КОМПОЗИЦИОННЫЙ НАНОРАЗМЕРНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ АДСОРБЦИИ И ДЕСОРБЦИИ ДНК/РНК Российский патент 2008 года по МПК G01N33/533 C12N15/10 C12Q1/68 

Изобретение относится к биологии и медицине, а именно к созданию высокоэффективных систем выделения нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) для диагностики инфекционных заболеваний.

Такие системы должны отвечать следующим требованиям:

- Метод, основанный на использовании систем, должен быть чувствительным, простым и быстрым, давать воспроизводимые результаты, не требовать специального оборудования и глубокого знания биохимии. В результате его применения нуклеиновые кислоты, в частности ДНК/РНК, должны быть отделены от серии биологических субстанций, взятых в установленном порядке.

- Экстрагированные из раствора нуклеиновые кислоты (ДНК/РНК) должны быть достаточно чистыми для дальнейших диагностических манипуляций. При этом не допускаются случаи перехода нуклеиновых кислот от одного образца к другому.

- При использовании диагностических систем риски заражения персонала инфекционными заболеваниями должны быть сведены к минимуму.

Известны легко реагирующие магнитные неорганические частицы для иммобилизации биологических субстанций, в частности энзимов, и последующее использование магнитных свойств этих частиц для сепарации, впервые предложенные в [Robinson et. al. The properties of magnetic supports in relation to immobilized enzyme reactions. Biotechnology and Bioengineering, 1973, vol.XV, pp.603-606].

Известны легко реагирующие магнитные частицы вещества, выбранные из группы: Fe₃O₄, СоО, NiO, Mn₂О₃, мелкодисперсные частицы железа или никеля для определения концентрации дигоксина в растворе [US Patent 3933997, 1974, МПК А61К 043/00]. При этом средний размер частиц составляет около 1,5 или 10 микрон, а удельная поверхность равна по крайней мере 10 м²/г.

Известны магнитные частицы никеля [US Patent 4018886, 1975, МПК G01N 021/46] размером от коллоидального до 10 микрон, используемые для диагностики присутствия или отсутствия определенных белков в биологических жидкостях.

Известны ферромагнитные, ферримагнитные и суперпарамагнитные материалы, а также другие магнитные материалы, включая оксиды, такие, например, как ферриты, перовскиты, хромиты и магнетоплюмбиты, в виде частиц размером от коллоидального до 10 микрон, покрытые слоем антител. Эти материалы используют для сортирования и разделения вирусов, бактерий, клеток из бактериальных, вирусных популяций или культуры клеток [US Patent 3970518, 1975, МПК G01N 027/00].

Известны [US Patent 4115534, 1977, МПК G01N 033/16] ферромагнитные материалы, выбранные из группы: BaFe₁₂O₁₉, Fe₃O₄, СоО, NiO, Mn₂О₃, CoMnP, частицы Fe или Ni с максимальным размером в интервале от 50 до 400 микрон для определения субстанций, например в лекарствах, гормонах, витаминах и энзимах.

Известны [US Patent 4141687, 1977, МПК G01N 033/16] магнитные материалы, выбранные из группы: железо, магнитные оксиды железа, никель, кобальт или оксид хрома, для автоматического иммуноанализа жидких субстанций человека или животных, причем основной интерес представляют антигены, антитела или комплексы антиген-антитело.

Известны [US Patent 4582622, 1984, МПК H01F 001/00] магнитные материалы - ферриты, имеющие формулу MFe₂O₄, где М - Fe, Mn, Cu, Ni и Со. Они предназначены для иммобилизации протеинов.

Известны магнитные материалы [ЕР 0240770, 1987, МПК G01N 33/553] на основе диоксида хрома, покрытого оксидом кремния или оксидом алюминия, при этом оксид кремния может содержать от 0,04 до 6% В₂O₃, используемые для разделения биологических субстанций по свойствам или гетерогенного иммуноанализа.

