РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFastBac-B9RZ, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИРУСА ОСПЫ ОБЕЗЬЯН, КОДИРУЮЩИЙ ИНТЕРФЕРОН ГАММА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК, И ШТАММ БАКУЛОВИРУСА BvB9RZ, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РАСТВОРИМЫЙ ИНТЕРФЕРОН ГАММА-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК ВИРУСА ОСПЫ ОБЕЗЬЯН Российский патент 2008 года по МПК C12N15/23 C12N15/39 C12N15/86 C12N7/01 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может найти применение как лекарственное средство нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией интерферона гамма (IFNg).

Интерфероны - секретируемые видоспецифичные гликопротеины, подразделяемые на два типа (a/b и g). Взаимодействуя с соответствующими клеточными рецепторами, они индуцируют возникновение антивирусного состояния [1]. Интерфероны являются многофункциональными цитокинами, одними из важнейших регуляторов развития воспалительных и иммунных реакций в ответ на вирусную инфекцию. Однако нарушения контролируемой продукции IFNg играют критическую роль в этиологии развития ряда заболеваний человека, таких как болезнь Крона [2], диабет первого типа [3], ревматоидный артрит [4], системная красная волчанка [5], псориаз [6]. Успех при лечении этих заболеваний будет зависеть от того, насколько быстро и эффективно удасться снизить уровень IFNg в организме больного. В настоящее время имеется положительный опыт применения поликлональных [7, 8, 9, 10] и моноклональных антител [11] для лечения аутоиммунных заболеваний. Препарат гуманизированных моноклональных антител находится в настоящее время на второй стадии клинических испытаний [11]. Также существуют препараты «Анаферон» и «Анаферон детский» (per. уд. Р N 000372/01-2001), приготовленные на основе аффинно-очищенных антител, содержащие активированную форму сверхмалых доз моноклональных, поликлональных или естественных антител к IFNg, полученную преимущественно по гомеопатической технологии, применяемые для лечения гриппа и ОРВИ [12].

Еще одним способом лечения заболеваний, связанных с высоким уровнем IFNg в организме больных людей, является применение растворимых IFNg-связывающих белков - рецепторов этого цитокина. Указанные белки были выделены из мочи [13, 14] или из клеток человека (WISH, HeLa, FS11...) [15]. Однако процесс получения рецепторов IFNg из указанных источников достаточно трудоемок и не позволяет получить лекарственное средство в достаточных количествах.

Наиболее близким к заявляемому подходу является использование в качестве средства анти-IFNg-терапии рекомбинантных рецепторов IFNg. Рекомбинантные растворимые формы человеческого рецептора IFNg и несколько антител к этим рецепторам описаны в ряде патентов США [16, 17]. Полученную генно-инженерными методами кДНК, кодирующую IFNg-связывающий белок, клонируют и экспрессируют в клетках Е.coli, при этом полученный продукт необходимо гликозилировать. Указанные рецепторы и антитела после дальнейшего изучения предполагается использовать в качестве антагонистов IFNg, в частности для лечения аутоиммунных заболеваний.

Анализ нуклеотидной последовательности генома вируса оспы обезьян (ВОО) выявил открытую рамку трансляции B9R, кодирующую белок, имеющий высокую степень гомологии с внеклеточным сегментом рецептора интерферона гамма [18]. Этот белок является одним из компонентов системы, позволяющей вирусу оспы обезьян эффективно преодолевать иммунные реакции организма человека.

Технической задачей изобретения является расширение спектра препаратов нового поколения, предназначенных для лечения заболеваний человека, связанных с гиперпродукцией интерферона гамма.

Поставленная задача решается путем создания рекомбинантного бакуловируса - продуцента растворимого IFNg-связывающего белка. Первым этапом в создании штамма-продуцента является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B9RZ, содержащей фрагмент генома вируса оспы обезьян, кодирующей аминокислотную последовательность IFNg-связывающего белка.

Целевая плазмида pFastBac-B9RZ (фиг.1) имеет размер 5628 п.н. и молекулярную массу 3.85 мДа и состоит из

- фрагмента генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 длиной 868 п.н., кодирующего IFNg-связывающий белок;

- векторной плазмиды pFastBac [19] длиной 4760 п.н., обеспечивающей сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса.

Рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате сайт-специфической транспозиции целевого фрагмента ДНК из донорной плазмиды pFastBac-B9RZ в бакуловирусный вектор (бакмиду), находящийся в E.coli [18], после заражения им клеток насекомых Sf21 продуцирует растворимый белок вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 - аналог рецептора IFNg человека.

