СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ 8-ОКСОГУАНИН-ДНК-ГЛИКОЗИЛАЗЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/25 

Изобретение относится к области биохимии и касается способа определения активности ферментов репарации, конкретно 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (фермент hOgg1).

Известно, что ферменты репарации ДНК играют важную роль в обеспечении функциональных свойств ДНК и жизни клетки. Они удаляют из ДНК поврежденные гетероциклические основания, образующиеся под воздействием химических агентов, УФ- или ионизирующего излучения. Одним из часто встречающихся поврежденных оснований в ДНК является 8-оксогуанин, образующийся под воздействием активных форм кислорода (АФК), таких как гидроксильный и супероксидный радикалы, пероксид водорода и синглетный кислород. АФК образуются в клетке под действием излучения и приводят к окислительному стрессу. 8-оксогуанин является сильным эндогенным мутагеном, поскольку вызывает замены GC- на АТ-пары. Это повреждение в ДНК в клетках Е.coli репарируется ферментом 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой, или формамидо-ДНК-гликозилазой (Fpg) обладающей одновременно N-гликозилазной и апурин/апиримидинлиазной активностями (Boiteux S. et al. J. Biol. Chem. 1990, 265, 3916-3922). Указанные активности обнаружены также в клетках эукариот (белки OGG1, OOG2, mOGG1) и человека (фермент hOgg1) (Rosenquist T.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 7429-7434). Субстратами для 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз служат как 8-оксогуанин, так и основания с открытым имидазольным кольцом, а также ряд других модифицированных оснований ДНК (Tchou J. et al. J. Biol. Chem. 1994, 269, 15318-15324). В связи с этим 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы являются одними из основных белков клетки, ответственных за удаление из ДНК ряда модифицированных нуклеотидов, возникающих в результате окислительного стресса, поэтому разработка новых способов определения их активности является актуальной задачей.

Известен способ определения активности фермента Fpg путем взаимодействия с субстратом, содержащим окисленные пуриновые основания с раскрытым имидазольным циклом, или формамидипиримидин-содержащие основания, называемые ФАПИ (S. Boiteux et al., J. Biol. Chem. 1990, 265:3916-3922). Фермент инкубируют с ФАПИ-субстратами с последующим определением количества оснований ФАПИ, удаляемых из субстрата. Для этого приготавливают раствор объемом 50 мкл, содержащий буфер (70 мМ Hepes-KOH, pH 7,6, 100 мМ KCl, 1 мМ Na2EDTA, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 5% глицерин), фермент Fpg и добавляют 150 пмоль субстрата [³Н]ФАПИ-поли(dG-dC)поли(dG-dC) с известной удельной активностью (около 1950 распадов/мин пмоль).

Раствор инкубируют 10 минут при 37°С и добавляют 50 мкл раствора, содержащего БСА (0,5 мг/мл) и ДНК тимуса теленка (0,5 мг/мл) в 0,4 М NaCl. Затем добавляют 300 мкл холодного (-20°С) этанола и центрифугируют на центрифуге «Эппендорф» 15 минут при 4°С. Радиоактивность в этанол-растворимой фракции определяют с помощью сцинтилляционной спектроскопии. Активность фермента рассчитывают по заданной формуле. Единица активности фермента составляет 1 пмоль оснований ФАПИ, удаляемых за 5 минут при 37°С.

Недостатками известного способа являются его длительность и трудоемкость, необходимость синтеза и анализа радиоактивного ФАПИ-субстрата. Описанный способ не обеспечивает высокой точности и достоверности, не позволяет получить информацию об активности фермента по отношению к своему основному субстрату, содержащему основание 8-оксогуанин, и о стандартных характеристиках фермента: активности, характеризующейся величиной каталитической константы k_cat, и величиной эффективности, определяемой отношением констант k_cat /K_М/.