Известен магнитоуправляемый сорбент (МУС-Б) для обработки крови, представляющий собой коллоидные частицы магнетита (Fe₃О₄) размером в интервале 6-12 нм [патент UA №24322 А, 1998, МПК A61N 2/00; патент UA 24183 A, 1998, МПК A61N 2/00].

Известна матрица иммуносорбента [патент РФ 2140084, 1999, МПК⁶ G01N 33/551] в виде частиц размером 2-5 мкм, содержащая железо, оксид кремния и оксид титана, для диагностики инфекционных заболеваний, в частности для связывания микобактерий.

Изучение источников, упомянутых выше, показало, что в них полностью отсутствует информация о сорбции и десорбции ДНК/РНК.

Известны материалы, способные адсорбировать ДНК, например Silica, стеклянные частицы или диатомовая одноклеточная водоросль [Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., et. al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol., 1990 march, vol.28 (3), pp.495-503]. При этом для лизиса клеток используют сильный хаотропный агент - гуанидин тиоцитоната (GuSCN), а затем ДНК сорбируют на носителях, указанных выше, и отмывают. Недостатком этих материалов являются потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества сорбента могут ингибировать ДНК. Способность к адсорбции и десорбции ДНК этих материалов составляет не более 80%. Кроме того, эти материалы не обладают магнитными свойствами, позволяющими резко уменьшить время осаждения биологической субстанции, а диатомовая водоросль имеет короткий срок службы.

Известен материал на основе мелких частиц стекла, используемый для экстракции ДНК для последующей постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) при диагностике туберкулеза [Владимирский М.А., Шипина Л.К., Филиппов В.И. и др. Применение магнитных наночастиц в диагностике и лечении туберкулеза. http://magneticliquid.narod.ru/medicine/008.htm от 02.11.2005]. Недостатком метода, использующего этот материал, является его низкая чувствительность, связанная с тем, что в получаемых образцах ДНК содержатся ингибиторы ПЦР. Присутствие в пробе большого количества неспецифической ДНК существенно затрудняет определение результатов ПЦР при проведении гельэлектрофореза из-за размазывания (шмера) на поверхности геля [Владимирский М.А., Шипина Л.К., Филиппов В.И. и др. Применение магнитных наночастиц в диагностике и лечении туберкулеза. http://magneticliquid.narod.ru/medicine/008.htm от 02.11.2005].

Известен материал в виде суперпарамагнитных наночастиц магнетита (Fe₃О₄), модифицированного покрытием из многовалентного агента катиона-полиэтиленимина (PRI), используемый для очистки плазмидной ДНК от бактериальных клеток [Chiang C.I., Sung C.S., Wu T.F., et. al. Application of superparamagnetic nanoparticles in purification of plasmid DNA from bacterial cells. Journal Chromatogr. В Analyt. Technol. Biomed. Life Sci., 2005; 822 (1-2): 54-60]. Недостатком этого материала является сложная технология модификации наночастиц.

Известен магнитный материал в виде трехслойных композитных наночастиц, способных связывать ДНК [Stoeva S.I., Huo F., Lee J.S., Mirkin C.A. Three-layer composite magnetic nanoparticles probes for DNA. Am. Chem. Soc., 2005, №9; 127 (44): 15362-3]. Частицы представляют собой ядро из SiO₂, окруженное слоем наночастиц Fe₃О₄ размером 15 нм, вокруг которых нанесен слой золота. Недостатком этого материала является сложная технология его приготовления и использование дорогого золота в виде наночастиц размером 1-3 нм.

Наиболее близким по достигаемому результату является материал - частицы оксида железа (Fe₂O₃) со средним размером 29 нм, активированный вектором «HVJ-E (специальный вирус, открытый в Японии и способный переносить плазмидную ДНК и олигонуклеотиды) [Morishita N., Nakagami H., Morishita R. et. al. Magnetic nanoparticles with surface modification enhanced gene delivery of HVJ-E vector. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, Ser.9; 334 (4); 1121-6]. Недостатком этого материала является сложность получения вируса HVJ-E и необходимость предварительного нанесения на поверхность оксида железа (Fe₂O₃) катионического поверхностного заряда, нужного для дальнейшего переноса клеточных структур.

