МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО И ПРОДУЦИРУЮЩАЯ ЕГО ГИБРИДОМА Российский патент 2007 года по МПК C07K16/22 C12N5/18 G01N33/577 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу (MoAb), которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), к гибридоме, которая продуцирует MoAb, и к способу иммунологического измерения для специфического выявления hEPR в образцах с использованием hEPR-поликлонального антитела (hEPR-PoAb), которое распознает hEPR и MoAb.

Предшествующий уровень техники

Было известно, что существуют определенные генные аномалии, которые возникают со специфичностью и высокой частотой в раковых клетках, и если обнаруживается белок (белки), которые вызваны генной аномалией, то такой белок может представлять собой молекулу-мишень для диагностики и лечения рака. Среди них группа молекул, которые относятся к семейству эпидермального ростового фактора (EGF), и молекулы семейства их рецепторов ErbB были молекулами-мишенями для диагностики и лечения рака, поскольку они участвуют в росте раковых клеток и связаны со злокачественностью (J. Clin. Oncol., 17, 2639-2648 (1999); Biochem. Biophys. Acta., 1198, 165-184 (1994); Science, 244, 707-712 (1989); Anticancer Res., 20:91-95 (2000); Front. Biosci., 1;6:D685-707 (2001)).

Сообщалось, что эпирегулин (EPR), член семейства EGF, имеет бифункциональный характер в том смысле, что он способствует росту нормальных клеток и ингибирует рост определенных раковых клеток in vitro, и что уровень экспрессии EPR (мРНК) в нормальных клетках крайне низок, за исключением плаценты и моноцитов, но высок в определенных раковых клетках (см., например, The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, p. 7495-7500; The Biochemical Journal, 1997, Vol. 326, p. 69-75).

Далее, в клинической области указывается, что эпирегулин может представлять собой полезный маркер для диагностики рака, потому что его экспрессия высока при раке мочевого пузыря и раке поджелудочной железы (см., например, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, Vol.14 273 (3), p.1019-1024; AntiCancer Research, 2000, Jan-Feb, 20 1A9: p.91-95; Cancer Research, 2001, Vol.61, p.6227-6233).

До настоящего времени были сообщения о том, что полипептид EPR выявляется с использованием поликлональных антител (hEPR-PoAb), которые распознают человеческий эпирегулин (hEPR) (см., например, The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, p.7495-7500; The Biochemical Journal, 1997, Vol.326, p.69-75), но они не представляют собой способы с высокой чувствительностью и высокой производительностью, потому что они требуют операций концентрации, метки радиоизотопами и им подобными метками, и нет сообщений о выявлении полипептида EPR в живом организме. Таким образом, разработка простого и высокочувствительного способа выявления hEPR может предоставить полезное средство в качестве способа диагностики рака для его раннего выявления.

Описание изобретения

Известно, что гомология аминокислотной последовательности между EPR и другими белками-членами семейства EGF составляет от 24 до 50% (см. The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, p.7495-7500). Кроме того, гомология последовательности EPR между видами очень высока, например, EPR человека и мыши отличаются только по 6 из 46 аминокислотных остатков. Способ выявления EPR c использованием описанных выше поликлональных антител требует сложных процедур и не может дифференцировать EPR человека и мыши. К тому же чувствительность обычных способов выявления составляет максимум 1 нг/мл и поэтому невозможно выявить EPR в живом организме.

Целью настоящего изобретения является предоставление простого и высокочувствительного способа выявления hEPR и использование способа для выявления опухолей человека. В частности, настоящее изобретение предоставляет простой способ выявления hEPR на пикограммовом уровне, который можно использовать для выявления опухолей и подобных целей.

Заявители провели тщательные исследования для решения описанных выше проблем и в конечном счете получили 2 гибридомы (IC3, 3E8), продуцирующие моноклональные антитела (MoAb), которые специфически распознают hEPR. Кроме того, разработан сэндвич-иммуноферментный твердофазный анализ (S-ELISA) комбинированием MoAb и hEPR-PolyAb и разработана система выявления, которая высокочувствительна и высокопроизводительна.

Таким образом, изобретение предоставляет следующее от (1) до (9).

(1) Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин hEPR.

(2) Гибридому по п.(1), которая имеет номер доступа FERM BP-08647.

(3) Гибридому по п.(1), которая имеет номер доступа FERM BP-08647.

(4) Моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой по любому из пп.(1)-(3).

(5) Моноклональное антитело, которое распознает эпитоп, который распознается моноклональным антителом, продуцируемым гибридомой по пп.(2) или (3), и специфически распознает hEPR.