В качестве фрагмента генома вируса оспы обезьян используют фрагмент ДНК длиной 868 п.н., полученный с помощью полимеразной цепной реакции. Матрицей для амплификации служит ДНК вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16. Олигонуклеотидные праймеры для амплификации IFNg-связывающего белка вируса оспы обезьян имеют следующую структуру:

1. 5′CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG 3′

2. 5′GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT 3′

В структуру праймеров 1 и 2 заложены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, соответственно (выделены в последовательности праймеров жирным курсивом). В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в бакмиду pMON14272 [18], используют плазмиду pFastBac [18], содержащую бакуловирусный специфический промотор pPolh для экспрессии белков в клетках насекомых, мини-Tn7-транспазон, гены устойчивости к ампициллину и гентамицину, полилинкер для клонирования целевых генов и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40. Бакмида pMON14272 содержит низкокопийный мини-F репликон, ген устойчивости к канамицину и фрагмент ДНК, кодирующий α-донорный пептид β-галактозидазы E.coli, и обеспечивает α-комплементацию при размножении в штамме E.coli DH10Bac^TM в присутствии хромогенного субстрата X-gal и индуктора IPTG.

Выбранная бакуловирусная система экспрессии обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию по сравнению с другими системами экспрессии.

Сущность изобретения заключается в том, что фрагмент ДНК, содержащий ген интерферон гамма-связывающего белка B9R вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, получается с помощью ПЦР из вирусного генома, затем полученный ген клонируется в донорной плазмиде pFastBac и путем сайт-специфической транспозиции в бактериальных клетках образуется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный вирус BvB9RZ, экспрессирующий указанный ген. Нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента приведена на фиг.2.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя бакуловирусов, но в отличие от векторного вируса имеет фенотип Lac^-.

Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного бакуловируса имеет длину около 140000 п.н. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 868 п.н. подтверждено с помощью метода ПЦР. При размножении рекомбинантного бакуловируса на культуре клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf21) его титр не отличается от титра, получаемого при размножении вируса, не содержащего в своем геноме чужеродных фрагментов ДНК.

Основным отличием штамма является его способность синтезировать IFNg-связывающий белок ВОО при инфицировании им культуры клеток насекомых Sf21.

Полученный штамм рекомбинантного бакуловируса BvB9RZ депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» за номером V-356 от 15.08.05

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:

Фиг.1 Физическая карта плазмиды pFastBac-B9RZ. За первый нуклеотид плазмиды принимается нуклеотид A межцистронной области фага f1; Tn7L, Tn7R - фрагменты транспозона Tn7; SV40polyA - сайт полиаденилирования вируса SV40; B9R - ген интерферон гамма-связывающего белка ВОО штамма Zaire-96-I-16; pPolh - промотор полиэдрина; Ori - сайт инициации репликации; Ap^r, Gm^r - маркеры устойчивости к ампициллину и гентамицину соответственно.

Фиг.2. Нуклеотидная последовательность гена B9R ВОО (штамм Zaire-96-I-16) и расположение специфических праймеров (показаны жирным шрифтом) на матрице. Сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, используемые при конструировании плазмиды интеграции pFastBac-B9RZ, показаны одинарным подчеркиванием. Инициирующий и терминирующий кодоны IFNg-связывающего белка ВОО показаны двойным подчеркиванием.

Фиг.3. Электрофоретический анализ в 1% агарозе ПЦР-фрагментов, содержащих интерферон гамма-связывающий белок ВОО, амплифицированных с помощью специфических праймеров с ДНК ВОО (дорожка 3), плазмиды pFastBac-B9RZ (дорожка 4) и с бакмиды bMON14272-B9RZ (дорожка 5). Дорожка 1 - маркеры длин «bp 100» («СибЭнзим», Россия), дорожка 2 - отрицательный контроль.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген IFNg-связывающего белка ВОО.

Реакцию амплификации проводят в пробирках Eppendorf в объеме 50 мкл в амплификаторах с горячей крышкой. Реакционная смесь содержит 10 мМ Tris-HCl pH 8.8, 50 мМ KCl, 2.5 мМ MgCl₂, 0.1% Tween 20, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dCTP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 10 пмоль каждого, 2 ед.а. Tth-полимеразы, 2-10 нг ДНК-матрицы.

Амплификацию вели в течение 30 циклов по следующей схеме:

Наличие амплифицированного продукта проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (фиг.3).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-B9RZ.