Известный материал (наночастицы Fe₂O₃) по нашим данным обеспечивает адсорбцию и десорбцию ДНК на уровне 61 и 98% соответственно, в результате эффективность обратимого связывания ДНК составляет около 60% (табл.).

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение удельной емкости адсорбции и десорбции ДНК/РНК при одновременно заданной намагниченности композиционного материала, в частности, необходимой для магнитного осаждения.

Технический результат достигается использованием в качестве наноразмерного композиционного материала для адсорбции и десорбции ДНК/РНК наночастиц с размерами в интервале 3÷20 нм, состоящих из 80÷99,5 мас.% оксида олова (SnO₂) и 20÷0,5 мас.% вещества, выбранного из группы: Fe, Fe₂O₃, Fe₃O₄ или их смеси.

Магнитоуправляемость композиционного материала определяется содержанием вещества, выбранного из группы: Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄ или их смеси. Увеличение содержания этих веществ выше 20% приводит к агрегации наночастиц, излишней намагниченности материала и уменьшает адсорбцию и десорбцию ДНК, которая для оксида железа Fe₂О₃ или его смеси с Fe₃O₄ всегда значительно меньше, чем для предложенного композиционного материала (табл.). Уменьшение содержания вещества из группы: Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄, их смеси в составе композиционного материала ниже 0,5% приводит к заметному ухудшению магнитоуправляемости материала в процессе магнитного осаждения.

Использование оксида олова SnO₂ с тетрагональной решеткой обеспечивает высокую удельную загрузку (до 95-98%) ДНК и последующую эффективную десорбцию ДНК, составляющую 99-100% при эффективности обратимого связывания 98-99%.

Для получения наноструктурного композиционного материала использован механохимический синтез из солевых систем в присутствии инертного разбавителя [ЕР 0854765; 1998; WO 97/07917, 1996; МПК⁶ B22F 9/16, 9/20, WO 9959754, 1998, B22F 9/04; US Patent 5328501, 1994, С22С 001/04]. В этом случае химические реакции протекают на межфазных поверхностях, которые непрерывно обновляются в процессе механической активации и измельчения реагентов в присутствии инертного разбавителя. Выделяющееся в процессе реакции тепло рассеивается в среде разбавителя, в результате механохимический синтез протекает спокойно, без нагрева и конечным продуктов является наноразмерные частицы.

Для синтеза наноразмерных частиц использована реакция

SnCl₂·2H₂O+Na₂CO₃+0,5O₂⇒SnO₂+2NaCl+СО₂.

В качестве исходных материалов для получения SnO₂ использованы реактивы (SnCl₂·H₂O и Na₂CO₃) марки х.ч., предварительно просушенные при 120°С. С целью предотвращения агрегации частиц конечного продукта в реакционную систему вводят избыток хлорида натрия (NaCl).

Смесь реагентов герметизируют в закаленных стальных барабанах со стальными шарами. Механохимический синтез проводят в планетарной мельнице МПВ. Содержание железа в конечном продукте задано изменением продолжительности механохимического синтеза. Соответственно оксиды железа Fe₂О₃ и Fe₃О₄ получены прокаливанием синтезированного материала при температурах 200-400 и 600-800°С соответственно.

Фазовый состав, морфология и дисперсность конечного продукта определены методами рентгеноструктурного анализа (Shimadsu-XRD-6000, Cu-К_α-излучение), просвечивающей (ЭМ-125), сканирующей электронной микроскопии и локального рентгеноспектрального анализа (Philips SEM 515 с приставкой EDAX/ECONIV). Содержание железа определено комплексометрическим методом в присутствии сульфосалициловой кислоты.

