

Определенные последовательности кДНК для 23 из выделенных клонов представлены в SEQ ID NO: 126-148. Сравнение данных последовательностей с таковыми в доступной базе данных, как описано выше, не выявило значимой гомологии в отношении последовательностей SEQ ID NO: 139 и 143-148. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 126-138 и 140 -142 проявляют гомологию в отношении ранее идентифицированных полинуклеотидных последовательностей человека.

Пример 4

Применение мышиных антисывороток для скрининга библиотек опухоли легких, полученных от мышей со SCID

Данный пример иллюстрирует выделение последовательностей кДНК, кодирующих антигены опухоли легких, путем скрининга библиотек кДНК опухоли легких, полученных от мышей со SCID, посредством мышиных противоопухолевых сывороток.

Направленную экспрессионную библиотеку кДНК опухоли легких получали с использованием набора Stratagene c вектором на основе фага лямбда ZAP Express. Общую РНК для библиотеки брали из поздней перевитой плоскоклеточной аденокарциномы легких, растущей у мыши со SCID. ПолиА+РНК выделяли с использованием набора Message Maker (Gibco BRL). От двух мышей со SCID, которым имплантировали аденокарциномы легких, получали сыворотки. Данные сыворотки объединяли и вводили нормальным мышам для продукции антисыворотки против опухоли легких. Из неамплифицированной библиотеки подвергали скринингу примерно 700000 PFU посредством абсорбированной E. coli противоопухолевой сыворотки от мыши со SCID. С использованием вторичного антитела козы против мышиных IgG -A -М (H+L) с щелочной фосфатазой при развитии реакции с NBT/BCIP (Gibco BRL) идентифицировали позитивные бляшки. Фаг очищали и вырезали фагемид для 100 клонов с вставкой в вектор pBK-CMV для экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках.

Определенные 5'-последовательности кДНК для 33 из выделенных клонов представлены в SEQ ID NO: 149-181. Соответствующие предсказанные аминокислотные последовательности для SEQ ID NO:149, 150, 152-154, 156-158 и 160-181 представлены в SEQ ID NO: 182, 183, 186, 188-193 и 194-215, соответственно. Обнаружено, что клон с SEQ ID NO: 151 (обозначенный как SAL-25) содержал две открытые рамки считывания (ORF). Предсказанные аминокислотные последовательности, кодируемые данными ORF, описаны в SEQ ID NO: 184 и 185. Обнаружено, что клон с SEQ ID NO: 153 (обозначенный как SAL-50) содержал две открытые рамки считывания, кодирующие предсказанные аминокислотные последовательности с SEQ ID NO: 187 и 216. Сходным образом обнаружено, что клон с SEQ ID NO: 155 (обозначенный как SAL -66) содержал две открытые рамки считывания, кодирующие предсказанные аминокислотные последовательности с SEQ ID NO: 189 и 190. Сравнение данных последовательностей с таковыми в доступной базе данных не выявило значимой гомологии в отношении клонов с SEQ ID NO: 151, 153 и 154. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 149, 152, 156, 157 и 158 проявляют некоторую гомологию в отношении ранее выделенных меток экспрессирующихся последовательностей (EST). Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 150, 155 и 159 -181 проявляют гомологию в отношении последовательностей, ранее идентифицированных у людей.

С использованием вышеописанных процедур получали две направленных библиотеки кДНК (обозначенные как LT46-90 и LT86-21) из двух поздних перевитых плоскоклеточных карцином легких, росших у мышей со SCID, и подвергали скринингу сыворотками, полученными от мышей со SCID, которым имплантировали плоскоклеточные карциномы легких человека. Определенные последовательности кДНК для изолированных клонов представлены в SEQ ID NO: 217-237 и 286-289. Обнаружено, что SEQ ID NO: 286 является самой длинной последовательностью в LT4690-71 (SEQ ID NO: 237). Сравнение данных последовательностей с таковыми в доступной базе данных не выявило известной гомологии в отношении последовательностей SEQ ID NO: 219, 220, 225, 226, 287 и 288. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 218, 221, 222 и 224 проявляют некоторую гомологию в отношении ранее идентифицированных последовательностей с неизвестной функцией. Обнаружено, что последовательность SEQ ID NO: 236 проявляет гомологию в отношении последовательности известной мРНК. Последовательности SEQ ID NO: 217, 223, 227-237, 286 и 289 проявляли некоторую гомологию в отношении известных последовательностей ДНК и/или РНК человека.

В дальнейших исследованиях с использованием описанных выше способов одну из описанных выше библиотек кДНК (LT86-21) подвергали скринингу посредством абсорбированной E. coli-мышиной сыворотки против опухоли со SCID. Данную сыворотку получали от нормальных мышей, иммунизированных 3 объединенными сыворотками от мышей со SCID с имплантированными плоскоклеточными карциномами легких человека. Определенные последовательности кДНК для выделенных клонов представлены в SEQ ID NO: 238-285. Сравнение данных последовательностей с таковыми в доступных базах данных не выявило значимой гомологии в отношении клонов SEQ ID NO: 253, 260, 277 и 285. Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 249, 250, 256, 266, 276 и 282 проявляют некоторую гомологию в отношении ранее выделенных меток экспрессирующихся последовательностей (EST). Обнаружено, что последовательности SEQ ID NO: 238-248, 251, 252, 254, 255, 257-259, 261-263, 265, 267-275, 278-281, 283 и 284 проявляют некоторую гомологию в отношении ранее идентифицированных последовательностей ДНК или РНК человека.

Уровни экспрессии некоторых из выделенных антигенов в тканях опухоли легких по сравнению с уровнями экспрессии в нормальных тканях определяли посредством технологии микрополей. Результаты данных исследований показаны ниже в таблице 2 вместе с результатами анализа банка данных на предмет этих последовательностей.

