ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE ELTOR КМ 195-ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА II ТИПА, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 C12N1/21 A61K39/106 

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может найти применение в производстве холерных вакцин.

Известны штаммы, используемые для получения холерных вакцин, причем последние должны содержать, кроме антигенов холерного токсина I типа, образуемого холерными вибрионами классического биовара, антигены холерного токсина II типа, образуемого холерными вибрионами биовара эльтор [Potential use of oral cholera vaccine in emergency situations. Report of a WHO meeting. Geneva, Switzerland, 12-13 May, 1999].

Известны природные штаммы Vibrio cholerae eltor, используемые в производстве холерных вакцин. Они обладают типичными для холерных вибрионов свойствами и образуют необходимые для производства холерных вакцин антигены [Live oral vaccines against cholerae: an update. Levine M. M., Kaper G. В // Vaccine. - 1993. - V. 11.- Issue 2. - P. 207-212].

Однако природные штаммы эльтор образуют in vitro незначительное количество холерного токсина II типа (менее 0,1 мкг/мл) [Mekalanos J.J. Duplication and amplfication of toxin genes in Vibrio cholerae // Cell. - 1983. - V. 35. - P .253-263], ввиду чего их использование в промышленных условиях является малоэффективным. Применение специальных сред и условий культивирования позволяет лишь незначительно увеличить количество образуемого ими токсина (0,2 мкг/мл) [Differential expression of the tox R regulon in classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae is due to biotype-specific control over toxT expression. Dirita V.G. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - V. 93. - P. 7991-7995].

Наиболее близким к заявляемому штамму является штамм V. cholerae eltor серовара Огава КМ 1446/рСО 107-2, описанный в авторском свидетельстве СССР N 1412306 C 12 N 15/00. Этот штамм получен экспериментально и образует значительное количество холерного токсина II типа - 5 мкг/мл.

Однако он характеризуется недостаточной стабильностью продукции холерного токсина, что затрудняет технологию выращивания штамма.

Известны способы получения штаммов Vibrio cholerae eltor, продуцирующие холерный токсин II типа. Они основаны на выделении этих штаммов из природных источников (окружающая среда, больные люди) [Адамов А.К. Холерные вибрионы. - Изд - во Саратовского ун-та, 1984].

Однако описанные способы получения этих штаммов трудоемки и неэффективны, т. к. до сих пор не позволили получить штамм с высокой продукцией холерного токсина II типа.

Наиболее близким к заявляемому способу получения штамма - продуцента холерного токсина II типа по достигаемому результату является способ, описанный в авторском свидетельстве СССР N 1412306 C12N 15/00, который заключается в введении генетической информации, вызывающей повышение токсигенности, в клетки штамма Vibrio cholerae eltor методом конъюгационного переноса плазмиды рСО 107-2, содержащей клонированные гены холерного токсина. Он включает в себя следующие стадии:
1. Выращивание культуры Vibrio cholerae eltor до концентрации 10⁹ кл. /мл.

2. Введение генетической информации скрещиванием штамма Vibrio cholerae eltor со штаммом Е. coli, содержащим плазмиду рСО 107-2 с генами холерного токсина.

3. Отбор клеток Vibrio cholerae eltor, содержащего плазмиду рСО 107 - 2.

4. Выделение клеток штамма Vibrio cholerae eltor, содержащих плазмиду рСО 107-2 и продуцирующих холерный токсин II типа.

Применение этого способа позволяет получить продуцент со значительной продукцией холерного токсина (5 мкг/мл).

Недостаток данного способа заключается в том, что вводимые гены холерного токсина располагаются на внехромосомном репликоне - плазмиде, которая часто утрачивается клеткой, что ведет к снижению уровня образуемого штаммом токсина.

Задачей изобретения является конструирование высокоэффективного штамма - продуцента холерного токсина II типа, а также разработка способа, позволяющего получить штамм со стабильной и высокой продукцией холерного токсина II типа.

Сущность изобретения заключается в том, что полученный штамм Vibrio cholerae eltor - продуцент холерного токсина II типа.

Заявляемый штамм продуцирует 7 мкг/мл холерного токсина II типа в среду роста.

Штамм Vibrio cholerae eltor - продуцент холерного токсина II типа имеет типичные для холерных вибрионов биовара эльтор свойства [Бароян О.В. Холера Эль-Тор. - Москва, 1971]
Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" как Vibrio cholerae eltor KM 195.

Сущность заявляемого способа получения названного штаммма состоит в том, что в способе, включающем выращивание Vibrio cholerae eltor, передачу генетической информации, вызывающей повышение токсигенности, отбор и выделение клеток с повышенным содержанием продукции холерного токсина, введение в клетки Vibrio cholerae eltor генетической информации осуществляют инфицированием клеток Vibrio cholerae eltor умеренным холерным фагом 139 до получения лизогенных клеток, содержащих фаг в составе хромосомы, а при отборе клеток выбирают те клетки, у которых повышено содержание продукции холерного токсина.

Заявляемый способ включает стадии:
1. Выращивание культуры Vibrio cholerae eltor до концентрации 10⁹ кл. /мл.

2. Введение генетической информации инфицированием клеток штамма Vibrio cholerae eltor умеренным холерным фагом 139, заключающееся в адсорбции фага к бактериальной поверхности, проникновении его ДНК в клетку с последующей интеграцией в хромосому и образованием лизогенов.

3. Отбор клеток Vibrio cholerae eltor, лизогенных по фагу 139 и содержащих его в составе хромосомы.

4. Выделение среди них лизогенных клеток со значительной продукцией холерного токсина.

Подробное описание способа получения штамма Vibrio cholerae eltor - продуцента холерного токсина II типа приведено ниже.

