УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ СТРУКТУР В ХРУСТАЛИКЕ ГЛАЗА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2008 года по МПК G01N1/30 

Изобретение относится к медицине, в частности к гистологии и офтальмологии, и нацелено на использование в практике научно-исследовательских работ с использованием экспериментальных животных.

Катаракта (помутнение хрусталика) относится к числу заболеваний, для которых у современной практической медицины нет надежных способов профилактики и лечения. Истинная причина, инициирующая процесс катарактогенеза, до настоящего времени не установлена. В последние годы появилась тенденция к изучению обменных процессов хрусталика с точки зрения структурной и функциональной организации мембран его клеток - рецепторное обеспечение, кальциевая проницаемость и механизмы ее регулирования, закономерности пространственной организации клеточных мембран. Принимая во внимание крайнюю малодоступность интактного материала тканей человеческого хрусталика, наиболее ценным источником тканей хрусталика по-прежнему остаются лабораторные животные.

Цель: значительно повысить качество морфологических исследований хрусталика глаза экспериментальных животных.

Сущность предлагаемого способа заключается в предварительной витально-суправитальной обработке тканей экспериментальных животных при помощи раствора метиленового синего, которая предшествует общегистологической окраске срезов хрусталика гематоксилин-эозином.

Положительный эффект: упрощение условий исследования, снижение затрат денежных средств и рабочего времени в повседневных научно-исследовательских работах, значительное повышение качества морфологических исследований хрусталика глаза.

Наиболее близким к предложенному способу является гистологический способ выявления межклеточных границ в двухмерных тканях (Кондаков И.К. // Патент RU № 2092841, МПК 6 G01N 33/48). Прототип заключается в следующем: образцы исследуемой ткани иссекают, отмывают и предварительно фиксируют в смеси, состоящей из 40%-ной глюкозы и 10%-ного формалина в соотношении 1:12, в течение 1 часа. Затем проводят импрегнацию межклеточных границ в 0,1% растворе азотнокислого серебра (1 мин), вторично фиксируют образцы ткани в 10% растворе нейтрального формалина (12 часов) и отмывают проточной водой (1 час). Выявление продукта импрегнации осуществляют с помощью фотоматериалов (в стандартном фотопроявителе с последующим закреплением в фотофиксаже).

Известный способ выявления межклеточных границ в двухмерных тканях, упомянутый выше, не может получить широкое распространение в повседневных исследовательских работах с использованием экспериментальных животных в связи с его значительной дороговизной (азотнокислое серебро, фотопроявители, фотофиксаторы), трудоемкостью (многоэтапность, многокомпонентность) и большими затратами рабочего времени (свыше 12 часов).

Следующим наиболее распространенным методом окраски тканей глаза, в том числе хрусталика, является метод общегистологической окраски гематоксилином и эозином (Микроскопическая техника: Руководство // Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.: ил.), который заключается в следующем: срез хрусталика полностью покрывают раствором гематоксилина на 5 мин, отмывают лишний краситель проточной водой 1-2 мин под контролем микроскопа, излишки влаги удаляют фильтровальной бумагой, затем покрывают срез хрусталика раствором эозина на 1 мин, вновь промывают проточной водой 1-2 мин, высушивают, монтируют через спирты, карбол-ксилол, ксилол, бальзам).

Этот метод, имея такие преимущества, как дешевизна и простота использования, не может удовлетворить требования современных морфологических исследований, так как срезы хрусталика, окрашенные по этой методике, демонстрируют недостаточную информативность - выявляют лишь отдельные детали строения ядра клеток хрусталика, в то время как клеточные мембраны совершенно не визуализируются (фиг.1, 2).

Задача изобретения: разработать не дорогой, не трудоемкий и простой в использовании способ гистологической окраски, который позволит значительно повысить качество изображения клеточных структур на срезах хрусталика глаза экспериментальных животных.

Предложен способ предварительной витально-суправитальной обработки тканей хрусталика глаза экспериментальных животных при помощи раствора метиленового синего, которая предшествует общегистологической окраске срезов хрусталика гематоксилин-эозином. При осуществлении способа готовят необходимое разведение раствора красителя, который для достижения витального окрашивания вводят в кровеносное русло экспериментального животного, а с целью суправитального докрашивания хрусталика его покрывают раствором красителя и помещают в термостат, далее готовят парафиновые срезы и проводят общегистологическую окраску гематоксилин-эозином.

Предлагаемый способ позволяет упростить условия исследования, снизить затраты денежных средств и рабочего времени в повседневных научно-исследовательских работах с использованием экспериментальных животных, а также значительно повысить качество морфологических исследований хрусталика глаза.

Изобретение обладает новизной, соответствует требованиям изобретательского уровня и может найти широкое применение в практике повседневных научных исследований с использованием экспериментальных животных.