Наиболее близким к заявляемому способу-прототипом является способ определения активности фермента Fpg по нахождению параметров К_М и k_cat для 8-оксогуанинсодержащего субстрата путем оценки скорости разрыва цепи ДНК в месте расположения остатка 8-оксогуанина (Tchou J et. al,. Substrate specificity of Fpg protein. Recognition and cleavage of oxidatively damaged DNA. J. Biol. Chem, 1994; 269 (21):15318-24).

Способ осуществляют следующим образом:

Используют ³²Р-меченый субстрат. Субстратом является комплементарный комплекс двух олигодезоксирибонуклеотидов длиной 23 нуклеотида: 5′-[³²P]d(CTCTCCCTTCG*CTCCTTTCCTCT)-3′ и 5′-d(AGAGGAAAGGAGCGAAGGGAGAG)-3′, где G* - 8-оксогуанозин. Метку ³²P на 5′-конец олигонуклеотида вводят с помощью [γ-32Р]АТФ и полинуклеотидкиназы фага Т4 по методике (Tchou J, Kasai H., Shibutani S, Chung M.-H., Laval J., Grollman АР, Nishimura S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 4690-4694).

Реакцию проводят в 10 мкл раствора, содержащего буфер (50 мМ трис-HCl, рН 7,4, 50 мМ KCl, 2 мМ ЭДТА) и ³²Р-меченый субстрат. Концентрация субстрата составляет 10, 20, 50, 100 или 200 нМ.

Реакционную смесь предынкубируют 5 мин при 15°С. Реакцию начинают путем добавления фермента Fpg в раствор, содержащий 20 мМ Hepes-KOH (рН 7,6), 50 мМ KCl, 100 мМ NaCl, 0,5 мМ дитиотреита и 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Количество фермента в растворе равно 5,7 нг, что составляет концентрацию 18 нМ.

Раствор инкубируют 2 минуты при 15°С и останавливают реакцию добавлением 5 мкл раствора красителей в формамиде (90% формамид, 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол, 20 мМ ЭДТА).

Анализ проводят электрофорезом в 20%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Аликвоты 4 мкл наносят в карманы геля и разделяют при напряжении 50 В/см.

Проводят автографирование геля на рентгеновскую пленку в течение 10-ти часов при температуре -20°С. Полосы, соответствующие исходному субстрату и продукту разрыва субстрата, вырезают из геля. Радиоактивность полос геля измеряют в сцинтилляционном растворе на счетчике радиоактивности.

Рассчитывают отношение радиоактивности в полосе геля, соответствующей продукту, к сумме радиоактивности обеих полос. Отношение радиоактивностей, полученное за 2 минуты, пересчитывают в единицы нМ/мин. Получают значение начальной скорости v₀. Строят зависимость полученного отношения от концентрации субстрата s₀. Данные обрабатывают по уравнению Михаэлиса (1) (Michaelis L., Menten M.L., Biochem. Z., 1913, V.49, P.333) с использованием программы ENZFITTER (Leatherbarrow R.J. Enzfitter version 1.03, Elsevier-Biosoft, New York, 1987). Получают значения К_M и k_cat.

Активность фермента характеризуют величиной каталитической константы k_cat, равной числу оборотов фермента в единицу времени, а эффективность - отношением (2) каталитической константы k_cat к константе Михаэлиса К_M (3):

Недостатками прототипа являются недостаточная точность и достоверность способа, поскольку определение активности фермента проводят в условиях, не удовлетворяющих применимости уравнения (1):

- уравнение (1) получено для условий [субстрат]>>[фермент], что не реализуется для малых концентраций субстрата в эксперименте.

- начальная скорость определяется неточно из-за расходования большой доли субстрата за регистрируемое время реакции.

Технической задачей изобретения является повышение точности и достоверности результатов, исключение наиболее часто встречающихся ошибок определения активности фермента и стандартизация единиц измерения активности в соответствии с международной системой.