В зависимости от режима механохимического синтеза получен композиционный материал в виде сферических и осколочных частиц в основном размером в интервале 3-80 нм, содержащий 80-99,5 мас.% оксида олова (SnO₂) с татрагональной решеткой и вещество, выбранное из группы: Fe, Fe₂O₃, Fe₃O₄, их смеси.

Методами электронной микроскопии установлено, что распределение частиц по размерам является бимодальным и в нем можно выделить два структурных уровня. К первому структурному уровню относятся сферические частицы с размером 3÷(15-20) нм, содержание которых в пробе составляет примерно 20%. Ко второму структурному уровню относятся отдельные или слабо агрегированные частицы сферической формы с размерами 40÷80 нм. Кроме того, наблюдаются отдельные частицы с размерами 100-120 нм и агрегаты до 200 нм соответственно. Фазовый состав частиц соответствует в основном фазе SnO₂ с тетрагональной кристаллической решеткой. Химический анализ показывает, что в частицах содержится железо от 0,5 до 20 мас.% в зависимости от продолжительности механической активации. Магнитный анализ показывает, что после прокаливания при 200-400°С это вещество превращается в Fe₃O₄, а после прокаливания при 600-800°С - в Fe₂O₃.

Наночастицы размером 3-20 нм отделены с помощью центрифуги, при этом более крупная фракция в соответствии с данными электронно-микроскопического исследования представляет собой частицы второго структурного уровня, а также агрегаты размером до 200 нм, состоящие из наночастиц, указанных выше размеров.

Для оценки способности наноразмерных магнитных порошков адсорбировать и десорбировать молекулы ДНК поставлена серия экспериментов, в которой исследовали нанопорошки SnO₂ с различным содержанием магнитной составляющей (Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄) (табл.) и размерами в интервале 3÷20 нм.

Для сравнения исследовали отдельно наноразмерные порошки оксидов Fe₂О₃, Fe₃O₄, композиционного материала Fe₂О₃+Fe₃O₄ и наноразмерный магнитный композиционный материал, содержащий SnO₂ и вещество из группы: Fe, Fe₂O₃, Fe₃O₄ с размером частиц и агрегатов в интервале 40-200 нм (табл.).

Для оценки адсорбционной активности суммарной массы нанопорошка и активности двух седиментационных фаз последние готовили методом пассивной седиментации по следующей схеме: к навеске нанопорошка 16 млг добавляли 100 мкл растворителя, тщательно перемешивали на вортексе и отстаивали в течение 1 мин. Надосадочную жидкость, содержащую взвесь нанопорошка (3÷20 нм), отбирали в отдельную пробирку (верхняя фаза), к осадку повторно добавляли 100 мкл растворителя и перемешивали на вортексе (нижняя фаза) (40÷200 нм). В готовые растворы вносили по 10 мкл водного раствора ДНК (1 млг/мл). Затем проводили магнитную седиментацию в течение 5 мин на магнитном штативе. Концентрацию ДНК измеряли в супернатанте и водном элюате осадка.

Реакции взаимодействия растворов нанопорошка с ДНК проводили при различных температурных режимах (25-95°С). Содержание ДНК оценивали на флуориметре АМФ-01 с использованием интеркалирующего красителя Sybr-Green (1:10) при длинах волн 470/540. Для оценки эффективности наноразмерного композиционного материала при адсорбции и десорбции ДНК в качестве активирующей системы использовали соли лития в ацетоне.

Максимальные значения адсорбции и десорбции установлены для наноразмерного композиционного материала, содержащего оксид олова и вещество, выбранное из группы: Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄, их смеси (табл.).

В результате оценки буферной емкости верхней седиментационной фазы активированного оксида олова установлено, что зависимость количества связываемых молекул ДНК от количества нанопорошка во взвеси имеет нелинейный характер. Для эффективного связывания ДНК (0.6 млг/мл) достаточно использовать концентрации порядка 0,03 млг/мл. Увеличение количества активированного нанокомпозита не дает существенного увеличения эффективности адсорбции. Буферная емкость (нанокомпозит/ДНК) активированного SnO₂ составляет 1:20.