Таблица 2КлонSEQ ID NOОписаниеLT+F/NSCC+M/NSqua/NAdeno/N2LT-3238Неизвестный (KIAA0712)2,23,83,3-2LT-6239Лактат-ДГ В2,33,84,1-2LT-22240Фумаратгидратаза-3,0--2LT-26242CG1-39--12,8-2LT-31243ADH7--8,42,22LT-36244ADH7-2,42,0-2LT-42245HMG-CoA-синтаза2,22,62,2-2LT-54247(Mus) нинеин-2,1--2LT-55248Убиквитин2,2-2,52,02LT-57249Новый2,12,92,4-2LT-58250Новый2,34,02,9-2LT-59251Неизвестный KIAA07842,43,02,32,02LT-60252Nuc Pore Cmplx- асс. белок TPR---2,12LT-70256Неизвестный KIAA0871-2,52,22,12LT-73257Mus, полиаденилат-связывающий-2,0--2LT-76259Транс-Гольджи p2302,1-2,6-2LT-85263Рибосомальный белок (LS29)---2,12LT-89265Неизвестный PAC212G6-2,0--2LT-98268Белок, асс. с дифф. меланомы 9---2,2

2LT-100269Mus, коллаген- альфа VI---2,12LT-105271Антиген NY-CO-7-3,2--2LT-108273Неизвестный RG363M04-3,1--2LT-124279Галектин-9 (секретируемый)2,32,72,0-2LT-126280L1-элемент L1.33 p402,5-3,1-2LT-128282Новый (каппа В -ras 2) 2,3+-20,42,52LT-133284Спектрин-альфа II -2,3--LT+F/N = Опухоль легких плюс фетальная ткань по отношению к нормальным тканям
SCC+M/N = Мелкоклеточная карциномы легких плюс метастазирующая по отношению к нормальным тканям
Squa/N = Плоскоклеточная опухоль легких по отношению к нормальным тканям
Aden/N = Аденокарцинома по отношению к нормальным тканям

Результатом исследований по определению полноразмерной последовательности антигена 2LT-128 (SEQ ID NO: 282) было выделение полноразмерной последовательности кДНК, представленной в SEQ ID NO: 392. Данная аминокислотная последовательность, кодируемая данной полноразмерной последовательностью кДНК представлена в SEQ ID NO: 393. Данный антиген характеризуется 20-кратным повышением экспрессии при плоскоклеточной карциноме и 2,5-кратным повышением экспрессии при аденокарциноме легких. Данный ген был описан как потенциальный ras-онкоген (Fenwick et al. Science, 287:869-873, 2000).

Расширенная информация по последовательности была получена для клонов 2LT-3 (SEQ ID NO: 238), 2LT-26 (SEQ ID NO: 242), 2LT-57 (SEQ ID NO: 249), 2LT-58 (SEQ ID NO: 250), 2LT-98 (SEQ ID NO: 268) и 2LT-124 (SEQ ID NO: 279). Расширенные последовательности кДНК для данных клонов приведены в SEQ ID NO: 428-433, соответственно, и кодируют полипептидные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 434-439, соответственно.

Пример 5

Определение тканевой специфичности полипептидов опухоли легких

С использованием геноспецифических праймеров оценивали уровни экспрессии мРНК для репрезентативных полипептидов опухоли легких в различных нормальных и опухолевых тканях посредством RT-PCR.

В кратком изложении, из различных нормальных и опухолевых тканей экстрагировали общую РНК с использованием реагента Trizol. Синтез первой цепи проводили с использованием 2 мкг общей РНК с обратной транскриптазой SuperScript II (BRL Life Technologies) при 42°C в течение одного часа. Затем кДНК амплифицировали путем PCR с геноспецифическими праймерами. Чтобы быть уверенными в полуколичественном характере RT-PCR, в качестве внутреннего контроля применяли β-актин в каждой из оцениваемых тканей. 1 мкл разведенного 1:30 раствора кДНК применяли для запуска линейной области амплификации β-актиновой матрицы, и это было достаточно чувствительным для отражения различий в изначальном количестве копий. Используя данные условия, определяли уровень β-актина для реакции обратной трнскрипции из каждой ткани. Контаминацию ДНК сводили к минимуму обработкой ДНКазой и за счет подтверждения отрицательного результата PCR при использовании первой цепи кДНК, которую получали без добавления обратной транскриптазы.

Уровни экспрессии мРНК оценивали в пяти различных типах опухолевой ткани (плоскоклеточная опухоль легких от 3 пациентов, аденокарцинома легких, опухоль предстательной железы, опухоль толстого кишечника и опухоль легких) в различных нормальных тканях, включая легкое от четырех пациентов, предстательную железу, головной мозг, почку, печень, яичник, скелетную мышцу, кожу, тонкий кишечник, миокард, сетчатку и яички. Обнаружено, что L86S-46 экспрессировался на высоком уровне в плоскоклеточной опухоли легких, опухоли толстого кишечника и опухоли предстательной железы, и не подлежал детекции в других оцениваемых тканях. Обнаружено, что L86S-5 экспрессировался в образцах опухоли легких и в 2 из 4 образцов нормального легкого, но не в других тестируемых нормальных или опухолевых тканях. Обнаружено, что L86S-16 экспрессировался во всех тканях, кроме тканей нормальной печени и нормального желудка. С использованием PCR в реальном времени было обнаружено, что L86S-46 избыточно экспрессировался в плоскоклеточной ткани легких и нормальной ткани миндалин, причем его экспрессия во всех других оцениваемых тканях была на низком уровне или не выявлялась.

Пример 6

Выделение последовательностей ДНК, кодирующих антигены опухоли легких

Последовательности ДНК, кодирующие антигены, потенциально участвующие в образовании плоскоклеточной опухоли легких, выделяли следующим образом.

Направленную экспрессионную библиотеку кДНК опухоли легких конструировали с использованием экспрессирующей системы на основе фага лямбда ZAP Express (Stratagene, La Jolla, CA). Общую РНК для библиотеки брали из двух объединенных плоскоклеточных эпителиальных опухолей легких человека, и полиА+РНК выделяли с использованием олиго-dT-целлюлозы (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Случайным образом извлекали фагемид и определяли последовательности кДНК выделенных клонов.