(6) Способ специфического выявления hEPR в образце in vitro, отличающийся тем, что используются моноклональное антитело по п.(4) и поликлональное антитело, которое распознает hEPR (hEPR-PoAb).

(7) Способ выявления клеток, экспрессирующих hEPR in vitro, отличающийся тем, что используется моноклональное антитело по п.(4).

(8) Способ по п.(7), при котором клетки, экспрессирующие hEPR, представляют собой опухоль человека.

(9) Набор для выявления опухоли человека, включающий моноклональное антитело по п.(4).

Содержание описания и/или чертежей заявки на патент Японии № 2003-070864, которая является основанием приоритета настоящей заявки, полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 показаны результаты измерения титра моноклонального антитела против hEPR, которое продуцируется гибридомой настоящего изобретения, способом ELISA.

На фиг.2 показаны результаты измерения титра биотинилированного поликлонального антитела против hEPR.

На фиг.3 показана чувствительность выявления системы сэндвич-ELISA (S-ELISA) с использованием поэтапного способа и одномоментного способа.

На фиг.4 показаны результаты теста специфичности настоящего способа с использованием моноклонального антитела 1С3 в качестве первого антитела. В настоящей системе моноклональное антитело не взаимодействует с молекулами семейства EGF или мышиным EPR и взаимодействует только с hEPR.

На фиг.5 показан результат анализа вестерн-блоттингом hEPR в сыворотке человека. Положения маркеров молекулярной массы (кДа) показаны слева.

На фиг.6 показано выявление hEPR в сыворотке человека S-ELISA.

На фиг.7 показано выявление hEPR в различных средах клеточных культур.

Лучший способ осуществления изобретения

Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, специалисты в данной области могут реализовать настоящее изобретение в различных вариантах осуществления, используя методики, известные в данной области, и настоящее изобретение не ограничено следующими вариантами осуществления.

Используемый в настоящем описании термин «hEPR» при отсутствии других указаний означает предшественник, зрелую форму или фрагмент человеческого эпирегулина. «Предшественник» означает связанную с мембраной форму перед отщеплением ферментом, а «зрелая форма» означает полипептид с 46 аминокислотными остатками (SEQ ID NO:1), высвобожденный из клеточной мембраны. Фрагмент содержит 20 аминокислотных остатков или более, или предпочтительно 30 аминокислотных остатков или более полипептида и должен содержать последовательность, специфичную для человеческого эпирегулина. Последовательность, специфичная для человеческого эпирегулина, не означает, что она ограничена, но включает, например, последовательность, содержащую 2-ю, 11-ю, 26-29-е и 39-ю аминокислоты аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, которые, как известно, различны, когда сравниваются человеческий эпирегулин и мышиный эпирегулин. Тот факт, что аминокислоты в этих сайтах различны у человека и мыши, описан в патентной заявке WO94/29340 того же заявителя. Фрагменты, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую эти сайты, принимают различные высшие структуры, когда сравниваются фрагменты EPR, полученные у человека и мыши. «Человеческий эпирегулин» и «мышиный эпирегулин» представляют собой полипептиды с такой же аминокислотной последовательностью, как у EPR, естественно присутствующего соответственно у человека и мыши. Однако они необязательно ограничиваются белками, экстрагированными из естественных источников, но предполагается, что они включают, например, рекомбинанты и синтетические полипептиды.

Используемый в настоящем описании термин «специфически распознает» означает, что распознается (или связывается) hEPR, но другие белки семейства EGF или нечеловеческий EPR, такой как мышиный EPR, и им подобные, по существу, не распознаются (связываются). Это означает, например, что распознается (связывается) предшественник, зрелый белок и фрагментированные полипептиды hEPR, но EGF и TGF-α, мышиный EPR и им подобные, по существу, не распознаются (не связываются). В частности, это означает, что его аффинитет связывания по сравнению с аффинитетом связывания других белков семейства EGF и нечеловеческого EPR, такого как мышиный EPR, выше в 100 раз или более предпочтительно в 1000 раз или более, предпочтительнее в 10000 раз или более.

Используемый в настоящем описании термин «по существу не распознаются (не связываются)» означает, что связывание не подтверждено средством выявления, в целом используемым в данной области, или настоящего изобретения. В частности, он означает, что предшественник - зрелый белок и фрагментированный полипептид hEPR - проявляет положительную реакцию на способ сэндвич-ELISA (S-ELISA), способ вестерн-блоттинга или им подобные, но EGF и TGF-α семейства EGF, и EPR, полученный у млекопитающих, кроме человека, таких как мышь, не проявляют реакцию (не выявляются).