5-10 мкг плазмиды pFastBac [18] и 1-5 мкг амплифицированного продукта, соответствующего гену B9R ВОО, гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI в стандартных условиях. Полученные фрагменты выделяют электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией. 0.2 мкг вектора и 0.6 мкг фрагмента лигируют в стандартных условиях и полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки E.coli штамма XL-blue. Клеточные Ap^r-клоны выращивают при 37^оС в LB среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют по стандартной методике и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, структуру которой в районе встройки подтверждают определением нулеотидной последовательности методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвенаторе ABM PRISM^TM 310 (Perkin Elmer, США). Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают pFastBac-B9RZ.

Пример 3. Получение бакмиды pMON14272-B9RZ.

К 100 мкл компетентных клеток E.coli штамма DH10Bac^TM добавляют 1 нг плазмиды pFastBac-B9RZ. Полученную смесь инкубируют во льду в течение 30 мин, затем при 42^оС^{в течение 45 сек с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. Реакционную смесь разводят 1:10 LB-бульоном и подращивают на качалке при интенсивной аэрации при 37оС в течение четырех часов. Далее клетки высевают на селективную среду - LB-агар, содержащий 100 мкг/мл X-gal, 40 мкг/мл IPTG, 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в термостате при 37оС в течение суток. Клоны с фенотипом Lac- засевают в пробирки с 5 мл LB-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и выращивают при интенсивной аэрации при 37оСдо стационарной фазы. Культуру переносят в 1.5 мл пробирки Eppendorf, осаждают клетки центрифугированием в течение 40 сек при 14000g, удаляют среду. Процедуру добавления культуры, осаждения и удаления среды повторяют еще два раза. Осадок ресуспендируют в 0.3 мл раствора 1 (10 мМ ЭДТА, 15 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мкг/мл РНКазы), добавляют 0.3 мл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS) и инкубируют при комнатной температуре 5 мин. К смеси медленно добавляют 0.3 мл раствора 3 (3 М KAc pH 5.2). Инкубируют во льду 10 мин. Центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют 0.8 мл изопропанола, перемешивают и охлаждают при -20оС 5 мин, затем осаждают при 14000 g 15 мин. Осадок промывают два раза этанолом, высушивают, растворяют в 40 мкл буфера TE. Наличие в геноме бакмиды интегрированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью ПЦР. Полученную бакмидную ДНК pMON14272-B9RZ используют для трансфекции клеток насекомых линии Sf21.}

Пример 4. Трансфекция клеток насекомых Sf21 рекомбинантной бакмидной ДНК pMON14272-B9RZ и получение рекомбинантного вируса.

Клетки Sf21 засевают в лунки 6-луночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2×10⁶ клеток/лунку). На следующий день готовят два раствора: 10 мкл вирусной ДНК+100 мкл среды Грейса и 6 мкл реактива CellFECTIN фирмы LifeTechnologies (США)+100 мкл среды Грейса. Растворы смешивают, инкубируют при комнатной температуре 25 мин. В это время промывают монослой клеток два раза средой Грейса. К клеткам добавляют по 0.8 мл/лунку среды Грейса и 200 мкл приготовленного раствора. Инкубируют клетки при 28^оС в течение 5 ч. После этого отбирают среду и добавляют к клеткам по 2 мл среды Грейса с 10% эмбриональной сывороткой коров (ЭСК) (ООО «БиолоТ», Россия). Клетки инкубируют при 28^оС в течение 2-5 суток. Далее клетки ресуспендируют (интенсивным пипетированием), центрифугируют 5 мин при 5000 g и осветленный супернатант расфасовывают в стерильные пробирки. Титр вируса определяют следующим образом. К монослою клеток Sf21 добавляют 200 мкл разведения вируса и проводят адсорбцию в течение 60 мин при комнатной температуре. Далее готовят 2% легкоплавкую агарозу («Sigma», США) и смешивают ее в расплавленном виде со средой Грейса c 10% ЭСК в соотношении 1:1. Полученную среду охлаждают в термостате до 37^оС и добавляют по 2 мл на лунку, а после застывания добавляют по 2 мл на лунку среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют в термостате при 28^оС 5 суток. Далее добавляют по 2 мл на лунку краситель нейтральный красный, разведенный в среде Грейса с 10% ЭСК, в соотношении 1:20. Инкубируют при 28^оС в течение суток. Титр определяют путем подсчета окрашенных бляшек. Последний составляет 10⁷ БОЕ/мл. Суспензию рекомбинантного вируса хранят при -20^оС.

Пример 5. Заражение клеток насекомых Sf21 рекомбинантным вирусом.