Определенная последовательность кДНК для клона SLT-Tl представлена в SEQ ID NO: 102, с определенными 5'-последовательностями кДНК для клонов SLT-T2, SLT-T3, SLT-T5, SLT-T7, SLT-T9, S-LT-T10, SLT-T11 и SLT-T12, представленных в SEQ ID NO: 103-110, соответственно. Соответствующие предсказанные аминокислотные последовательности для SLT-T1, SLT-T2, SLT-T3, SLT-T10 и SLT -T12 представлены в SEQ ID NO: 111-115, соответственно. Сравнение последовательностей SLT-T2, SLT-T3, SLT-T5, SLT-T7, SLT-T9 и SLT-T11 с таковыми в доступных базах данных, как описано выше, не выявило значимой гомологии. Обнаружено, что последовательности SLT-T10 и SLT-T12 проявляют некоторую гомологию в отношении последовательностей, ранее идентифицированных у людей.

Определено, что последовательность SLT-T1 проявляет некоторую гомологию в отношении клона PAC с неизвестной функцией белка. Обнаружено, что последовательность кДНК SLT -T1 (SEQ ID NO: 102) содержит мутаторный домен (MUTT). Известно, что такие домены функционируют при удалении поврежденного гуанина с ДНК, что может привести к перестановке А вместо G (см., например, el-Deiry, W. S., 1997, Curr. Opin. Oncol. 9:79-87; Okamoto, K. et al., 1996 Int. J. Cancer 65:437-41; Wu, C. et al., 1995 Biochem. Biophys. Res. Commun. 214:1239-45; Porter, D. W. et al., 1996 Chem. Res. Toxicol. 9:1375-81). Таким образом, SLT-T1 может использоваться при лечении посредством генной терапии раков легких, вызванных или ассоциированных с нарушением репарации ДНК.

В дальнейших исследованиях последовательности ДНК, кодирующие антигены, потенциально участвующие в образовании аденокарциномы легких, выделяли следующим образом. Направленная экспрессионная библиотека кДНК опухоли легких человека была сконструирована с использованием экспрессирующей системы на основе фага лямбда ZAP Express (Stratagene, La Jolla, CA). Общую РНК для библиотеки брали из поздней человеческой аденокарциномы, которую перевивали мыши со SCID, и выделяли полиА+РНК с использованием набора Message Maker (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Случайным образом извлекали фагемид, и определяли последовательности кДНК выделенных клонов.

Определенные 5'-последовательности кДНК для пяти выделенных клонов (обозначенных как SALT-T3, SALT-T4, SAL-T7, SALT-T8 и SALT-T9) представлены в SEQ ID NO: 116-120, с соответствующими предсказанными аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 121-125. Обнаружено, что SALT-T3 проявляет 98%-ную идентичность в отношении идентифицированного ранее человеческого трансдуцин-подобного белка-энхансера TLE2. SALT-T4 оказался человеческим гомологом мышиного гена H-бета 58. Обнаружено, что SALT-T7 обладал 97%-ной идентичностью в отношении к человеческ-меркаптопируватсульфуртрансферазой, и обнаружено, что SALT-T8 проявляет гомологию в отношении человеческого индуцируемого интерфероном белка 1-8U. SALT-T9 проявляет примерно 90%-ную идентичность в отношении человеческого муцина MUC 5B.

Последовательности кДНК, кодирующие антигены, потенциально участвующие в образовании мелкоклеточной карциномы легких, выделяли следующим образом. Экспрессионные библиотеки кДНК конструировали на основе мРНК из клеточных линий мелкоклеточной карциномы легких NCIH69, NCIH128 и DMS79 (все доступны из American Type Culture Collection, Manassas, VA) с использованием экспрессирующей системы на основе фага лямбда ZAP Express (Stratagene, La Jolla, CA). Случайным образом извлекали фагемид и определяли последовательности кДНК 27 выделенных клонов. Сравнение определенных последовательностей кДНК не выявило значимой гомологии в отношении последовательностей SEQ ID NO: 372 и 373. Последовательности SEQ ID NO: 364, 369, 377, 379 и 386 проявляли некоторую гомологию в отношении ранее выделенных EST. Последовательности остальных 20 клонов проявляли некоторую гомологию в отношении ранее идентифицированных генов. Последовательности кДНК данных клонов представлены в SEQ ID NO: 363, 365-368, 370, 371, 374-376, 378, 380-385 и 387-389, где SEQ ID NO: 363, 366-368, 370, 375, 376, 378, 380-382, 384 и 385 представляют собой полноразмерные последовательности.

Сравнение последовательности кДНК SEQ ID NO: 372 указывает на то, что данный клон (обозначенный как 128T1) является новым членом семейства предполагаемых трансмембранных белков, семь раз пронизывающих мембрану. Конкретнее, с использованием компьютерного алгоритма PSORT, предсказали, что данный белок представляет собой семь раз пронизывающий мембрану трансмембранный белок типа IIIA. В базе данных Genbank идентифицировали геномный клон, который содержит предсказанные 58 N-концевых аминокислот, потерянных в аминокислотной последовательности, кодируемой SEQ ID NO: 372. Определенная полноразмерная последовательность кДНК для клона 128T1 представлена в SEQ ID NO: 390, с соответствующей предсказанной аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 391.

Уровни экспрессии некоторых из выделенных антигенов в тканях опухоли легких по сравнению с уровнями экспрессии в нормальных тканях определяли посредством технологии микрополей. Результаты данных исследований показаны ниже в таблице 3 вместе с результатами анализа банка данных на предмет этих последовательностей.

