Способ определения глюкозы в растворах Советский патент 1983 года по МПК C12Q1/00 G01N33/14 

(5) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛККОЗЫ В РАСТВОРАХ

Изобретение относится к биохимии и микробиологии, в частности к способам определения глюкозы в ра створах, биологических жидкостях и суспензиях микроорганизмов. .Известен способ определения глюкозы в растворах, включающий исполь зование глюкооксидазы. По концентра ции кислорода косвенно судят о содержании глюкозы в исследуемой пробе, так как в ферментативном окисле нии глюкозы с помощью глюкооксидазы участвует кислород Cl . К недостаткам способа относится использование дорогостоящих ферментов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ опред ления глюкозы в растворах путем вне сения в раствор индикаторных микроорганизмов и регистрации изменения физических свойств среды с последующим расчетом. Согласно известному способу клетки Pseudonranas fluorescens иммобилизуют на коллаг новой мембране, мембрану помещают на платиновый электрод, а сам электрод вносят в исследуемый образец жидкости и по показанию тока в цепи полярографического датчика определяют уровень глюкозы в растворе t2 . Недостатком известного способа является его сложность. Так, в каждом случае перед анализом необходимо осуществлять аэрацию анализируемой пробы и поддерживать концентрацию раст воренного в среде кислорода на постоянном уровне. Кроме того, длительна и. сложна процедура изготовле1 1Я колпагеновой плёнки с иммобилизованными микроорганизмами. Цель изобретения - упрощение способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения глюкозы в растворах путем внесения в раствор индикаторных микроорганизмов 39 и регистрации изменения физических свойств среды, в качестве индикаторных микроорганизмов используют бактерии Eschericnia coll, регистрируют изменение рН, а расчет ведут по формуле Пробы Р проБе/ f СТОНА CTciHA где Сг,ро5ь,-концентрация глюкозы в ана лизируемой пробе} ЛР пробьгИзменение рН от момента введения пробы до точки пе региба на прямой закисления среды -, С д-концентрация глюкозы в ст дартной пробе; AptL „ - изменение рН на стандартСТСдпД - нуга добавку глюкозы. На фиг, 1 и 2 - изображены графики, поясняющие предлагаемый способ Способ.осуществляют следующим об разом. Escherichia coli в анаэробных ус ловиях расщепляет глюкозу по схеме глюкоза-- -2 лактат + 2 , Глюкоза транспортируется в клетки микроорганизмов фосфоэнолтрансферазной системой, что исключает вл яние на анализ других Сахаров, кром Тех, что транспортируются той же си темой, В ячейку с суспензией микроорганизмов Е. coli М-17 помещают эл троды рН-метра и регистрируют исход ный уровень рН среды. Показания рНметра выведены на шкалу.самописца т что 0,05 единицы рН соответствует полной шкале самописца. Добавляют стандартное (дозированное)количество глюкозы в заданном объеме жидкос и регистрируют изменение рН среды, которое заканчивается после полного расщепления глюкозы микроорганизмам Изменение потенциала на шкале самописца служит калибровкой для оценки количества глюкозы в анализируемой пробе с неизвестным его содержанием Затем добавляют анализируемую пробу жидкости и регистрируют изменение рН среды на добавку пробы с глюкозой. Определение количества глюкозы в анализируемой пробе проводят путе сравнения сигнала на шкале самописца от калиброванного ее количества в анализируемой пробе. Чем больше глюкозы, тем бхэльше вызвано ею изменение рН среды и соответственно изменение на шкале сомописца. 4. . Добавка к суспензии микроорганиз-, MOB сложной среды, например, сахарозо-желатина с глюкозой сопровождается закислением среды, причем это закисление резко снижается после потребления из среды глюкозы. На ленте самописца это регистрируется как достаточно быстрое линейное изменение потенциала первоначального уровня, а затем, после исчерпания глюкозы, изменение потенциала будет происходить с другой (меньшей) скоростью, На ленте самописца это регистрируется как изменение угла наклона кривой закисления среды. Для определения глюкозы в этом случае необходимо учесть вклад в закисление среды количества неглюкозных компонентов, которое они успели произвести за время расщепления глюкозы. На фиг. 1 представлены две кинетические записи изменения рН среды в суспензии микроорганизмов Е, со11 М-17 в процессе поглощения глюкозы . По оси ординат отложено закисление среды на добавку анализируе мой пробы с глюкозой. 10 глюкозы соответствуют калибровочному вектору ЛРН отложенному по оси ординат. По оси абсцисс отложено время анализа в относительных единицах. Отрезок АВ характеризует кинетику закисления ( среды в процессе поглощения глюкозы из анализируемой пробы, Т - время поглощения добавки глюкозы. I - кинетика изменения рН среды в суспензий Микроорганизмов без других субстратов, которые могли бы быть утилизированы микроорганизмами, П - кинетика закисления среды в суспензии микроорганизмов, содержащей утилизируемые ,ими субстраты. Количество кислоты, выделившееся на добавку глюкозы, обозначено рН. Пример 1, Испытуемые образцы, содержащие глюкозу в концентрации 1СРМ: дистиллированная вода;0, раствор хлорида натрия) солевой растеор лактозы и арабинозы (1 лактозы и 1% арабинозы) ; раствор глицерина, сахарозы и желатина (1, 10 и % соответственно). В ячейку объемом 8 мл, термостатируемую при 20°С, наливают 8 мл изо; тонического раствора хлорида натрия с 5 мМ фосфатного буфера и в эту среду вносят содержимое ампулы препарата колибактерин, который содержит около 30 млрд, кл. Е. coli М-17. После установления в суспензии анаэробных условий (приблизительно через 2-3 мин после растворения таб летки препарата) можно приступать к анализу глюкозы в пробах различных образцов. Для этого onycKarot электроды рН-матра в суспензию, измеряют Уровень рН среды и автоматически записывают сигнал рН среды на ленте самописца. Полная шкала самописца со ответствует 0,1 единицы рН. Затем вносят с помощью микропипетки 0,1 мл водного раствора глюкозы с концентра цией и регистрируют изменение рН среды на эту добавку (фиг. 2). На фиг. 2 представлены графические данные изменения рН при добавлении к бактериальной суспензии клеток Е, соМ М-17 различных по соста ву проб жидкости, содержащих стандартную концентрацию глюкозы 1СГ%, Эти данные в дальнейшем используют для расчета количества глюкозы в ис следуемых образцах (стрелкой обозна чено внесение 0,1 мл субстрата в бактериальную суспензию и начало ре кого закйсления среды). Условия измерения: концентрация клеток 30 млрд, кл./мл; объем бактериальной суспензии 8 МЛ; состав среды 5 мМ раствор фосфатного буфера, тем пература 20°С J. В данном примере 0,1 мл раствора с глюкозы вызывает изменение в 0,03 единицы рН

10-2

Как видно из таблицы, предлагаемый способ позволяет анализировать до 1(Г глюкозы в объеме проб порядка 0,1 мл, при этом обеспечивается точность .около 10 до концентраций S-ICTM. Способ позволяет определять

0.,97-lu-2

глюкозу как в водном растворе без других Сахаров, так и в их присутствии.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным является более простым, он обладает выне зависимо от субстрата. Затем вносят исследуемую пробу в объеме 0,1мл. Ответ на добавку составляет О,Об единицы рН. Следовательно, количество глюкозы в анализируемой пробе составит (0,06:0,03)«10 М 2-10% (в расчете на 0,1 мл пробы). Пример2, В ту же ячейку вносят 0,1 мл разбавленного в 10 раз молока с растворенной глюкозой. В этом случае на ленте регистрируют сильное закисление среды, которое затем сменяется более слабым, В этом случае количество глюкозы в пробе рассчитывается из количества выделившейся кислоты в быстрой стадии закйсления за вычетом количества кислоты, приходящимся на непрерывно идущую , медленную стадию закйсления. Так, в быструю стадию закйсления выделяется 0,095 рН, причем вклад медленной стадии составляет 0,013 рН. Следовательно, количество глюкозы в пробе составит U,095-0,015 )/0,03-10 2, Примерз. В ту же ячейку вносят последовательно образцы проб объемом 0,1 мл, представляющие собой растворы глюкозы различной--концентрации. Каждая последующая проба вносится после окончания закйсления на добавку предыдущей пробы. Точность определения глюкозы в растворах предлагаемым способом приведена в таблице. сокой избирательностью по отношению к глюкозе в присутствии других окисляемых субстратов в аппаратурном оформлении. Для реализации его необходимы обычный рН-метр и электронный самопишущий потенциометр. Формула изобретения Способ определения глюкозы в раст ворах путем внесения в раствор индикаторных микроорганизмов и регистрации изменения физических свойств сре ды, отличающийся тем, целью упрощения способа, в качестве индикаторных микроорганизмов используют бактерии Escherlchlai coll, регистрируют изменение рН, а концентрацию глюкозы рассчитывают по формуле Vo6w P npo5b / P WaHA CTdHA

В

APH vue. f 9

ffoSadna алюнозы

I

г

б

t, omit. ев. 8 где Концентрация глюкозы в анализируемой пробе; ДрИм,Рбу- изменение рН от момента введения пробы до точки перегиба на прямой закисления среды; ггаиА ««««центрация глюкозы в стандартной пробе) зменение рН на стандартную добавку глюкозы. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Вгаипег .Н., ИыПег Y. Oucose Bestimungstand und Perspektiven. Bioined.Techn., 1980, 25, W 1-2, 26-32. 2.Karube 1. Mitsuda S., Suzukis. Glicose sensor using Immobilized whole cells of Psetidomonas fluorescens.«Eur. J, Appl. Mlcrobiol.and Blotechn,, 1979, 7, № i, p. 3 3-350 (прототип),

0,05

0,03

0,02

I t ( { I I I I

б8

Фиг. 2

1

Ю

12 lit t, jmm