Исходный штамм МАК 757 выращивают в течение трех часов при температуре 37^oC в условиях интенсивной аэрации до концентрации 10⁹ клеток в мл, смешивают с LB-агаром в отношении 1:25 и наслаивают на пластинку LB-агара. После застывания на него наносят каплю (0,05 мл) культуральной жидкости штамма Vibrio cholerae 0139 P16064, выращиваемого в течение восемнадцати часов при 37^oC и содержащего в среде роста фаг 139 в концентрации 10⁷ фаговых частиц/мл. Газон МАК 757 с нанесенным фагом культивируют при температуре 37^oC в течение 18 часов до появления лизогенных колоний. Затем из середины пятна лизиса отбирают колонии выросших лизогенов штамма МАК 757(139). Их двукратно рассевают на LB-агаре. Полученные в результате изолированные колонии исследуют на чувствительность к фагу 139 и на продукцию этого фага. Колонии МАК 757, устойчивые к повторному заражению фагами и продуцирующие его в среду роста, проверяют на способность образовывать токсин. С частотой один процент среди полученных лизогенов МАК 757(139) выделяют клетки, продуцирующие в 10-30 раз больше токсина по сравнению с исходным штаммом. Среди них отбирают клон, стабильно образующий значительное количество холерного токсина. Количество токсина определяется методом ELISA.

Метод ДНК-ДНК гибридизации показывает, что в составе его хромосомы присутствует последовательность ДНК фага 139.

Заявляемый способ позволяет получить штамм Vibrio cholerae eltor с высокой и стабильной продукцией холерного токсина II типа - 7 мкг/ мл.

Пример 1. Определение продукции холерного токсина II типа у штамма Vibrio cholerae eltor KM 195.

Для количественного определения холерного токсина используют иммуноферментный метод ELISA. В качестве контроля и для определения чувствительности метода используют очищенный препарат холерного токсина. Исходную культуру штамма КМ 195 выращивают в казаминовом бульоне (казаминовые кислоты - 30 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, pH 7,6) в течение 16-18 часов в условиях интенсивной аэрации. Клетки осаждают центрифугированием при 4000 g в течение 15 минут. В супернатанте определяют содержание холерного токсина. Пробы инкубируют в течение двух часов при 37^oC в лунках микроплат, предварительно заблокировав неспецифическую сорбцию инертным белком (бычий сывороточный альбумин). Инкубацию с кроличьей антитоксической противохолерной сывороткой, разведенной 1: 200, проводят в течение 1 ч при 37^oC. После промывания лунок 0,05 М фосфатным буфером pH 7,2-7,4 добавляют рабочее разведение иммуноферментных коньюгатов, которые представляют собой меченые пероксидазой козьи диагностические антитела против иммуноглобулинов кролика. Реакцию учитывают через 15 минут после добавления субстрата - 0,03% перекиси водорода в цитратном буфере pH 4,0 с 0,1% ABTS (2,2 azino-di-(3-thylbenzthiazoline sulphonate). Чувствительность метода ELISA составляет в данной серии опытов 1 нг/мл. Количество продуцируемого холерного токсина у исследуемого штамма КМ 195 рассчитывают в соответствии с установленной чувствительностью и подсчетом числа выросших микробных клеток. Штамм Vibrio cholerae eltor KM 195 продуцирует 7 мкг/мл холерного токсина II типа. Штамм КМ195 высокопродуктивен в отношении холерного токсина II типа.

Пример 2. Определение стабильности продукции штамма Vibrio cholerae eltor КМ195.

Штамм KM 195 рассевают до изолированных колоний, которые анализируют на продукцию холерного токсина способом, указанным в примере 1. Из 100 проверенных клеток у всех продукция холерного токсина составляет 7 мкг/мл, что подтверждает стабильность продукции токсина у штамма КМ 195.

Таким образом, штамм Vibrio cholerae eltor КМ195 является гиперпродуцентом холерного токсина II типа, а новый способ позволяет получать штамм со стабильной и высокой продукцией холерного токсина II типа. Штамм может быть успешно применен в производстве холерных вакцин, применяемых для профилактики холеры. Кроме того, он может быть использован для получения моноспецифической сыворотки к холерному токсину II типа, а также для проведения научных исследований по изучению вирулентности холерных вибрионов.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии и может быть использовано в производстве холерных вакцин. Данное изобретение касается штамма бактерий Vibrio cholerae eltor KM 195 и способа получения этого штамма. Способ включает стадии: выращивание культуры Vibrio cholerae eltor до концентрации 10⁹ кл./мл, введение генетической информации инфицированием клеток штамма Vibrio cholerae eltor умеренным холерным фагом 139 до получения лизогенных клеток, отбор клеток Vibrio cholerae eltor, лизогенных по фагу 139 и содержащих его в составе хромосомы, выделение лизогенных клеток со значительной продукцией холерного токсина. Способ позволяет получить штамм Vibrio cholerae eltor с высокой и стабильной продукцией холерного токсина II типа - 7 мкг/мл. 2 с.з.п.ф-лы.

1. Штамм бактерий Vibrio cholerae eltor KM 195 - продуцент холерного токсина II типа. 2. Способ получения штамма Vibrio cholerae eltor KM 195 - продуцента холерного токсина II типа, включающий выращивание культуры, передачу генетической информации, вызывающей повышение токсигенности, инкубирование, отбор и выделение продуцентов, отличающийся тем, что введение генетической информации осуществляют инфицированием клеток Vibrio cholerae eltor умеренным холерным фагом 139 до получения лизогенных клеток, содержащих фаг в составе хромосомы, а в процессе отбора отбирают клетки с повышенной продукцией холерного токсина II типа.