Способ заключается в регистрации во времени изменения интенсивности собственной флуоресценции 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (hOgg1) при взаимодействии с ДНК-субстратом, содержащим 8-оксогуанин, в условиях «одного оборота фермента» (то есть когда концентрация фермента по порядку величины совпадает с концентрацией субстрата).

Для регистрации флуоресценции используют спектрофлуориметр, совмещенный с кинетической установкой «остановленной струи» (Колдин Е. Быстрые реакции в растворе. М.: Мир. 1966. С.52). Могут быть использованы как коммерческие приборы, так и сконструированные в лабораторных условиях. Кинетическая установка «остановленной струи» позволяет осуществлять автоматическое смешивание растворов за время порядка 1-2 миллисекунды.

В кювете флуориметра смешивают растворы исследуемого на активность фермента в концентрации 0,5-4 мкМ и ДНК субстрата в концентрации 0,5-4 мкМ, оба из которых приготавливают в буфере: 50 мМ Tris (рН 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ Na₂EDTA, 1 мМ дитиотреит, 9% глицерин. В качестве ДНК-субстрата используют двухспиральный комплекс комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, содержащий в центральном положении нуклеотид с 8-оксогуанином, например

Регистрируют изменение интенсивности флуоресценции фермента в реакционной смеси в интервале временив 1-1000 секунд в спектральном диапазоне 320-340 нм. Возбуждение флуоресценции проводят на длине волны 295 нм.

На фиг.1 представлены кривые кинетики флуоресценции для фермента hOgg1 при взаимодействии с ДНК-субстратом, содержащим остаток 8-оксогуанина при различной концентрации.

Наличие изменения интенсивности флуоресценции фермента во времени свидетельствует о наличии у фермента активности.

Для обработки данных используют схему Михаэлиса-Ментен (Michaelis L., Menten M. L., Biochem. Z., 1913, 49, 333; С.Д.Варфоломеев, К.Г.Гуревич, Биокинетика. Практический курс. M., 1999. С.86) и компьютерную программу DynaFit (Kuzmic, P. Program DYNAFIT for the analysis of enzyme kinetic data: application to HIV proteinase. Anal. Biochem., 1996, 237, 260-273), позволяющую проводить численное интегрирование и подгонку параметров методом нелинейной регрессии. В результате обработки получают значение каталитической константы k_cat-(в мин^-1).

- За удельную активность (А) фермента принимают, как широко распространено в энзимологии (см. Биохимия, 2004, Т.69, Вып.1, С.134-144), количество мкмоль продукта, образующегося в минуту, в расчете на 1 мг фермента (мкмоль×мин^-1×мг^-1), и рассчитывают по формуле:

А=2,8×10^-2k_cat

где 2,8×10^-2 - пересчетный коэффициент, равный количеству мкмоль фермента hOgg1 в 1 мг (молекулярная масса фермента hOgg1 равна 36 кДа).

Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:

- регистрация изменения интенсивности собственной флуоресценции фермента (8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека) при взаимодействии с ДНК-субстратом, содержащим 8-оксогуанин, которую проводят при одинаковых концентрациях последних, что позволяет повысить точность определения активности (в прототипе проводят измерение радиоактивности субстрата при его избытке по отношению к ферменту);

- регистрация интенсивности флуоресценции реакционной смеси, которую проводят в интервале времени 1-1000 секунд, что позволяет повысить достоверность определения активности фермента (в прототипе измерение проводят при одном времени (5 минут) в стационарном режиме).

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.

Пример

Для определения активности фермента hOgg1 готовят буфер следующего состава: 50 мМ Tris (рН 7.5), 50 мМ KCl, 1 мМ Na₂EDTA, 1 мМ дитиотреит, 9% глицерин.