Используемый в настоящем описании термин «антитело» означает поликлональное антитело (PoAb) или моноклональное антитело (MoAb), которое специфически связывается с молекулой hEPR полной длины или фрагментом hEPR, или частичный фрагмент этих антител (например, фрагменты (Fab или F(ab')2 или Fab'), полученные расщеплением папаином или пепсином, или им подобными ферментами, и их можно получить способами продукции, описанными ниже.

Гибридомы и моноклональные антитела настоящего изобретения можно получить следующим образом. Кроме того, специалисты в данной области могут использовать подходящим образом измененные способы на основании следующего описания и методик, известных в данной области.

(1) Получение антигена

Аминокислотная последовательность антигена hEPR и нуклеотидная последовательность, которая кодирует его, описаны в WO94/29340. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность показаны соответственно в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Кроме того, EPR описан в качестве фактора, ингибирующего рост опухолевых клеток, в WO94/29340.

Рекомбинантный человеческий EPR можно получить, как описано в WO94/29340, конструированием вектора экспрессии, который содержит фрагмент ДНК (SEQ ID NO:2), кодирующей hEPR, и введением и экспрессией вектора в клетках-хозяевах, например, не ограничиваясь, но предпочтительно Bacillus brevis. После экспрессии с использованием Bacillus brevis культуральную среду концентрируют в 20 раз, используя ультрафильтрационную мембрану (1000 кДа), рН доводят до 7,4 с помощью 1 М Tris-HCl (рН 8,0), и очистку проводят, используя анионно-обменную колонку, например колонку из Q-сефарозы. В этом случае рН, прошедшую через мембрану фракции, доводят до 5,0 и далее очищают катионно-обменной колонкой, например колонкой из Q-сефарозы. Затем проводят очистку колоночной хроматографией в обращенной фазе (колонка С4) с тем, чтобы получить одну полосу при электрофорезе.

hEPR можно также синтезировать химически твердофазным способом (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Vol. 85, p.2185 (1963)) на основании аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1. Химический синтез твердофазным способом обычно проводят стандартным способом, используя автоматический пептидный синтезатор.

(2) Получение поликлональных антител

Теплокровное животное иммунизируют всего 4-6 раз одним раствором пептидного антигена или вместе с носителями и разбавителями. Примеры используемых теплокровных животных включают, например, кроликов, собак, морских свинок, мышей, крыс и им подобных животных. Предпочтительно измерять титр антител взятием образцов крови после третьей подкожной иммунизации. Измерение титра антител в сыворотке проводят иммобилизацией пептида, используемого в качестве антигена, на 96-луночной титровочной микропланшете с выполнением способа ELISA. После подтверждения того, что титр антител поднялся достаточно высоко, берут цельную кровь и антитело выделяют и очищают стандартным способом. Способы очистки включают, например, осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию с использованием анионного обменника, такого как DEAE (диэтиламиноэтанол)-целлюлоза и подобной ей, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию с активным абсорбентом, таким как белок A/G и ему подобные и другие способы очистки. Кроме того, специфичность в отношении hEPR можно увеличить очисткой с использованием колонки, в которой hEPR иммобилизован на твердой фазе.

(3) Получение моноклональных антител

Клетки, продуцирующие моноклональные антитела, получают отбором из иммунизированных теплокровных животных отдельного животного, у которого возрос титр антител, взятием селезенки или лимфатического узла через 2-5 д после последней иммунизации, слиянием продуцирующих моноклональные антитела клеток, присутствующих в этих органах, с клетками миеломы и выбором гибридом, продуцирующих MoAb. Слияние проводят в соответствии с известным способом, таким как способ Kohler at al. (Nature, 256, 495 (1975)). Клетки миеломы включают, но не ограничиваются, например, PAI, P3U1 (Health Science Research Resources Bank; HSRRB), Япония, номера по каталогу JCRB0113 и JCRB0708) и подобные им. Средства, промотирующие слияние, включают полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендаи (HJB), но предпочтительно PEG с молекулярной массой от 1000 до 6000. Эффективное слияние клеток можно достичь добавлением промотирующего средства в концентрации примерно от 10 до 80% и инкубацией при 20-40°С.

Выбор моноклонального антитела можно проводить в соответствии с известным способом. В целом он проводится в среде клеточной культуры для клеток животных с добавкой НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Среды для отбора и роста могут включать, например, среду PRMI1640, содержащую от 10 до 20% телячьей фетальной сыворотки и ей подобные. Клетки в целом культивируются в атмосфере 5% газообразного СО₂ при температуре 20-40°С в течение периода от 5 д до 3 нед.