Таблица 3КлонSEQ ID NOОписаниеLT+F/NSCC+M/NSqua/NAdeno/NDMS79-T1363STAT-индуц. ингиб. цитокина-2,0--DMS79-T6367Имеющий отношение к нейронной клеточной гибели-2,2--DMS79-T9369Новый-2,2--DMS79-T10370Белок-носитель убиквитина-3,92,2-DMS79-T11371HPV16E1-связывающий белок-2,1--128-T9378Фактор элонгации 1 -альфа-2,7--128-T11380Малатдегидрогеназа-2,32,0-128-T12381Апуриновая/апирим. эндонуклеаза-5,4--NCIH69-T3382Sm-подобный белок CaSm--2,4-NCIH69-T6384Фактор транскрипции BTF3a-2,5--LT + F/N = Опухоль легких плюс фетальная ткань по отношению к нормальным тканям
SCC + M/N = Мелкоклеточная карциномы легких плюс метастазирующая по отношению к нормальным тканям
Squa/N = Плоскоклеточная опухоль легких по отношению к нормальным тканям
Aden/N = Аденокарцинома по отношению к нормальным тканям

Пример 7

Синтез полипептидов

Полипептиды могут быть синтезированы на пептидном синтезаторе Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A с использованием FMOC-химии с активацией HPTU (О-бензотриазол-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфат). Последовательность Gly-Cys-Gly может привязываться на N-конце для обеспечения способа конъюгации, связывания на иммобилизованную поверхность или мечения пептида. Отщепление пептида от твердой основы может осуществляться с использованием следующей смеси расщепления: трифторуксусная кислота: этандитиол:тиоанизол:вода:фенол (40:1:2:2:3). После отщепления в течение 2 часов пептиды могут осаждаться холодным метил-трет-бутиловым простым эфиром. Осадки пептидов затем могут быть растворены в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) и лиофилизованы перед очисткой путем ВЭЖХ на обращенной фазе C18. Для элюции пептидов может применяться градиент 0%-60% ацетонитрила (содержащего 0,1% ТФУ) в воде (содержащей 0,1% ТФУ). После лиофилизации чистых фракций пептиды могут быть охарактеризованы с использованием электроспрея или других типов масс-спектрометрии и путем аминокислотного анализа.

Пример 8

Выделение и характеристика последовательностей ДНК, кодирующих антигены опухоли легких, путем экспрессионного клонирования Т-клеток

Антигены опухоли легких также можно идентифицировать путем экспрессионного клонирования Т-клеток. Одним из источников опухолеспецифических Т-клеток является их выделение из удаленных хирургическим путем опухолей пациентов.

Немелкоклеточную карциному легких измельчали и подвергали ферментативной обработке в течение нескольких часов для высвобождения опухолевых клеток и инфильтрирующих лимфоцитов (инфильтрирующие опухоль Т-лимфоциты, или TIL). Клетки отмывали буфером HBSS и пропускали через непрерывный градиент Ficoll (100%/75%/HBSS) для отделения опухолевых клеток и лимфоцитов от нежизнеспособных клеток. С поверхностей раздела отбирали две полосы; верхняя полоса на поверхности раздела 75%/HBSS преимущественно содержала опухолевые клетки, в то время как нижняя полоса на поверхности раздела 100%/75%/HBSS содержала большую часть лимфоцитов. TIL размножали в культуре или в 24-луночных планшетах с культуральной средой, дополненной 10 нг/мл IL-7 и 100 ед./мл IL-2, или, альтернативно, в 24-луночных планшетах, которые предварительно были покрыты моноклональным антителом против CD3 OKT3. Полученные в результате культуры TIL анализировали посредством FACS для подтверждения того, что большую процентную долю составляют CD8⁺-T-клетки (>90% от выбранной популяции) при наличии лишь малой процентной доли CD4⁺-клеток.

Кроме того, клетки немелкоклеточной карциномы легких размножали в культуре с использованием стандартных способов для выведения линии опухолевых клеток (обозначенной как LT391-06), причем позднее при помощи иммуногистохимического анализа подтверждали, что она является клеточной линией карциномы легких. Данную опухолевую клеточную линию подвергали трансдукции ретровирусным вектором для экспрессии человеческого CD80, и характеризовали путем FACS-анализа для подтверждения высокого уровня экспрессии CD80, молекул MHC I класса и МНС II класса.

Способность линий TIL специфично распознавать аутологичную опухоль легких демонстрировали путем анализа высвобождения цитокинов (IFN-γ и TNF-α), а также путем анализа высвобождения ⁵¹Cr. В кратком изложении, TIL-клетки от 21-суточных культур культивировали совместно с аутологичными и аллогенными опухолевыми клетками, EBV-иммортализованными LCL или контрольными клеточными линиями Daudi и K562, и подвергали культуральный супернатант мониторингу путем ELISA на предмет наличия цитокинов. TIL специфично распознавали аутологичную опухоль, но не аллогенную опухоль. Кроме того, не происходило распознавание EBV-иммортализованных LCL или контрольных клеточных линий, и это означает, что линии TIL являются опухолеспецифическими и потенциально распознают опухолевые антигены, представленные аутологичными молекулами MHC.

Охарактеризованные опухолеспецифические линии TIL размножали до подходящих количеств для экспрессионного клонирования Т-клеток с использованием растворимого антитела против CD3 в культуре с иррадиированными EBV-трансформированными LCL и клетками-кормилицами PBL в присутствии 20 ед./мл IL 2. Клоны из экспансированных линий TIL генерировали стандартными способами лимитирующего разведения. Конкретнее, TIL-клетки высевали по 0,5 клеток/лунку в 96-луночный планшет с U-образным дном и стимулировали аутологичными опухолевыми клетками с трансдуцированным CD-80, EBV-трансформированными LCL и клетками-кормилицами PBL в присутствии 50 ед/мл IL-2. Специфичность данных клонов для аутологичной опухоли подтверждали биоанализами ⁵¹Cr-микроцитотоксичности и IFN-γ.

В экспериментах с блокированием антителом было продемонстрировано, что данные клоны CTL являлись рестрицированными HLA-B/C. Репрезентативный клон CTL тестировали на панели аллогенных карцином легких, и он распознавал аутологичную опухоль и плоскоклеточную карциному легких (936Т). Поскольку единственным общим МНС I класса для данных опухолей являлся HLA-Cw1203, это означало, что он был рестрикционным элементом, используемым CTL. Этот результат подтверждали распознаванием CTL некоторого количества аллогенных карцином легких, трансдуцированных ретровирусным вектором, кодирующим HLA-Cw1203.

