РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PFASTBAC-G2R, СОДЕРЖАЩАЯ ФРАГМЕНТ ГЕНОМА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК-АНАЛОГ РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, И ШТАММ БАКУЛОВИРУСА BTRI67, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ РАСТВОРИМЫЙ РЕЦЕПТОР ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ Российский патент 2004 года по МПК C12N15/86 C12N15/28 C12N15/39 C12N7/01 A61K38/19 

Изобретение относится к биотехнологии и в частности к генетической инженерии, и может найти применение как лекарственное средство нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа).

Фактор некроза опухолей является многофункциональным цитокином, важнейшим регулятором развития воспалительных и иммунных реакций в ответ на вирусную инфекцию. Однако часто при заболеваниях человека, таких как ревматоидный артрит, менингит, септический шок, кахексия гиперпродукция ФНО-альфа играет патологическую роль [1, 2]. Успех при лечении этих заболеваний будет зависеть от того, насколько быстро и эффективно удастся снизить уровень ФНО-альфа в организме больного.

Известны препараты, способствующие понижению уровня эндогенного ФНО-альфа путем ингибирования его синтеза на стадиях транскрипции, трансляции или процессинга (Pentoxifylline, Rolipram, Chloropromazine, ингибиторы фосфодиэстераз, ингибиторы металлопротеаз) [1]. Другим подходом, используемым для лечения ревматоидного артрита как в экспериментальных моделях на мышах, так и больных людей, является использование антител к ФНО-альфа [3-5].

Еще одним способом лечения заболеваний, связанных с высоким уровнем ФНО-альфа в организме больных людей, является применение растворимых ФНО-связывающих белков - рецепторов этого цитокина. Указанные белки были выделены из мочи [6]. Однако процесс получения рецепторов ФНО-альфа из мочи достаточно трудоемок и не позволяет получить указанное лекарственное средство в достаточных количествах.

Наиболее близким к заявляемому подходу является использование в качестве средства анти-ФНО-терапии рекомбинантных рецепторов ФНО-альфа [4]. Известен препарат Etanercept (Enbrel), производимый американской биотехнологической компанией Immunex Corporation, представляющий собой химерный белок внеклеточного домена рецептора ФНО-альфа 11-го типа (Р75) размером 235 а.к. с константной частью Fc молекулы иммуноглобулина человека IgGl размером 232 а.к. [7, прототип].

Препарат Etanercept (Enbrel) дорогостоящ и малодоступен, хотя и был одобрен к применению для лечения ревматоидного артрита в средней и тяжелой степени заболевания. Однако постмаркетинговые исследования выявили серьезные побочные реакции, включая сепсис, в ряде случаев повлекшие смертельный исход [8].

Анализ нуклеотидной последовательности генома вируса натуральной оспы выявил открытую рамку трансляции G2R, кодирующую белок, имеющий высокую степень гомологии с внеклеточным сегментом рецептора ФНО-альфа II-го типа [9]. Этот белок является одним из компонентов системы, позволяющей вирусу натуральной оспы эффективно преодолевать иммунные реакции организма человека.

Технической задачей изобретения является расширение спектра препаратов нового поколения, предназначенных для лечения заболеваний человека, связанных с гиперпродукцией ФНО-альфа.

Поставленная задача решается путем создания рекомбинантного бакуловируса-продуцента растворимого аналога белка-рецептора ФНО-альфа (ФНОР) человека. Первым этапом в создании штамма-продуцента является конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-G2R, содержащей фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующей аминокислотную последовательность белка-аналога ФНОР человека.

Целевая плазмида pFastBac-G2R имеет размер 5836 п.о. и молекулярную массу 3.85 Мда и состоит из:

- фрагмента генома вируса натуральной оспы штамма India-1967 длиной 1084 п.о., кодирующего белок-аналог рецептора ФНО человека (ФНОР);

- векторной плазмиды pFastBac [10], длиной 4752 п.о., обеспечивающей сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в геном бакуловируса.

Рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате сайт-специфической транспозиции целевого фрагмента ДНК из донорной плазмиды pFastBac 1-G2R в бакуловирусный вектор (бакмиду), находящийся в E.coli [10], после заражения им клеток насекомых Sf21 продуцирует растворимый белок вируса натуральной оспы штамма Индия-1967 (ФНОР-ВНО) - аналог рецептора фактора некроза опухолей человека.

