(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
1
Изобретение относится к аналитической биохимии и может быть использовано в научно-исследовательской работе, пищевой и микробиологической промышленностях, бродильном производстве, клинических исследованиях.
Известен способ определения глюкозы путем внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор, глюкозооксидазу, пероксидазу и индикаторный субстрат - о-толуидин с последующим измерением плотности полученного раствора 1.
Недостатком способа является его сложность, связанная с необходимостью введения двух ферментов, глюкозооксидазы и пероксидазы, что приводит к ограничению возможности использования способа.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ определения глюкозы путем введения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор с рН 4-5, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат - 2,6-дихлорфенолиндофенол с последующим измерением оптической плотности полученного раствора 2.
Недостатком способа является его невысокая чувствительность (б-Ю М) и точность (ошибка составляет 20%).
Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа.
Поставленная цель достигается тем, что в способе определения глюкозы путем внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержащую буферный раствор, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат с последующим измерением оптической плотности полученного раствора, в качестве индикаторного субстрата используют N,N,N, N- тетраметил-п-фенилендиамин и процесс ведут при рН 7,3-8.
Ион-радикальная соль N,N,N, N - тетра15 метил-п-фенилендиамина имеет ярко-синее окрашивание (А. макс 606 нм), исчезающее при восстановлении, характеризуется высоким коэффициентом молярного погашения ( 1, СМ ), стабилен в течение длительного времени при рН 4,6.
Пример}. При проведении измерений в спектрофотометрическую кювету вносят 2,2 мл Na-фосфатного буферного раствора (рН 7,7; 0.2М), 0,3 мл рабочего раствора ион-радикальной соли N,N, N, N-тетраметил-n-фенилендиамина (0,164 мг/мл, рН 4,6), 0,1 мл раствора глюкозооксидазы (2 мг/мл). После проведения измерения начальной оптической плотности при 606 им реакцию инициируют добавлением в раствор 50 мкл исследуемого раствора глюкозы. После завершения реакции (5 мин) регистрируют полное изменение оптической плотности. Концентрацию глюкозы рассчитывают из калибровочного графика зависимости изменения оптической плотности от концентрации глюкозы. Результаты анализа приведены -в табл. 1.
Таблица 1 Разбавление в кювете в 53,раза. Пример 2. При проведении измерений в спектрофотометрическую кювету вносят 2,2 мл Na-фосфатного буферного раствора (рН 7,6; 0,2М), 0,3 мл рабочего раствора ион-радикальной соли N, N, N,N- тетраметил-п-фенилендиамина (0,164 мг/мл, рН 4,6), ОД мл раствора глюкозооксидазы (2 мг/мл). Фотометрирование реакции проводят при 606 нм. Реакцию инициируют добавлением в раствор 50 мкл исследуемого раствора глюкозы. О скорости реакции судят, измеряя тангенс угла наклона линейного участка графика зависимости величины оптической плотности от времени. Концентрацию глюкозы рассчитывают из калибровочного графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации глюкозы. Результаты анализа представлены в табл. 2.
Таблица 2
Разбавление в кювете в 53 раза. Формула изобретения Способ определения глюкозы путе.м внесения пробы анализируемого вещества в смесь, содержанхую буферный раствор, глюкозооксидазу и индикаторный субстрат с последующим измерением оптической плотности полученного раствора, отличающийся тем, что, с целью повыщения чувствительности и точности способа, в качестве индикаторного субстрата используют N,N, NiN- тетраметил-п-фенилендиамин и процесс ведут при рН 7,3-8,0. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Патент США Re № 29498, кл. 195-1035, опублик. 1977. 2.Патент США № 3009862, кл. 195-1035 опублик. 1961 (прототип).