Перед началом реакции приготавливают раствор в буфере субстрата, содержащий 13-ти звенные комплементарные олигонуклеотиды, один из которых содержит в центре цепи основание 8-оксогуанин. Для этого рассчитывают коэффициент экстинкции олигонуклеотидов на длине волны 260 нм по формуле, учитывающей вклад каждого мономерного звена в суммарный коэффициент экстинкции (Handbook of biochemistry and molecular biology / Ed.Fasman, G.D.Cleveland: CRC Press. 3^rd ed. V.II. 1975. P.589.). Измеряют оптическую плотность раствора каждого из олигонуклеотидов на длине волны 260 нм, рассчитывают их концентрации. Готовят растворы субстрата в буфере, содержащие каждый из олигонуклеотидов в соотношении 1:1, в концентрациях, которые в два раза выше, чем концентрация в реакционном растворе.

Готовят раствор фермента в буфере. На длине волны 280 нм измеряют оптическое поглощение раствора hOgg1, рассчитывают концентрацию hOgg1 с помощью коэффициента 68400 М^-1см^-1 (Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A. In: The Proteomics Protocols Handbook, Ed. J.M. Walker, Humana Press. 2005. Р.571). Разбавляют полученный раствор до нужной концентрации, которая в два раза выше, чем концентрация в реакционном растворе.

Заполняют растворами фермента и субстрата в буфере шприцы смесительного устройства установки остановленной струи, термостатируют при 25°С.

На монохроматоре возбуждающего света устанавливают длину волны 290 нм, перед фотоумножителем для регистрации испускаемого света устанавливают фильтр, пропускающий свет более 320 нм. Устанавливают режим считывания данных с фотоумножителя. Обычно, регистрируют 1000-4000 точек на весь временной диапазон. Интенсивность флуоресценции измеряют в вольтах (В).

Запускают реакцию путем смешивания растворов субстрата и фермента в соотношении 1:1 и регистрируют изменение интенсивности флуоресценции фермента в интервале 1-1000 секунд. С помощью встроенного в компьютер АЦП происходит формирование файла данных, содержащего набор пар цифр: интенсивность флуоресценции (В), время (с).

Зависимость интенсивности флуоресценции (в вольтах) фермента (1,0 мкМ) от времени реакции (секунды) для концентраций субстрата: 1 - 0,25 мкМ; 2 - 0,5 мкМ; 3 - 0,75 мкМ; 4 - 1 мкМ представлена на фиг.2.

Получено, что k_cat=0,38±0,04 мин^-1,

Активность А=2,8×10^-2×0,38=0,01 (мкмоль×мин^-1×мг^-1)

Использование способа позволит повысить точность и достоверность определения активности ферментов репарации, конкретно 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека (фермент hOgg1), а также исключить наиболее часто встречающиеся ошибки определения их активности и стандартизовать единицы измерения активности в соответствии с международной системой.

Изобретение относится к области биохимии. Способ включает смешивание растворов фермента и ДНК-субстрата, содержащим остаток 8-оксогуанина, с концентрациями, равными 0,5-4 мкМ, в соотношении 1:1. Определяют активность фермента путем регистрации изменения интенсивности его флуоресценции в реакционной смеси в интервале времени 1-1000 секунд. Использование способа позволит повысить точность и достоверность определения активности фермента. 2 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ определения активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека, включающий смешивание растворов фермента с ДНК-субстратом, содержащим остаток 8-оксогуанина, определение активности фермента, отличающийся тем, что растворы фермента и субстрата с концентрациями, равными 0,5-4 мкМ смешивают в соотношении 1:1 с последующим определением активности фермента путем регистрации изменения интенсивности его флуоресценции в реакционной смеси в интервале времени 1-1000 секунд.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ДНК-субстрата используют двухспиральный комплекс комплементарных олигодезоксирибонуклеотидов длиной 13 или более звеньев, содержащий в центральном положении нуклеотид с 8-оксигуанином.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что активность фермента (А) пересчитывают по формуле: A=k_cat×2,8×10^-2 мкмоль/(мг×мин), где = k_cat· - каталитическая константа (мин^-1), вычисленная по уравнениям Михаэлиса-Ментен с использованием компьютерной программы DYNAFIT