В качестве фрагмента генома ВНО используют фрагмент ДНК длиной 1084 п.о., полученный с помощью полимеразной цепной реакции. Матрицей для амплификации служит вирус натуральной оспы штамма India-1967. Праймеры для амплификации гена-аналога рецептора ФНО ВНО имеют следующую структуру:

В структуру праймера 1 и 2 заложены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI соответственно. В качестве плазмидного вектора, обеспечивающего сайт-специфическую транспозицию целевого фрагмента ДНК в бакмиду pMON14272 [10], используют плазмиду pFastBac [10], содержащую бакуловирусный специфический промотор pPolh для экспрессии белков в клетках насекомых, мини-Тn7-транспазон, гены устойчивости к ампициллину и гентамицину, полилинкер для клонирования целевых генов и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40. Бакмида pMON14272 содержит низкокопийный мини-F репликон, ген устойчивости к канамицину и фрагмент ДНК, кодирующий α-пептид гена β-галактозидазы Е.соli, и обеспечивает α-комплементацию при размножении в штамме E.coli DHl0Bac™ в присутствии хромогенного субстрата X-gal и индуктора IPTG.

Выбранная бакуловирусная система экспрессии обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию по сравнению с другими системами экспрессии.

Сущность изобретения заключается в том, что из генома ВНО штамма Индия-1967 методом ПЦР выделяется ген аналога рецептора ФНО человека G2R, затем он клонируется в донорной плазмиде pFastBac и путем сайт-специфической транспозиции конструируется рекомбинантная бакмида, которая используется для трансфекции клеток насекомых, в результате чего генерируется рекомбинантный вирус BTRi167, экспрессирующий указанный ген.

Нуклеотидная последовательность встроенного фрагмента приведена на фиг.1.

Штамм характеризуется следующими признаками

Морфологические признаки. Штамм обладает свойствами типичного представителя бакуловирусов, но в отличие от векторного вируса имеет фенотип Lac^-.

Физиолого-биохимические характеристики и культуральные свойства штамма. ДНК рекомбинантного бакуловируса имеет длину около 140000 п.о. Наличие в его геноме целевой вставки длиной 1084 п.о подтверждено с помощью метода ПЦР. При размножении рекомбинантного бакуловируса на культуре клеток насекомых Spodoptera frugiperda (Sf21) его титр не отличается от титра, получаемого при размножении вируса, не содержащего в своем геноме чужеродных фрагментов ДНК.

Основным отличием штамма является его способность синтезировать белок-аналог рецептора ФНО человека при инфицировании им культуры клеток насекомых Sf21. Уровень синтеза целевого белка составляет 5×10⁵ ЕА/мл по данным теста ингибирования цитолитической активности ФНОα на культуре клеток фибробластов мыши L929 [2].

Полученный штамм рекомбинантного бакуловируса BTRi67 депонирован в коллекции микроорганизмов Государственного Научного Центра Вирусологии и Биотехнологии “Вектор” за номером VB-02 от 20 ноября 2001 г.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений.

Фиг.1 Нуклеотидная последовательность гена G2R ВНО (штамм India-1967) и расположение специфических праймеров (показаны жирным шрифтом) на матрице. Сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRJ, используемые при конструировании плазмиды интеграции pFastBac-G2R, и сайт эндонуклеазы рестрикции Dral показаны одинарным подчеркиванием. Инициирующий и терминирующий кодоны гена-аналога рецептора ФИО человека показаны двойным подчеркиванием.

Фиг.2 Физическая карта плазмиды pFastBac-G2R. За первый нуклеотид плазмиды принимается нуклеотид А межцистронной области фага fl; Tn7L, Tn7R - фрагменты транспозона Tn7; SV40polyA-сайт полиаденилирования вируса SV40; G2R - ген аналога ФНО-рецептора ВНО Индия-1967; pPolh - промотор полиэдрина; Ori-сайт инициации репликации; Ар^r Gm^r - маркеры устойчивости к ампициллину и гентамицину соответственно.