ПолиА мРНК получали из клеточной линии опухоли легких, обозначенной как LT391-06, с использованием Message Maker (Life Technologies; Rockville, MD). Последующие стадии, включая синтез кДНК, проводили согласно руководству по клонированию Life Technologies (SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning). Модификации протокола осуществляли следующим образом. На стадии добавления адаптера были применены EcoRI-адаптеры (New England Biolabs; Beverly, MA). Фракционированные по размеру кДНК лигировали систему экспрессирующего вектора HisMax A, B, C (Invitrogen; Carlsbad, CA) для оптимизации экспрессии белка во всех трех кодирующих рамках. Затем плазмиды библиотеки разделяли на аликвоты, равные приблизительно 100 CFU/лунку, в 96-луночном блоке для жидкостной амплификации в течение ночи. Получали резерв данных культур в глицерине и объединенную плазмиду получали посредством автоматического робота and pooled plasmid was (Qiagen; Valencia, CA). Концентрацию плазмидной ДНК в каждой лунке планшетов библиотеки, как было определено, составляла примерно 150 нг/мкл. Первоначальную характеристику экспрессионной библиотеки кДНК проводили путем случайного определения последовательности 24 первичных трансформантов, и подвергали полученные в результате последовательности поискам BLAST в доступных базах данных. Определенные последовательности кДНК представлены в SEQ ID NO: 443-480, с результатами поисков BLAST, представленных в таблице 4.

Таблица 4КлонSEQ ID NO:Ивентарный номер в GenBankОписание55163 458, 459  Новое поступление в GenBank 55158 452  Новое поступление в GenBankКлонSEQ ID NO:Ивентарный номер в GenBankОписаниеГомология в отношении известных последовательностей с неизвестной функцией55153 443, 444 7018516 мРНК H. sapiens; кДНК DKFZp434M03555154 445, 446 6437562 H. sapiens, хром. 22q11, клон РАС p39355157 450, 451 2887408 мРНК H. sapiens KIAA041755165 462, 463 3970871 мРНК H. sapiens HRIHFB2122 Гомология в отношении известных последовательностей с известной функцией55155 447 7677405 Белок F-бокса H. sapiens (FBS) 55156 448, 449 3929584 Псевдоген H. sapiens EEN55161 454, 455 4503350 ДНК (цитозин-5-)-метилтрансфераза 1 (DNMT1) H. sapiens55162 456, 457 31220 мРНК ERK1 для серин-треониновой протеинкиназы 55164 460, 461 6677666РНК-связывающий белок (аутоантигенный) H. sapiens (RALY)55166 464, 465 3249540 Субъединица р40 белка-рибонуклеазы H. sapiens (RPP40) 55167 466, 467 7657497 Антиген опухоли почек (RAGE) H. sapiens 55168 468, 469 2873376 мРНК экспортина t H. sapiens55169 470, 471 3135472 мРНК 2^ого белка, подобного Cre-связывающему белку, H. sapiens 55171 474 4759151 Сперминсинтаза H. sapiens (SMS)55173 476 6688148 Часть мРНК белка NICE-3 H. sapiens 55174 477, 478 531394 Коактиватор транскрипции человека РС4

КлонSEQ ID NO:Ивентарный номер в GenBankОписание55175 479 6563201 Дельта-субъединица фактора инициации трансляции eIF-2b H. sapiens55176 480 29860 Ген hCENP-B, аутогена центромер В (CENP-B) Гомология в отношении рибосомального белка55159 453 337494 мРНК большой субъединицы рибосомального белка L7a (surf 3)55170 472, 473 4506648 мРНК рибосомального белка L3 H.sapiens55172475388031Рибосомальный белок L11 H. sapiens

Для скрининга T-клеток смешивали примерно 80 нг ДНК плазмид библиотеки и 80 нг ДНК плазмиды HLA-Cw1203 с липидным препаратом Fugene согласно инструкциям производителя, и трансфицировали смесью клетки COS-7 в двух параллелях. После инкубации при 37°C в течение 48 часов смесь трансфекции отбирали и в каждую лунку добавляли 10000 CTL LT391-06 в свежей среде, содержащей человеческую сыворотку.

Способность Т-клеток распознавать антиген в библиотеке оценивали по высвобождению цитокинов через 6 часа (TNF-альфа, биоанализ WEHI) или через 24 часа (IFN-гамма, ELISA). Примерно 2,0×10⁵ клонов (в пулах по 100 плазмид) подвергали скринингу с использованием данной системы в клетках COS-7. Идентифицировали три плазмидных пула (обозначенные как 14F10, 19A4 и 20E10), которые распознавались CTL LT391-06. Трансфекция данными пулами плазмид клеток COS-7 привела к продукции CTL LT391-06 как IFN-гамма, так и TNF-альфа в концентрациях, значимо превышающих фон. Пулы 14F10, 19A4 и 20E10 были "разбиты" на несколько сотен индивидуальных плазмидных ДНК, и их снова тестировали. Последовательности 24 новых клонов, выделенных из пула 14F10 представлены в SEQ ID NO: 481-511.