Исследования возможных ингибирующих свойств исследуемых наноматериалов на ферментативные реакции показали отсутствие снижения эффективности полимеразной цепной реакции (ПЦР) при их добавлении в реакционную смесь. Более того, установлено повышение эффективности ПЦР и увеличение выхода амплификата, что, возможно, связано со стабилизирующим действием нанопорошков на ферменты синтеза нуклеиновых кислот.

При использовании активированного нанопорошка в качестве сорбента в существующих системах выделения ДНК показана достаточная эффективность и надежность данной замещающей системы. Так, с использованием предложенного активированного композиционного наноразмерного материала SnO₂ + 8 мас.% Fe₂О₃ в качестве сорбента (в коммерческих системах выделения ДНК) была выделена ДНК из лейковзвеси, которая успешно использована для постановки ПЦР. При этом установлено, что активированный и высушенный нанопорошок композиционного материала не теряет своих адсорбционных свойств после повторного растворения в любой другой системе растворителей.

Оценка результатов использования предложенных композиционных материалов для адсорбции и десорбции ДНК/РНК свидетельствует о существенном преимуществе последнего по сравнению с известными аналогами и прототипом.

ТаблицаСвойства композиционного наноразмерного материалаМатериал, мас.%Размер частиц, нмЭффективность адсорбции ДНК, %Эффективность десорбции ДНК, %Эффективность обратимого связывания ДНК, %SnO₂ + 0.5% Fe3÷2098.0100.099.0SnO₂ + 5% Fe3÷2094.8100.098.0SnO₂ + 13% Fe«-»95.299.597.8SnO₂ + 20.1% Fe«-»94.899.897.4SnO₂ + 5.1% Fe₂O₃«-»95.699.798.1SnO₂ + 8% Fe₂O₃«-»96.199.899.2SnO₂ + 21% Fe₂O₃«-»96.399.799.1SnO₂ + 15% (Fe+Fe₂O₃)«-»95.599.698.2SnO₂ + 6% Fe(40÷80) + агрегаты95.15.505.2SnO₂ + 15% Fe«-»95.06.105.3SnO₂ + 21% Fe«-»94.85.25.1SnO₂ + 5% Fe₂O₃«-»93.66.35.2SnO₂ + 8.3% Fe₂O₃«-»94.55.95.3SnO₂ + 18.8% Fe₂O₃«-»94.25.75.1SnO₂ + 16% Fe₃O₄«-»95.16.05.3SnO₂ + 13% Fe₃O₄полидисперсный94.35.65.2Fe₂O₃+Fe₃O₄5÷2095.079.475.4Fe₂O₃+Fe₃O₄(˜20÷160) + агрегаты95.57.77.3Fe₂O₃<2061.097.959.7

Изобретение относится к биологии и медицине. Изобретение касается наноразмерного композиционного материала для адсорбции и десорбции ДНК/РНК в виде наночастиц, состоящих из 80÷99.5 мас.% оксида олова (SnO₂) с тетрагональной кристаллической решеткой и 20÷0.5 мас.% вещества, выбранного из группы: Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄ или их смеси. Указанный материал позволяет повысить удельную емкость адсорбции и десорбции ДНК/РНК при одновременно заданной намагниченности композиционного материала, в частности, необходимой для магнитного осаждения. 1 табл.

Композиционный наноразмерный материал для адсорбции и десорбции ДНК/РНК, характеризующийся тем, что он состоит из оксида олова с тетрагональной кристаллической решеткой и вещества из группы Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄ или их смеси при следующем соотношении компонентов, мас.%:

оксид олова (SnO₂)80÷99.5вещество из группы: Fe, Fe₂О₃, Fe₃O₄ или их смесьостальное