Фиг.3. Электрофоретический анализ в 1% агарозе ПНР-фрагментов, содержащих ген аналога ФНО-рецептора, амплифицированных с помощью специфических праймеров с ДНК ВНО (дорожка 1) и с бакмиды bMON14272-G2R (дорожка 2), и BamHI+EcoRI-гидролизатов рекомбинантных ДНК pFastBac-G2R и pFastBac (дорожки 3 и 4 соответственно). Дорожка М – AvaII - гидролизат ДНК фага λ.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.

Пример 1. Способ амплификации фрагмента ДНК, содержащего ген аналога рецептора ФНО ВНО.

Реакцию амплификации проводят в пробирках Eppendorf под слоем минерального масла в объеме 50 мкл. Реакционная смесь содержит 10 мМ Tris-HCl рН 8.8, 50, мМ KСl, 2.5 мМ MgCl₂, 0.1% Tween 20, 0.2 мМ dATP, 0.2 мМ dCTP, 0.2 мМ dGTP, 0.2 мМ dTTP, олигонуклеотидные праймеры в количестве 40 пмол каждого, 2 ед.а. Tth-полимеразы, 2-10 нг ДНК-матрицы. Амплификацию ведут в течение 18 циклов по схеме:

1. 95° 3 мин

2. 95° 45 с

55° 45 с

72° 45 с

3. 95° 5 мин

Далее в реакционную смесь добавляют хлороформ, отбирают водную фазу и переносят в чистую пробирку. Наличие амплифицированного продукта проверяют с помощью электрофореза в 1% агарозном геле (фиг.3).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pFastBac-G2R.

5-10 мкг плазмиды pFastBac [10] и 1-5 мкг амплифицированного продукта, соответствующего гену G2R ВНО, гидролизуют эндонуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI в стандартных условиях. Полученные фрагменты выделяют электрофорезом в 1% агарозном геле с последующей элюцией. 0.2 мкг вектора и 0.6 мкг фрагмента лигируют в стандартных условиях и полученной лигазной смесью трансформируют компетентные клетки Е.соli штамма XL-blue. Клеточные Ар^r-клоны выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Рекомбинантную плазмидную ДНК выделяют по стандартной методике и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции BamHI и ЕсоМ. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, структуру которой в районе встройки подтверждают определением нулеотидной последовательности методом терминации синтезируемой цепи на автоматическом секвенаторе АВМ PRISM™ 310 (Perkin Elmer, США) (фиг.1). Полученную таким образом целевую плазмиду обозначают pFastBac-G2R.

Пример 3. Получение бакмиды рМОМ14272-02Р.

К 100 мкл компетентных клеток Е.соli штамма DH10Bac™ добавляют 1 нг плазмиды pFastBac-G2R. Полученную смесь инкубируют во льду в течение 30 мин, затем при 42°C в течение 45 с с последующим охлаждением во льду в течение 2 мин. Реакционную смесь разводят 1:10 LB-бульоном и подращивают на качалке при интенсивной аэрации при 37°C в течение 4 ч. Далее клетки высевают на селективную среду - LB-агар, содержащий 100 мкг/мл X-gal, 40 мкг/мл IPTG, 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, и инкубируют в термостате при 37°С в течение суток. Клоны с фенотипом Lac^- засевают в пробирки с 5 мл LB-бульона, содержащего 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и выращивают при интенсивной аэрации при 37°C до стационарной фазы. Культуру переносят в 1.5 мл пробирки Eppendorf, осаждают клетки центрифугированием в течение 40 с при 14000 g, удаляют среду. Процедуру добавления культуры, осаждения и удаления среды повторяют еще два раза. Осадок ресуспендируют в 0.3 мл раствора 1 (10 мМ ЭДТА, 15 мМ Tris-HCl pH 8.0, 100 мкг/мл РНКазы), добавляют 0.3 мл раствора 2 (0.2 М NaOH, 1% SDS) и инкубируют при комнатной температуре 5 мин. К смеси медленно добавляют 0.3 мл раствора 3 (3 М КАс, pH 5.2). Инкубируют во льду 10 мин. Центрифугируют при 14000 g в течение 10 мин. Супернатант переносят в чистую пробирку, добавляют 0.8 мл изопропанола, перемешивают и охлаждают при -20°С 5 мин, затем осаждают при 14000 g 15 мин. Осадок промывают два раза этанолом, высушивают, растворяют в 40 мкл буфера ТЕ. Наличие в геноме бакмиды интегрированного фрагмента ДНК подтверждают с помощью ПЦР. Полученную бакмидную ДНК pMON14272-G2R используют для трансфекции клеток насекомых линии Sf21.