Одна плазмида (3D9) из пула 14F10, одна плазмида из пула 20E10 и 5 плазмид (2A6, 2E11, 2F12, 3F4, 3H8) из пула 19A4 были способны воспроизводить распознавание T-клетками. Определение последовательности данных плазмид привело к идентификации вставки кДНК длиной 7,8 тыс. н.п. (обозначенной как клон 14F10), вставки кДНК длиной 2,2 тыс.н.п. (обозначенной как l9A4; SEQ ID NO: 440) и клона, обозначенного как 20E10. Полноразмерная последовательность кДНК для 14F10 представлена в SEQ ID NO: 441. Клон 14F10 не содержал первых двух нуклеотидов "G", обнаруженных с 5'-конца 19A4, и 3'-концевые 24 н.п. 19A4 отличались от соответствующей области 14F10 (нуклеотиды 2145-2165). Более того, для клона 14F10 были выделены дополнительные 3837 н.п. 3'-концевой последовательности. 5' концевая последовательность кДНК (337 н.п.) клона 20E10 представлена в SEQ ID NO: 442. 20E10 содержит дополнительные 3 нуклеотида (по сравнению с 19A4) на самом 5'-конце. Дополнительная последовательность с 5'-конца клона 20E10 содержит "ATG" и поэтому оказывается содержащей участок старта трансляции новой открытой рамки считывания. При анализе поиска BLAST в базах данных GenBank данные последовательности были идентифицированы как обладающие значимой гомологией в отношении укороченного гена транспортера цистина/глутаминовой кислоты человека. Однако, в отличие от опубликованной последовательности, клоны 14F10 и l9A4 содержали уникальный 5'-конец, состоящий из 181 нуклеотида. Данная новая последовательность замещала опубликованную 5'-область и имела следствием смещение описанного инициирующего метионина (старт-кодон) и появление двух дополнительных аминокислотных остатков по сравнению с описанным белком-транспортером. Поэтому транслируемый продукт клонов 14F10 и 19A4 отличается от белка-транспортера цистина/глутаминовой кислоты. Более того, распознавание Т-клетками других опухолей легких демонстрирует, что данный антиген также экспрессируется в других опухолях.

Эпитоп и аминокислотную последовательность, кодируемую в клонах 19A4 и 14F10, которая воспроизводит распознавание T-клетками анти-LT391-06-клеток, картировали следующим образом. Клетки Cos-7 трансфицировали 80 нг/лунку HLA-Cw1203 вместе с титруемыми количествами кДНК, кодирующей клон 19A4, потенциальную открытую рамку считывания, находящуюся в уникальном 5'-конце 19A4, или открытую рамку считывания гена транспортера цистина/глутаминовой кислоты (Cys-Glu) клонировали в эукариотический экспрессирующий вектор, и тестировали на предмет стимуляции анти-LT391-06-T-клеток в анализе TNF. В качестве положительного контроля клетки Cos-7 совместно трансфицировали HLA-Cwl203 и описанным выше позитивным плазмидным клоном 19A4. Экспрессирующую Cys-Glu-транспортер конструкцию выделяли путем PCR с использованием 5'- и 3'-праймеров, специфичных для известных ORF транспортера, с 19A4 в качестве матрицы. Кроме того, каждый 5'-праймер содержал участок инициации трансляции Козака (Kozak) и стартовый метионин для проведения трансляции полипептида. CTL против LT391-06 не распознавали трансфектантов, экспрессирующих конструкцию Cys-Glu-транспортера, но распознавали трансфектантов, экспрессирующих 19A4 5'-ORF из 19A4.

В последующих экспериментах клетки Cos-7 совместно трансфицировали 80 нг/лунку HLA-Cw1203 вместе с титруемыми количествами ДНК транспозиционных мутантов F10 и C12, соответсвенно, и тестировали на предмет стимуляции анти-LT391-06-T-клеток в анализе TNF. В качестве положительного контроля клетки Cos-7 совместно трансфицировали HLA-Cwl203 и клонами с 5'-ORF 19A4. Транспозиционные мутанты F10 и C12 были получены путем транспозон-опосредованной мутации клона 14F10 и скрининга участков вставки посредством анализа последовательности. Транспозон мутанта F10 был вставлен примерно в 304 н.п. от 5'-концевого участка клонирования EcoRI кДНК 14F10. Данная мутация не отменяла трансляцию T-клеточного эпитопа. Наоборот, обнаружено, что транспозон C12, который был вставлен примерно в 116 н.п. от 5'-концевого участка клонирования EcoRI кДНК 14F10, прерывал трансляцию T-клеточного эпитопа. Таким образом, эпитоп в 14F10 картируется между данных двух участков вставки транспозона. Аминокислотная последовательность области между участками вставки транспозонов C12 и F10 представлена в SEQ ID NO: 586.

Получена серия из 11 перекрывающихся 16-членных и 15 -членных пептидов для области, представленной в SEQ ID NO: 586, и их тестировали на предмет стимуляции анти-LT391-06-клеток, которую определяли по высвобождению цитокинов в анализах TNF IFN-γ. Единственный пептид, представленный в SEQ ID NO: 587 (соответствующей остаткам 5-20 из SEQ ID NO: 586), стимулировал высвобождение цитокина. Данные исследования демонстрируют, что рестрицированный HLA-Cw1203 антиген содержится в SEQ ID NO: 587.

Пример 9

Выделение и характеристика последовательностей ДНК, кодирующих антигены опухоли легких, путем вычитающей PCR

В данном примере описаны выделение и характеристика клонов кДНК экспрессионной библиотеки, полученной путем вычитающей PCR из клеточной линии опухоли легких человека LT391-06, описанной выше.