Предложенный способ осуществляется следующим образом:

- готовят 1% концентрированный раствор метиленовой сини с использованием жидкости Рингера-Локка;

- для окраски разводят приготовленный концентрированный 1% раствор метиленовой сини жидкостью Рингера-Локка в следующем соотношении: 1,5 ml 1% раствора метиленовой сини на 100 ml жидкости Рингера-Локка;

- производят инъекцию разведенного раствора красителя в кровеносное русло экспериментального животного в течение 40-50 мин - в результате происходит витальная окраска тканей хрусталика;

- под наркозом проводят энуклеацию глазного яблока экспериментального животного;

- для суправитального докрашивания хрусталик энуклеированного глазного яблока помещают в чашке Петри на 1 час в термостат при температуре +37°С; в течение указанного времени на поверхность хрусталика каплями наносят разведенный раствор метиленовой сини;

- далее хрусталик фиксируют в 10% растворе формалина;

- готовят парафиновые срезы и проводят общегистологическую окраску гематоксилином и эозином по стандартной, упомянутой выше, методике.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими фотографиями. Срезы хрусталика, окрашенные гематоксилин-эозином без предварительного применения данного метода, демонстрируют недостаточную информативность, так как выявляют лишь детали строения ядра клетки, в то время как клеточные мембраны совершенно не визуализируются (фиг.1, 2).

Срезы, полученные с предварительным использованием описываемой методики, демонстрируют детально окрашенные хрусталиковые эпителиальные клетки и клетки-волокна (фиг.3, 4). Интенсивное окрашивание клеток сочетается с отчетливым выявлением их структурных элементов. Четко контурируются клеточные мембраны, что позволяет с большей достоверностью проводить исследования рецепторной обеспеченности хрусталика, особенностей его цитоархитектоники, изменений морфологического и функционального состояния клеток хрусталика в процессе его эмбрионального развития и в условиях катарактогенеза. Предлагаемый способ позволяет более детально характеризовать морфофункциональное состояние клеточного ядра в связи с тем, что срезы четко демонстрируют контуры ядра, форму и величину ядрышка, степень конденсации хроматина и количество ядерного сока. Между периферическим и околоядрышковым хроматином хорошо видны довольно крупные глыбки конденсированного хроматина, разбросанные в обильно представленном ядерном соке. В экваториальных эпителиальных клетках хрусталика более четко просматриваются фигуры митоза (зона роста хрусталика), что значительно повышает качество и достоверность исследований, направленных на изучение процессов роста хрусталика в условиях его нормы (эмбриогенез) и патологии (катарактогенез).

В таблице приведены преимущества использования предложенного способа по сравнению с известными.

ТаблицаКонтрольные показателиСпособ КондаковаСпособ окраски гем.-эозиномСпособ предлагаемыйЗатраты денежных средств+++++
(максимальные)+
(минимальные)++Трудоемкость (затраты рабочего времени)+++++
(свыше 12 часов)+
(около 30 мин.)++
(2 часа)Качество изображения на гистологических срезах+++
(хорошее)+
(неудовлетв.)+++++
(отличное)Целесообразность применения на лабораторных животных-
(не целесообразно)++++++++

ПОДПИСИ К чертежам

Фиг.1. Сагиттальный срез глазного яблока. Окраска гематоксилин-эозином.

1 - отростки цилиарного тела; 2 - хрусталик; 3 - ядра переднего эпителия хрусталика; 4 - ядра экваториальных клеток-волокон. Ув.: об. 20, ок. 15.

Фиг.2. Сагиттальный срез хрусталика. Окраска гематоксилин-эозином.

1 - капсула хрусталика; 2 - ядра эпителиальных клеток хрусталика; 3 - ядра экваториальных клеток-волокон. Ув.: об. 90, ок. 15.

Фиг.3. Сагиттальный срез хрусталика. Окраска гематоксилин-эозином с предварительным использованием витально-суправитального окрашивания метиленовой синью.

1 - капсула хрусталика; 2 - эпителиальные клетки хрусталика (зона роста); 3 -хрусталиковые клетки-волокна. Ув.: об. 40, ок. 15.

Фиг.4. Сагиттальный срез хрусталика. Окраска гематоксилин-эозином с предварительным использованием витально-суправитального окрашивания метиленовой синью.

1 - капсула хрусталика; 2 - эпителиальные клетки хрусталика (зона роста); 3 - периферические безъядерные отделы клеток-волокон. Ув.: об. 90, ок. 15.

Способ относится к области медицины. Способ включает предварительную витально-суправитальную обработку тканей экспериментальных животных при помощи раствора метиленового синего, которая предшествует общегистологической окраске срезов хрусталика гематоксилин-эозином. При осуществлении способа готовят необходимое разведение раствора красителя, который для достижения витального окрашивания вводят в кровеносное русло экспериментального животного, а с целью суправитального докрашивания хрусталика его покрывают раствором красителя и помещают в термостат, далее готовят парафиновые срезы и проводят общегистологическую окраску гематоксилин-эозином. Способ позволяет с большей достоверностью проводить детальное выявление структурных элементов клеток хрусталика глаза. 1 табл., 4 ил.

Способ выявления межклеточных границ и клеточных структур хрусталика глаза лабораторных животных путем последовательной обработки срезов хрусталика гематоксилином и эозином, отличающийся тем, что предварительно производят прижизненную окраску хрусталика введением в кровеносное русло животного раствора метиленовой сини в течение 40-45 мин с последующим докрашиванием хрусталика, извлеченного из глаза, в течение 1 ч раствором метиленовой сини при температуре +37°С в условиях термостата.