200 мкл размороженного вирусного материала с титром 10⁷ наносят на монослой клеток насекомых Sf21 в матрасе для культивирования объемом 25 мл. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации добавляют 2 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют при 28 ^оС в течение 2-3 суток. Далее клетки ресуспендируют интенсивным пипетированием и центрифугируют 5 мин при 5000 g. Осветленный супернатант анализируют в тесте на способность ингибировать защитное действие hIFNg от вируса энцефаломиокардита мышей (ВЭМКМ) на культуре клеток легкого из эмбриона человека L68.

Пример 6. Определение биологической активности продукта экспрессии гена B9R.

Биологическую активность продукта экспрессии гена B9R определяют по его способности ингибировать защитное действие hIFNg от ВЭМКМ на культуре клеток легкого из эмбриона человека L68. Клетки линии L68 культивируют в 200 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной сыворотки коров до формирования клеточного монослоя на 75-85% поверхности лунки 96-луночного планшета. При достижении необходимой плотности клеток ростовую среду заменяют на 200 мкл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки коров, содержащей лизаты клеток Sf21, зараженных рекомбинантным бакуловирусом (100 мкл на лунку и последовательные двукратные разведения) и препарат hIFNg (4 нг/мл, что по данным предварительно проведенного определения защитного действия hIFNg соответствует трехкратной дозе, обеспечивающей 50% защитный эффект от действия ВЭМКМ). Планшеты инкубируют при 37^оС в СО₂-инкубаторе (концентрация СО₂ составляла 5%). В качестве контролей используют лунки планшета, содержащие клетки L68; клетки L68+VARV-IFNgBP; клетки L68+MPXV-IFNgBP; клетки L68+ВЭМКМ, дающее фоновое значение (0%) оптической плотности; клетки L68+hIFNg, дающее 100% оптической плотности; клетки L68+ВЭМКМ+hIFNg. Количество жизнеспособных клеток определяют через двое суток после заражения ВЭМКМ окрашиванием красителем нейтральным красным [20]. Измерение оптической плотности проводят на приборе Microplate Reader EL_X808 («BIO-TEK INSTRUMENTS, INC», США). Результаты выражают в процентном отношении выживших клеток относительно количества клеток в контрольных пробах. Каждая проба бралась в трех повторах, и среднее значение процента выживаемости высчитывают по формуле:

(ОП_{ВЭМКМ+IFNg+IFNgBP}-ОП_ВЭМКМ)/(ОП_IFNg-ОП_ВЭМКМ)×100%

По данным ингибирования защитного действия hIFNg от ВЭМКМ на культуре клеток L68 при концентрации в культуральной среде hIFNg 4 нг/мл 50% гибель клеток достигается при добавлении 100 мкл культуральной среды клеток Sf21, зараженных рекомбинантным вирусом BvB9RZ, со множественностью заражения 0,01 БОЕ на клетку на седьмые сутки инфекции.

Таким образом, получен рекомбинантный бакуловирус BvB9RZ, обеспечивающий экспрессию гена интерферон гамма-связывающего белка B9R вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16 в клетках насекомых линии Sf21. Полученный штамм может быть использован для разработки терапевтического препарата нового поколения для борьбы с заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией интерферона гамма.

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии. Из генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-1-16, методом ПЦР выделяется ген белка B9R, имеющий высокую степень гомологии с внеклеточным сегментом рецептора интерферона гамма, затем он клонируется в донорной плазмиде pFastBac, и путем сайт-специфической транспозиции конструируется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный штамм бакуловируса BvB9RZ, депонированный в НИИ ККМ под номером V-356, экспрессирующий указанный ген. Изобретение может найти применение как лекарственное средство нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией интерферона гамма (IFNg). 2 н.п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-B9RZ, несущая фрагмент генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, кодирующий растворимый интерферон гамма-связывающий белок, обеспечивающая сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса, размером 5628 п.н. и молекулярной массой 3,85 мДа, содержащая

ПЦР-фрагмент генома вируса оспы обезьян штамма Zaire-96-I-16, содержащий ген B9R, полученный с использованием праймеров

5′- CGGGATCCATGAGATATATTATAATTCTCGCAGTTTTG - 3′ и

5′- GGAATTCACCAGTGTATAATATGCAGTTTTATTTCAT - 3′,

кодирующий интерферон гамма-связывающий белок, фланкированный сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, размером 868 п.н.;

BamHI-EcoRI фрагмент векторной плазмиды pFastBac, размером 4760 п.н., включающий бакуловирусный промотор pPolh, мини-Tn7-транспазон и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40, обеспечивающий сайт-специфическую транспозицию ДНК гена B9R в геном бакуловируса;

генетические маркеры:

ген b-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину;

ген аминогликозидтрансферазы, определяющий устойчивость к гентамицину;

уникальные сайты рестрикции: BamHI (4033), EcoRI (4907).