Испытующую (tester) полиА-мРНК получали из клеточной линии LT391-06, как описано выше. Направляющую (driver) полиА-мРНК выделяли из Т-лимфоцитарной клеточной линии острого Т-клеточного лейкоза человека (Jurkat), которая не имеет легочного происхождения и не распознается LT391-06-реактивными Т-клетками. Вычитание проводили по способу Clontech (Palo Alto, CA) со следующими изменениями: 1) проводили реакцию второго рестрикционного расщепления кДНК с использованием объединенных ферментов (MscI, PvuII, StuI и DraI). Это было дополнением и отличием от расщепления одним рестрикционным ферментом RsaI, рекомендуемым Clontech. Каждый набор для рестрикционного расщепления обрабатывали в качестве отдельной библиотеки, чтобы убедиться в том, что окончательная смешанная библиоткека содержит перекрывающиеся фрагменты. Таким образом, эпитоп, распознаваемый T клетками, должен быть представлен на фрагменте в составе библиотеки и не должен разрушаться за счет присутствия в нем сайта единственной рестриктазы. 2) Отношение направляющей и испытующей кДНК повышали на стадии гибридизации для увеличения жесткости вычитания. Для анализа эффективности вычитания в разведениях вычтенных, а также невычтенных образцах PCR амплифицировали актин путем PCR. На второй стадии PCR задействовали праймеры, которые отличались от обычно применяемых. Три вложенных один в другой праймера PCR конструировали содержащими расщепляемый EcoRI сайт (не задействованный во время клонирования), который находился в одной из трех рамок. Таким образом, результатом второй амплификации с данными праймерами являлись продукты, которые могли быть лигированы непосредственно в эукариотическую экспрессирующую плазмиду pcDNA4His/Max-Topo (Invitrogen). Это приводило к образованию вычтенных за счет PCR и амплифицированных фрагментов, представленных в рамке где-то в составе библиотеки. Вследствие механизма вычитания только 50% фрагментов были в правильной ориентации. Сложность и избыточность библиотеки была охарактеризована путем определения последовательности 96 случайно выбранных клонов из конченой объединенной экспрессирующей библиотеки, полученной за счет вычитающей PCR, обозначенной как LT391-06PCR. Данные последовательности (SEQ ID NO: 512-581) анализировали путем сравнения с последовательностями в свободно доступных базах данных (таблица 5).

Таблица 5КлонSEQ ID NOИнвентарный номер в GenBankОписание57235532 Новое поступление в GenBank57255547 Новое поступление в GenBank57264554 Новое поступление в GenBankГомология в отношении известных последовательностей с неизвестной функцией572155185689540мРНК для белка KIAA1102 H. sapiens572235222341006Человеческая Xq13 3'-конец PAC92E23572275247022540кДНК FLJ10480 fis H. sapiens, клон NT2RP2000126572385356807795мРНК H. sapiens; кДНК DKFZp761 G02121572395365757546Клон H. sapiens DJ0823F17572435397023805кДНК FLJ11259 fis H. sapiens, клон PLACE1009045572455404884472мРНК H. sapiens; кДНК DKFZp586О2223572675576808218мРНК H. sapiens; кДНК DKFZp434О15195726855810040400Последовательность 12 из патента WО9954460572705607959775мРНК H. sapiens PRO1489 572715614500158мРНК H. sapiens; кДНК DKFZp586B0918КлонSEQ ID NOИнвентарный номер в GenBankОписание572815676560920Клон H. sapiens RP11-501O757283569285962Человеческая мРНК для гена KIAA0108 572855707019813кДНК H. sapiens FLJ20002 fis, клон ADKA01577Гомология в отношении известных последовательностей с известной функцией57207512517176мРНК H. sapiens YAP65 572105146841233мРНК H. sapiens HSPC292 572115152606093мРНК белка Cyr61 (CYR61) H. sapiens57212516339648мРНК человеческого тиоредоксина (TXN)572195194504616Белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP3) H. sapiens572215207274241Новый белок пигментных эпителиальных клеток сетчатки (NORPEG) H. sapiens57222521189564Человеческий ген ингибитора-1 активатора плазминогена 572285254757755Аннексин A2 (ANXA2) H. sapiens57230527180800Человеческий ген альфа-1-коллагена IV типа, экзон 52572325296729061Клон RPC11-98D12 из 7q31 H. sapiens57233530338391Спермидин/спермин-N1-ацетилтрансфераза572345317305302NCK-ассоциированный белок 1 (NCKAP1) H. sapiens572365334929722Белок CGI-127 H. sapiens

КлонSEQ ID NOИнвентарный номер в GenBankОписание572425384503558Эпителиальный мембранный белок 1 (EMP1) H. sapiens57248541183585.Человеческий специфичный для беременности бета-гликопротеин c 572505434759283Эстераза С-конца убиквитина L1 (UCHL1) H. sapiens572515441236321Человеческий ген гамма-2-цепи ламинина (LAMC2)57253545213831Изоформа 2 лизилгидроксилазы (PLOD2) H. sapiens57254546536897мРНК человеческого предшественника белка, родственного фоллистатину57257548339656Человеческий тромбомодулин клеток эндотелия57258549190467мРНК человеческого белка-приона (PrP) 57261551338031Человеческий ген серглицина57262552178430Человеческая альфоидная ДНК (последовательность альфоидных повторов)572655554502562Калпаин H. sapiens, большой полипептид L2 (CAPN2)57266556398163мРНК для белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста, H. sapiens572695597262375Карбоксилэстераза 2 (кишечная, печеночная) (CES2)57272562467560мРНК для цистиндиоксигеназы типа 1, H sapiens57274563482664Аннексин A3 (ANXA3) H. sapiens

КлонSEQ ID NOИнвентарный номер в GenBankОписание572755642281904Тирозинкиназа Брутона (BTK), альфа-D-галактозидаза A (GLA) H. sapiens572775654557498C-концевой связывающий белок 2 (CTBP2) H. sapiens57282568189245Человеческая мРНК NAD(P)H-менадионоксидоредуктазы5728757128525Человеческая мРНК для предшественника амилоида A4 болезни Альцгеймера572885724757755Аннексин A2 (ANXA2) H. sapiens572895735729841мРНК глиоксалазы I (GLO1) H. sapiens572905746103642мРНК белка F-бокса FBX3 H.sapiens57295576182513мРНК L-цепи человеческого ферритина 5729957937137Человеческая мРНК для тромбоспондина57301580179682Бета-цепь C4b-связывающего белка (клон A12)573025816042205Мембранная металлоэндопептидаза (нейтральная эндопептидаза, энкефалиназа, CALLA, CD10) (ММЕ) H. sapiens 572135172665791мРНК кавеолина-2 H. sapiens572595502665791мРНК кавеолина-2 H. sapiens57225523179765Ген человеческого кальциклина57229526179765Ген человеческого кальциклина57237534186962Ген В2-цепи человеческого ламинина