Пример 4. Трансфекция клеток насекомых Sf21 рекомбинантной бакмидной ДНК pMON14272-G2R и получение рекомбинантного вируса.

Клетки Sf21 засевают в лунки 6-луночного планшета из расчета, чтобы на следующий день был монослой (2×10 клеток/лунку). На следующий день готовят два раствора: 10 мкл вирусной ДНК + 100 мкл среды Грейса и 6 мкл реактива CellFECTIN фирмы LifeTechnologies (США) + 100 мкл среды Грейса. Растворы смешивают, инкубируют при комнатной температуре 25 мин. В это время промывают монослой клеток два раза средой Грейса. К клеткам добавляют по 0.8 мл/лунку среды Грейса и 200 мкл приготовленного раствора. Инкубируют клетки при 28°С в течение 5 ч. После этого отбирают среду и добавляют к клеткам по 2 мл среды Грейса с 10% эмбриональной сывороткой коров (ЭСК) (ООО “БиолоТ”, Россия). Клетки инкубируют при 28°С в течение 2-5 суток. Далее клетки ресуспендируют (интенсивным пипетированием), центрифугируют 5 мин при 5000 g и осветленный супернатант расфасовывают в стерильные пробирки.

Титр вируса определяют следующим образом. К монослою клеток Sf21 добавляют 200 мкл разведения вируса и проводят адсорбцию в течение 60 мин при комнатной температуре. Далее готовят 2% легкоплавкую агарозу (Sigma, США) и смешивают ее в расплавленном виде со средой Грейса с 10% ЭСК в соотношении 1:1. Полученную среду охлаждают в термостате до 37°С и добавляют по 2 мл на лунку, а после застывания добавляют по 2 мл на лунку среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют в термостате при 28°С 5 суток. Далее добавляют по 2 мл на лунку краситель нейтральный красный, разведенный в среде Грейса с 10% ЭСК, в соотношении 1:20. Инкубируют при 28°С в течение суток. Титр определяют путем подсчета окрашенных бляшек. Последний составляет 10⁷ БОЕ/мл. Суспензию рекомбинантного вируса хранят при -20°С.

Пример 5. Заражение клеток насекомых Sf21 рекомбинантным вирусом.

200 мкл размороженного вирусного материала с титром 10⁷ наносят на монослой клеток насекомых Sf21 в матрасе для культивирования объемом 25 мл. Инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации добавляют 2 мл среды Грейса с 10% ЭСК. Инкубируют при 28°С в течение 2-3 суток. Далее клетки ресуспендируют интенсивным пипетированием и центрифугируют 5 мин при 5000 g. Осветленный супернатант анализируют в тесте на ингибирование цитолитической активности ФНОα человека на культуре клеток фибробластов мыши L929.

Пример 6. Определение биологической активности продукта экспрессии гена G2R.

В лунки 24-луночного планшета засевают клетки мышиных фибробластов L929 в среде DMEM с 10% ЭСК (посевная доза 2×10⁵ клеток/лунку). На следующий день разводят ФНОα (производства ГНЦ ВБ “Вектор”, 5×10⁶ МЕ/мг) до концентрации 0.2 мкг/мл в среде DMEM с 2% ЭСК. Тестируемый раствор разводят средой DMEM с 2% ЭСК в 5, 10, 20, 40 и 80 раз. К 100 мкл каждого разведения добавляют 100 мкл раствора ФНОα (0.02 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля используют раствор ФНОα (0.01 мкг/мл). Планшеты инкубируют в СО₂-инкубаторе (концентрация СО₂ 5%) при 37°С в течение 18-20 ч. Клетки окрашивают в течение 10 мин добавлением 250 мкл/лунку 0.005%-ным кристаллическим фиолетовым в 20%-ном этаноле. После удаления краситель клетки высушивают 15 мин при комнатной температуре, после чего краситель экстрагируют из клеток 96%-ным этанолом (0.6 мл/лунку) в течение 15 мин и измеряют оптическую плотность полученных растворов при длине волны 565 нм. По оптической плотности определяют процент нелизировавшихся клеток. Специфическую анти-ФНО активность определяют по разнице между начальной и несвязанной концентрациями ФНОα. По данным ингибирования цитопатического дествия ФНОα человека на культуре клеток фибробластов мыши L929 биологическая активность целевого продукта в лизатах инфицированных клеток составляет 5×10⁵ ЕА в 1 мл культуральной среды клеток Sf21, зараженных рекомбинантным вирусом BTRi67.

Таким образом, получен рекомбинантный бакуловирус BTRi67, обеспечивающий экспрессию гена G2R вируса натуральной оспы штамма Индия-1967 - белка-аналога рецептора ФНОα человека в клетках насекомых линии Sf21. Полученный штамм может быть использован для разработки терапевтического препарата нового поколения для борьбы с заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей.

Литература

1. Feldmann M., Brennan, F.M. and Maini, R.N. // Annu. Rev. Immunol., 1996, V.14, P.397-440.

2. Eigler A., Sinha В., Hartmann G. and Endres S. // Immunol. Today. 1997. V.18. P.487-492.

3. Tijhuis G.J., van de Putte L.V., Breedveld F.C. // Nederlands Tijdschrift voor Geneerskunde, 2001, V.145(39), P.1880-1885.

4. F.C.Williams R.O., Ghrayeb J., Feldmann M. and Maini, R.N // Immunology, 1995, V.84, P.433-439.

5. Патент США №5656272, кл. А 61 К 39/395, 1997 г.

6. Патент Великобритании №2218101, кл. А 61 К 3 7/02, 1989 г.

7. Патент США №6015557395, кл. А 61 К 39/395, 1999 г.

8. Medexpress, август 1999 г. // “Энбрелл небезопасен”.

9. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Тотменин А.В., Маренникова С.С., Колыхалов А.А., Фролов И.В., Чижиков В.Е., Гуторов В.В., Гашников П.В., Беланов Е.Ф., Белавин П.А., Ресенчук С.М., Шелухина Э.М., Нетесов С.В., Анжапаридзе О.Г., Сандахчиев Л.С. // Молекулярная биология, 1992, Т.26 (5), С.1099-1115.

10. Luckow, V.A., Lee, S.C., Barry, G.F. and Olins, P.O. // J.Virol., 1993, V.67, 4566.

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано для получения лекарственного средства нового поколения для борьбы с тяжелыми заболеваниями человека, связанными с гиперпродукцией фактора некроза опухолей-альфа (ФНО-альфа). Методом ПЦР выделяют ген G2R, кодирующий белок-аналог рецептора ФНО-альфа человека, из генома вируса натуральной оспы штамма Индия-1967. Клонируют его в донорной плазмиде pFastBac, и путем сайт-специфической транспозиции конструируют рекомбинантную бакмиду. Осуществляют трансфекцию клеток насекомых рекомбинантной бакмидой для генерации рекомбинантного бакуловируса BTRi67, экспрессирующего ген G2R в клетках насекомых линии Sf21. Изобретение обеспечивает высокий уровень синтеза целевого продукта и его правильную посттрансляционную модификацию. 2 н. п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-G2R, несущая фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующий растворимый белок-аналог рецептора ФНОб человека размером 5836 п.н. и молекулярной массой 3,85 Мда, содержащая:

ПЦР-фрагмент генома вируса натуральной оспы штамма Индия-1967, содержащий ген G2R, полученный с использованием праймеров

5` - GTGATTACTACATTATGGATCCATGAAGTCCGTA - 3` и

5` - TTTACGAGAAATTAATTATTGAATTCATTATTTATGGGT - 3`,

кодирующий белок-аналог рецептора фактора некроза опухолей человека (ФНОР), фланкированный сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI, размером 1084 п.н.;

BamHI-EcoRI фрагмент векторной плазмиды pFastBac, размером 4752 п.н., включающий бакуловирусный промотор pPolh, мини-Тn7-транспозон и сигнал для полиаденилирования вируса SV-40, обеспечивающий сайт-специфическую транспозицию ДНК гена G2R в геном бакуловируса; генетические маркеры: ген в-лактамазы, определяющий устойчивость к ампициллину; ген аминогликозидтрансферазы, определяющий устойчивость к гентамицину; уникальные сайты рестрикции: BamHI (4032), DraI (4801), EcoRI (5116).