Надосадочные жидкости собирают из лунок, в которых культивируются клетки гибридомы, и антитела, реагирующие с антигенным пептидом, можно выбрать способом ELISA. Сначала антигенный пептид иммобилизуют на 96-луночных планшетах и затем блокируют телячьей сывороткой. После взаимодействия надосадочной жидкости гибридом с мышиными иммуноглобулинами/HRP (Amersham-Pharmacia) при 37°С в течение 1 ч возникает окрашивание при использовании тетраметилбензидинового микропланшетного пероксидазного субстрата (TMB, Funakoshi) в качестве субстрата. После окончания реакции с кислотой измеряют спектральную поглощательную способность 450/540. Отбирают антитела со спектральной поглощательной способностью примерно 3, и клонирование проводят способом конечного разведения.

Полученные таким образом клетки-мишени гибридомы культивируют, и моноклональное антитело можно получить из культуральной среды. Альтернативно клетки гибридомы можно инокулировать внутрибрюшинно, например мыши (Balb/c), и моноклональное антитело можно получить из асцитной жидкости.

Очистку моноклонального антитела можно проводить аналогичным образом в виде описанного выше обычного разделения и очистки PoAb.

Кроме того, заявители депонировали 2 вида гибридом 25 сентября 2002 г. в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) (Центр № 6, 1-1-1 Hagashi, Tsukuba City, Ibaragi-Ken) с номерами доступа FERM P-19033 и FERM P-19034. Позднее они были перемещены 27 февраля 2004 г. в международный депозитарий на основании Будапештского договора по Международному признанию депозита микроорганизмов в целях патентной процедуры, с номерами доступа FERM BP-08647 и FERM BP-08648.

Кроме того, моноклональные антитела настоящего изобретения включают моноклональные антитела, которые специфически распознают эпитоп, который распознается моноклональными антителами, продуцируемыми описанной выше гибридомой, особенно гибридомой с номерами доступа FERM BP-08647 и FERM BP-08648, а также распознают hEPR. Эпитоп, который распознается этими моноклональными антителами, содержит аминокислотные остатки, которые включены в уникальную последовательность описанного выше hEPR.

Настоящее изобретение предоставляет способ специфического выявления hEPR, отличающийся тем, что используются описанные выше моноклональные антитела и поликлональные антитела настоящего изобретения, которые распознают hEPR (hEPR-PoAb). Образец включает кровь, биологические жидкости, тканевые экстракты и им подобные материалы, взятые у индивидуумов. Хотя определенных ограничений нет, но предпочтительным способом является способ анализа S-ELISA, включающий этап контакта образца, который может содержать антиген hEPR, с моноклональным антителом настоящего изобретения и этап контакта комплекса антиген-антитело, который генерируется на первом, с поликлональным антителом. Описанные выше этапы можно проводить последовательно (поэтапный способ) или одновременно (одномоментный способ). Способ S-ELISA описан, например, в публикации «Моноклональное антитело, гибридома и ELISA» (Iwasaki, Tatsuo et al. Kodansha Scientific), и специалисты в данной области могут осуществить способ настоящего изобретения на основании настоящего описания. Поскольку способ выявления настоящего изобретения является очень чувствительным и способен выявить hEPR при концентрации 10 пкг/мл или выше, то концентрация hEPR, экспрессированная в живом организме (примерно 20-30 пкг/мл), достаточно высокая для выявления.

Настоящее изобретение также предоставляет способ выявления in vitro клеток, экспрессирующих hEPR, в частности опухолей человека, отличающийся тем, что используются описанные выше моноклональные антитела настоящего изобретения. Поскольку hEPR секретируется из клеточной мембраны после экспрессии в клетках, то hEPR может быть выявлен во внеклеточных жидкостях, и нет необходимости в том, чтобы образец содержал клетки.

Описанный выше способ включает этап контакта образца, полученного у человека, и моноклонального антитела настоящего изобретения, и этап выявления присутствия hEPR определением того, связывается ли моноклональное антитело с hEPR в качестве индикатора или нет. Человеческие опухоли-мишени включают, например, рак легких, толстой кишки, мочевого пузыря, матки, ободочной кишки и им подобные, но не ограничиваются ими.

Поскольку способ выявления настоящего изобретения характеризуется высокой чувствительностью, выявление можно легко и быстро проводить без необходимости в таких манипуляциях с образцом, как концентрация и ему подобные. В настоящем способе образцы, содержащие hEPR в концентрации 10 пкг/мл или более, можно выявить способом S-ELISA и ему подобными, но для надежного выявления предпочтительно, чтобы образец содержал 25 пкг/мл или более.

Используя способ выявления настоящего изобретения, можно определить то, экспрессируют ли hEPR специфические опухолевые клетки или им подобные, или нет, и если да, то каков уровень экспрессии. Далее, он может способствовать выяснению связи между экспрессией hEPR и механизмом канцерогенеза. Кроме того, на основании данных об опухолевых клетках, которые экспрессируют hEPR на высоком уровне, и об уровне экспрессии у нормальных клеток можно выявить присутствие опухоли у конкретного индивидуума.

Настоящее изобретение также предоставляет набор для выявления опухоли человека, включающий моноклональное антитело настоящего изобретения.

Набор настоящего изобретения может целесообразно включать, кроме описанного выше моноклонального антитела настоящего изобретения, поликлональные антитела, буфер, красящее вещество, метящий реагент, разбавитель и им подобные вещества. Предпочтительно набор настоящего изобретения представляет собой набор для выполнения S-ELISA.

Как будет показано ниже, настоящее изобретение конкретнее объясняется вариантами осуществления, но, как описано выше, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.

Пример 1 Получение гибридом

100 мкл рекомбинантного hEPR (1 мг/мл) (полученного способом, описанным в WO94/29340) в солевом растворе смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда, эмульгируют и инокулируют в спину мыши (Balb/c, в возрасте 6 нед.). Через 2 нед. мышь повторно иммунизируют смесью 50 мкл солевого раствора антигенного пептида (hEPR, 1 мг/мл) и неполного адъюванта Фрейнда, эмульгируют обработкой ультразвуком и после этого еженедельно проводят дополнительные иммунизации. Через 40 д после иммунизации удаляют селезенку, лимфоциты собирают в среду PRMI1640 (с добавкой пенициллина и стрептомицина) и обрабатывают 0,17 М хлоридом аммония для удаления эритроцитов. Выделенные лимфоциты сливают со штаммом P3U1 клеток миеломы, полученных из опухоли костного мозга мышей полиэтиленгликолевым способом (PEG4000) для получения клеток гибридомы. Полученные таким способом клетки гибридомы суспендируют в среде НАТ с клетками фидера и затем распределяют на 96-луночные планшеты и культивируют в течение 15 д.

Пример 2. Скрининг для выявления моноклонального антитела

Надосадочную жидкость культуральной среды извлекают из лунок, в которых культивировались клетки гибридомы, полученные в примере 1, и способом ELISA выбирают MoAb, которые взаимодействуют с антигенным пептидом.

Сначала 100 мкл антигенного пептида в концентрации 10 мкг/мл добавляют в каждую лунку 96-луночных планшет, иммобилизуют в твердую фазу после выдерживания при 4°С в течение ночи и блокируют 200 мкл 10% телячьей сыворотки при 37°С в течение ночи. 100 мкл надосадочной жидкости культуральной среды клеток гибридомы добавляют в каждую лунку, проводят реакцию при 37°С в течение 2 ч, а затем добавляют антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Amersham-Pharmacia), которое разводят в 1000 раз, и проводят реакцию при 37°С в течение 1 ч. Окрашивание получают, используя тетраметилбензидиновый микропланшетный пероксидазный субстрат (ТМВ, Funakoshi) в качестве субстрата.

После прекращения реакции добавлением 100 мкл 4N серной кислоты измеряют спектральную поглощательную способность при 450-540 нм и отбирают MoAb, IC3 и 3Е8, которые проявляют спектральную поглощательную способность примерно 3, и клонируют способом ограниченного разведения.

Мышей (Balb/c), которым за 7 д и 3 д до этого внутрибрюшинно инъецировали 0,5 мл пристина, внутрибрюшинно инокулируют отобранными клетками гибридомы IC3 и 3Е8, продуцирующими MoAb, и асцитическую жидкость собирают примерно через 10 д. Собранную асцитическую жидкость держат при комнатной температуре в течение 30 мин при 4°С в течение ночи и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин, а затем извлекают надосадочную жидкость.

Титры отобранных 2 видов MoAb измеряют способом ELISA, и результаты показаны на фиг.1. Количество рекомбинантного hEPR, показанное на горизонтальной оси, иммобилизируют на микролуночной планшете, добавляют IC3 или 3Е8 (1 мкг/мл) и после взаимодействия возникает окрашивание при использовании антимышиного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) и ТМВ. Результаты указывают на то, что оба MoAb взаимодействуют зависимым от концентрации образом.

Далее, гибридомы, которые продуцируют MoAb IC3 и 3Е8, были депонированы 25 сентября 2002 г. в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) (Центр № 6, 1-1-1 Hagashi, Tsukuba City, Ibaragi-Ken) с номерами доступа FERM P-19033 и FERM P-19034.

Пример 3. Получение поликлональных антител

1 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 1 мл полного адъюванта Фрейнда (Difco) смешивают и эмульгируют обработкой ультразвуком и иммунизируют введением в спину кроликов (японских белых, массой 2,7 кг, самок, от Japan Clea) в 10 отдельных мест или более. Через 1 мес 0,5 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (Sigma) смешивают и эмульгируют обработкой ультразвуком и иммунизируют второй раз аналогичным образом, как при первой иммунизации. После второй иммунизации дополнительные иммунизации проводили еженедельно 1 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, которые эмульгируют обработкой ультразвуком. Образцы крови берут через 1 нед. после иммунизации, держат при комнатной температуре в течение 1 ч после перемешивания пастеровской пипеткой, оставляют при 4°С на ночь и центрифугируют при 5000×g в течение 10 мин для получения антисыворотки.

Антисыворотку осаждают 40% сульфатом аммония, диализируют против 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0) в течение ночи на колонке с Protein-G (Amersham-Pharmacia) для получения фракции IgG. Для дальнейшей очистки антител колонку готовят в соответствии с обычным способом на основании описания изготовителя связыванием 1 мг рекомбинантного hEPR примерно с 1 мл активированной NHS (нормальной человеческой сывороткой) Sepharose 4 Fast Flow (Amersham-Pharmacia). рН фракции IgG, полученной, как описано выше, доводят до 8,0 и культивируют посредством этой колонки в течение 10 ч или дольше, и антитела, связанные с колонкой, элюируют с 50 мМ глицина-HCl (рН 2,5)/0,15 М NaCl. рН элюированных антител сразу доводили до нейтрального уровня 1 М Tris и снова диализировали против 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,4)/0,15 М для получения специфических антител против hEPR.

Специфические антитела биотинилируют обычным способом, используя реагент для биотинилирования (Amersham-Pharmacia). Титр биотинилированных hEPR-PoAb измеряют следующим способом. Раствор hEPR самой высокой концентрации 200 нг/мл разводят в 5 раз и иммобилизуют на 96-луночной микропланшете (100 мкл/лунку). После блокирования 25% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., 200 мкл/лунку) добавляют биотинилированное антитело hEPR-PoAb (0,125 мкг/мл (разбавленное 50% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co.), 100 мкл/лунку) и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем добавляют Avidin-HRP (Amersham-Pharmacia), разведенный в 1000 раз в концентрации 100 мкл/лунку, и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. После добавления ТВМ реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин и прекращают 4N серной кислотой. Спектральную поглощательную способность измеряют при 450-540 нм, и титр против антигена, иммобилизованного на твердой фазе, получают, как в примере 2. Результаты указывают на то, что все из них демонстрируют реакции, зависимые от концентрации антигена, подтверждая то, что они имеют титры, которые можно использовать (фиг.2)

Пример 4. Система сэндвич-ELISA

Систему ELISA конструируют, используя моноклональное антитело, полученное в примере 2, и поликлональные антитела, полученные в примере 3.

Моноклональное антитело, IC3, в концентрации 1 мкг/мл добавляют в микроплашету в количестве 100 мкл/планшету и инкубируют при 4°С в течение 24 ч для иммобилизации к твердой фазе. Лунки промывают 3 раза 200 мкл/планшету 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, содержащим 0,1% Tween 20 (TBST). Блокирование проводят добавлением 25% Block Ace в количестве 200 мкл/планшету и инкубацией при 4°С в течение 24 ч.

В поэтапном способе лунки промывают 3 раза TBST в количестве 200 мкл/планшету, добавляют hEPR, серийно разведенный в 2 раза, начиная с 1 нг/мл, и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем добавляют биотинилированное антитело hEPR-PoAb (1 мкг/мл, 100 мкл/лунку) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч.

В одномоментном способе антиген hEPR и биотинилированное антитело hEPR-PoAb добавляют одновременно и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч.

После промывания лунок 5 раз TBST добавляют авидин-HPR (Amersham-Pharmacia), разведенный в 1000 раз, в количестве 100 мкл/лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращают добавлением 4N серной кислоты и спектральную поглощательную способность измеряют при 450/540 нм. Результаты указывают на то, что нет различия чувствительности выявления между поэтапным способом и одномоментным способом, и оба способа имеют достаточную чувствительность (25 пкг/мл) для измерения количества в живом организме (фиг.3). В аналогичном тесте, проведенном с использованием 3Е8 в качестве первичного антитела, результаты были такие же.

Пример 5. Специфичность системы сэндвич-ELISA

Специфичность настоящей системы была подтверждена способом, показанным в примере 4 (одномоментный метод).

MoAb IC3 (1 мкг/мл, 100 пкл/мл) иммобилизуют на лунках микролуночной планшеты в качестве первичного антитела и после блокировки 25% Block Ace (200 мкг/лунку) добавляют группу молекул члена семейства EGF, к которой относится EPR (6 факторов: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), связывающий гепарин фактор роста, подобный EGF (HB-EGF), бетацеллюлин (BTC), амфирегулин (AR), герегулин-α (HRG-α), все закупленные у R&D Co. или Sigma Co.), мышиный EPR (полученный таким же путем как человеческий EPR), или человеческий EPR в количестве, показанном по горизонтальной оси, вместе с биотинилированным hEPR-PoAb (2 мкг/мл, 500 мкл/лунку; конечная концентрация 1 мкг/мл). 6 членов семейства EGF и мышиный EPR серийно разводят в 4 этапа, в 5 раз на каждом этапе, начиная с концентрации 200 нг/мл, и добавляют в количестве 200 мкл/лунку. Аналогичным образом человеческий EPR разводят в 4 этапа, в 5 раз на каждом этапе, начиная с концентрации 200 нг/мл. После реакции с авидином-HPR окрашивание получают, используя TMB.

Как показано на фиг.4, hEPR выявлялся с высокой чувствительностью, но другие молекулы, которые представляли собой молекулы семейства EGF, и мышиный EPR невозможно было выявить в концентрациях, которые выше в 1000 раз, подтверждая специфичность настоящее системы сэндвич-ELISA. Такие же результаты были получены в аналогичном тесте при использовании 3Е8 в качестве первичного антитела.

Пример 6. Анализ вестерн-блоттингом человеческого EPR в сыворотке человека

Человеческую сыворотку (Rockland INC.) разводят в 10 раз, используя 50 мМ буфер Tris-HCl при рН 7,4 (Gibco BRL). Рекомбинантный hEPR добавляют к разведенной человеческой сыворотке для получения тестируемых образцов в 5 раз серийным разведением, так что конечная концентрация была в полосе 1:0 пкг/мл, в полосе 2:8 пкг/мл, в полосе 3:40 пкг/мл, в полосе 4:200 пкг/мл, в полосе 5:1000 пкг/мл. Полученный таким способом тестируемые образцы подвергают электрофорезу на SDS (додецилсульфат натрия) полиакриламидном геле (SDS-PAGE), переносят на мембрану PVDF (Daiichi Pure Chemical Co.), а затем анализируют способом иммуно-блоттингом (J. Biol. Chem., 270, 7459-7500), используя антитела, такие как анти-hEPR-PoAb, MoAb1C3 и 3Е8 (пкг/мл), которые распознают hEPR. Результаты указывают на то, что каждое антитело специфически выявляет hEPR в области от 3,7 до 8,2 кДа (фиг.5). Хотя полоса примерно 28 кДа была выявлена PoAb и MoAb IC3, ее рассматривали как неспецифичную полосу, потому что такая же полоса была выявлена в полосе антигена (-).

Пример 7. Выявление человеческого EPR способом ELISA

Моноклональное антитело, 1С3 или 3Е8, добавляет в лунки микропланшеты в количестве 100 мкл/лунку и иммобилизировали к твердой фазе инкубацией при 4°С в течение 24 ч. Планшету промывают 3 раза 200 мкл/лунку 50 мМ Tris-HCl при рН 7,5, содержащим 0,1% Tween 20 (TBST), и блокируют добавлением 200 мкл/лунку Block Ace и инкубируют при 4°С в течение 24 ч. После промывания лунок 3 раза 200 мкл/лунку TBST в двукратно разведенной человеческой сыворотке hEPR серийно разбавляют в 2 раза, начиная с 400 пкг/мл, и добавляют по 50 мкл/лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После промывания 5 раз TBST добавляли разведенный в 1000 раз авидин-HPR (Amersham-Pharmacia) в количестве 100 мкл/лунку и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращают добавлением 4N серной кислоты, окрашивание получают, используя TMB, и спектральную поглощательную способность измеряют при 450/540 нм. Результаты показаны на фиг.6, которые указывают на то, что hEPR в концентрации 25 пкг/мл можно в достаточной степени выявить любым из 1С3 и 3Е8.

Пример 8. Выявление EPR, продуцируемого культивируемыми клетками рака человека

Различные культуры клеток, полученных от мыши (IC38, RAW264,7, NIH3T3, клон Т7, MoAb3) и человека (Т-24, А-549, НСТ116, colo205, colo210, HeLa, NB69, A431, SK-BR-3, MDA-MB-468, KB, TR-13), культивируют в течение 3 д в культуральной среде, содержащей 10% телячьей сыворотке, начиная с 10⁶ клеток/10 мл/чашку, и культуральные среды подвергают выявлению hEPR методом S-ELISA.

MoAb IC3 (1 мкг/мл) иммобилизируют к твердой фазе в концентрации 100 мкл/лунку и после блокировки в лунку одновременно добавляют 50 мкл различных сред культуры клеток и 50 мкл биотинилированного hEPR-PoAb (2 мкг/мл) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого операции были аналогичны операциям в примере 4. В качестве контролей аналогичные операции проводили на сыворотках с дополнительным добавлением или без добавления hEPR (10% FBS (фетальной телячьей сыворотки), сыворотка человека, 0,1% BSA (hEPR 1 нг/мл), сыворотка человека (EPR 1 нг/мл).

Результаты указывают на то, что А450 нм не наблюдается в культуральных средах из клеток мышей, таких как NIH3T3, клон Т7, продуцирующий мышиный EPR и другие, в то время как продукция hEPR подтверждается в раковых клетках человека, таких как А-549 (клетки рака легких человека), НСТ116 (рак толстой кишки человека), colo201 (рак толстой кишки человека), colo205 (рак толстой кишки человека) и Т-24 (рак мочевого пузыря человека) (фиг.7), подтверждая то, что hEPR можно специфически обнаружить в культуральных средах. Однако hEPR нельзя выявить в таких раковых клетках человека как HeLa (рак шейки матки человека), NB69 (нейробластома человека), КВ (эпидермальная карцинома (ротовой полости) человека)), А431 (эпидермальная карцинома (эпидермиса) человека)), SK-BR-3 (рак молочной железы человека) и TR-13 (рак почки человека).

Промышленная применимость

В соответствии с настоящим изобретением становится возможным предоставление системы, которая с высокой специфичностью и чувствительностью выявляет hEPR в крови, тканях и других материалах, полученных из организма человека, и ее можно использовать для диагностики рака и других опухолевых заболеваний для выявления опухолевых клеток, экспрессирующих hEPR. Кроме того, ожидается, что применение способа настоящего изобретения будет способствовать выявлению присутствия или отсутствия экспрессии hEPR и связи между экспрессией hEPR и механизмом канцерогенеза.

Все публикации, патенты и патентные заявки, ссылки на которые приведены в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфичные в отношении эпирегулина человека (hEPR). Раскрыто моноклональное антитело, специфически распознающее эпирегулин человека с чувствительностью 10 пг/мл. Описаны способы специфического выявления эпирегулина человека в образце in vitro и способ выявления клеток, экспрессирующих эпирегулин человека во внеклеточной жидкости in vitro с использованием моноклонального антитела к эпирегулину человека. Использование изобретения позволяет просто и с высокой чувствительностью выявлять эпирегулин человека, что может найти применение в диагностике опухолей человека, экспрессирующих эпирегулин. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), депонированная в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) под номером FERM ВР-08647.2. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), депонированная в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) под номером FERM BP-08648.3. Моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR) с чувствительностью 10 пг/мл или более.4. Моноклональное антитело по п.3, продуцируемое гибридомой, имеющей депозитарный номер FERM ВР-08647.5. Моноклональное антитело по п.3, продуцируемое гибридомой, имеющей депозитарный номер FERM BP-08648.6. Способ специфического выявления hEPR в образце in vitro, отличающийся тем, что моноклональное антитело по п.3 используется в качестве первого антитела, и поликлональное антитело, которое распознает hEPR (hEPR-PoAb), используется в качестве второго антитела.7. Способ выявления клеток, экспрессирующих hEPR или hEPR во внеклеточной жидкости in vitro, отличающийся тем, что используется моноклональное антитело по п.3.8. Способ по п.7, при котором клетки, экспрессирующие hEPR, представляют собой клетки рака толстой кишки человека.