КлонSEQ ID NOИнвентарный номер в GenBankОписание57249542186962Ген В2-цепи человеческого ламинина572315284972626Ген кавеолина 1 (CAV1) H. sapiens572965774972626Ген кавеолина 1 (CAV1) H. sapiens572975784972626Ген кавеолина 1 (CAV1) H. sapiens57240537266237Белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста57292575184522Ген человеческого белка 3, связывающего инсулиноподобный фактор роста572635534504618Белок 7, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP7) H. sapiens572805664504618Белок 7, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP7) H. sapiensГомология в отношении рибосомальных белков57209513337504Человеческий рибосомальный белок S24 мРНК

Пример 10

Выделение и характеристика T-клеточных рецепторов из клона Т-клеток, специфичных в отношении антигена опухоли легких

В данном примере описано клонирование и определение последовательности альфа- и бета-цепей T-клеточного рецептора (TCR) из клона CD8-T-клеток, специфичных в отношении антигена, экспрессированного клеточной линией опухоли легких LT391-06. T-клетки обладают ограниченным сроком жизни. Клонирование цепей TCR и последующий перенос будут, по существу, приводить к распространению различных специфичностей T-клетки. Клонирование цепей TCR опухолевого антигена позволяет переносить специфичность в T-клетки, выделенные от пациентов, которые обладают MHC-рестрикцирующими аллелями TCR. Такие T-клетки могут затем подвергаться экспансии и применяться в способах адаптивного переноса для введения специфичности в отношении опухолевого антигена пациентам, имеющим опухоли, которые экспрессируют данный антиген (см., например, Clay et al. J Immunol. 163:507 (1999)).

Получали клоны цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), специфичных в отношении клеточной линии опухоли легких LT391-06. Общую мРНК из 2×10⁶ клеток из 15 таких клонов выделяли с использованием реагента Trizol и синтезировали кДНК с использованием наборов Ready-to-Go (Pharmacia). Для определения в данных клонах последовательностей Va и Vb синтезировали панель праймеров, специфичных к субтипам Va и Vb, и применяли их в реакциях RT-PCR с кДНК, полученной для каждого из клонов. Реакции RT-PCR демонстрировали, что каждый их клонов экспрессировал обычную последовательность Vb, которая соответствовала подсемейству Vb13. С использованием кДНК, полученной от каждого из клонов (обозначенной как 1105) экспрессированную последовательность Va определяли как Va22. Для клонирования полноразмерных альфа- и бета-цепей TCR из клона 1105 конструировали праймеры, перекрывающие нуклеотиды TCR, кодирующие инициатор и терминатор. Стандартные реакции RT-PCR с 35 циклами проводили с использованием кДНК, синтезированной из клона CTL, и праймеров, с PWO (BMB) в качестве термостабильной полимеразы. Полученные в результате специфичные полосы (примерно 850 н.п. для альфа-цепи и примерно 950 н.п. для бета-цепи) лигировали в PCR-вектор с тупыми концами (Invitrogen) и трансформировали в E. coli. Идентифицировали E. coli, трансформированные плазмидами, содержащими полноразмерные альфа- и бета-цепи, и получали препараты соответствующих плазмид в большом масштабе. Определяли последовательность плазмид, содержащих полноразмерные альфа- и бета-цепи TCR. Определенные последовательности кДНК для альфа- и бета-цепей представлены в SEQ ID NO: 583 и 582, соответственно, с соответствующими аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 584 и 585, соответственно.

Из следующего выше понятно, что, несмотря на то, что конкретные осуществления изобретения описаны здесь с иллюстративными целями, могут быть осуществлены различные модификации без отклонения от духа и объема изобретения. Следовательно, настоящее изобретение не ограничено ничем, кроме прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области медицины и касается композиций и способов для лечения и диагностики рака, в особенности, рака легких. Иллюстративные композиции включают один или несколько полипептидов опухоли легких, их иммуногенные части, полинуклеотиды, которые кодируют такие полипептиды, антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует такие полипептиды, и Т-клетки, специфичные в отношении клеток, экспрессирующих такие полипептиды. Описанные композиции могут использоваться, например, при диагностике, профилактике и/или лечении заболеваний, в особенности, рака легких. Преимущество изобретения заключается в повышении специфичности диагностики и лечения рака легких. 11 н.п. ф-лы, 5 табл.

1. Изолированный полинуклеотид, который применяется для диагностики или лечения рака легкого, содержащий последовательность, выбранную из группы, состоящей из

(a) последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 440, 441 и 442;

(b) последовательностей, комплементарных последовательностям, представленным в SEQ ID NO: 440, 441 и 442;

(c) последовательностей, которые гибридизуются с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 440, 441 и 442, в умеренно жестких условиях;

(d) последовательностей, обладающих, по меньшей мере, 90%-ной идентичностью в отношении последовательности SEQ ID NO: 440, 441 и 442; и

(e) вырожденных вариантов последовательности, представленной в SEQ ID NO: 440, 441 и 442.

(a) SEQ ID NO: 586 и 587;

(b) последовательностей, кодируемых полинуклеотидом по п.1; и

(c) последовательностей, обладающих, по меньшей мере, 90%-ной идентичностью в отношении последовательности, кодируемой полинуклеотидом по п.1.

(a) получения от пациента биологического образца;

(b) контактирования биологического образца со связывающим агентом, который связывает полипептид по п.2;

(c) определения в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и

(d) сравнения количества данного полипептида с предварительно определенным уровнем отсечения и определения отсюда наличия у пациента злокачественной опухоли.

(a) полипептидов по п.2;

(b) полинуклеотидов по п.1; и

(c) антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют полипептид по п.2,

в условиях и в течение времени, достаточных для осуществления стимуляции и/или экспансии Т-клеток.

(a) получения от пациента биологического образца;

(b) контактирования биологического образца с олигонуклеотидом по п.6;

(c) определения в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с данным олигонуклеотидом; и

(d) сравнения количества полинуклеотида, который гибридизуется с данным олигонуклеотидом, с предварительно определенным уровнем отсечения, и определения отсюда наличия у пациента злокачественной опухоли.

Приоритет по пунктам и признакам: