МУТАНТНАЯ ОКСИДАЗА D-АМИНОКИСЛОТ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2014 года по МПК C12N15/53 

Изобретение относится к области генной и белковой инженерии и может быть использовано для детекции D-аминокислот в сложных образцах и в процессах ферментативного синтеза оптически активных веществ, альфа-кетокислот, цефалоспориновых антибиотиков и других органических соединений с использованием оксидаз.

Получены новые мутантные формы оксидазы D-аминокислот (DAAO), характеризующиеся субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, отличной от субстратной специфичности фермента дикого типа из дрожжей Trigonopsis variabilis и от исходного фермента TvDAAO_C108F, использованного для их получения новых мутантных DAAO. В качестве основы для получения новых мутантных DAAO использовали последовательность кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность мутантной оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis, содержащую аминокислотную замену CyslOSPhe (TvDAAO_C108F). Предложенные мутантные формы характеризуются тем, что в исходном мутанте TvDAAO_C108F аминокислотный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 54 в аминокислотной последовательности оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, заменен на остаток тирозина (замена F54Y) или на остаток серина (замена F54S). Любая из этих замен может быть использована в комбинации с другими мутациями, обеспечивающими приобретение оксидазами D-аминокислот новых или улучшенных свойств.

Настоящее изобретение относится к новым белкам, в частности мутантным оксидазам из дрожжей, которые обладают субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности фермента дикого типа и исходного мутанта TvDAAO C108F по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, к кДНК, кодирующей мутантные оксидазы D-аминокислот, к применению данных ферментов в аналитических тестах на содержание D-аминокислот в биологических и иных образцах, к наборам, включающим их, и в процессах биокаталитического получения оптически активных веществ, альфа-кетокислот и других органических соединений, окисления цефалоспорина С и его производных с использованием оксидаз.

ФАД-зависимая оксидаза D-аминокислот катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот до соответствующих α-кетокислот с образованием иона аммония и пероксида водорода:

Исключительно высокую специфичность оксидазы D-амикокислот к D-формам аминокислот применяют для выделения L-изомеров и ферментативного синтеза α-кетокислот из дешевых рацемических смесей аминокислот. Это используют, в частности, при синтезе синтонов - исходных соединений для получения оптически чистых лекарственных препаратов. В качестве примера можно привести процесс получения омапатрилата - ингибитора ангеотензинпревращающего фермента из рацемической смеси 6-гидроксинорлейцина с использованием оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabihs (Patei R.N, Enzvmatic synthesis of chiral intermediates for Omapatrilat, an antihypertensive drug. Biomol. Eng., 2001, v. 17, №6, p.167-182). Также фермент активно использован в аналитической биотехнологии для детекции D-аминокислот в биологических жидкостях, например, спинномозговой жидкости человека (Sacchi, S., Rosini, E., Caldinelli, L., Pollegioni, L. Biosensors for D-amino acid detection. Methods Mol. Biol, 2012, v.794, pp.313-324.). Помимо этого, необратимость реакции, катализируемой этим ферментом, и специфическая активность оксидазы D-аминокислот позволяют ее использовать для превращения цефалоспорина С в глутарил-7-аминоцефалоспорановую кислоту (гл-7-АЦК). Далее из гл-7-АЦК получают 7-аминоцефалоспорановую кислоту, которая является исходным соединением при синтезе полусинтетических цефалоспориновых антибиотиков различных поколений (Pilone M.S., Buto S., Pollegioni L. A process for bioconversion of cephalosporin С by Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase. Biotechnol. Lett., 1995, V.17, №2, p.199-204).

Оксидазы D-аминокислот широко распространены в природе и могут быть выделены из разнообразных микроорганизмов (бактерий, дрожжей, микроскопических грибов, водорослей), а также моллюсков, рыб, рептилий, птиц и млекопитающих. Подробный список известных источников оксидаз D-аминокислот можно найти в обзорах (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67; Pollegioni, L. Molla, G. New biotech applications from evolved D-amino acid oxidases. Trends Biotechnol., 2011, v.29, p.276-283). Многие из генов, кодирующих данные ферменты, были клонированы и секвенированы, поэтому их можно получать с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Последовательность кДНК, кодирующую оксидазу D-аминокислот, встраивают в генно-инженерный вектор (плазмида, фаг и т.д.), который используют для трансформации микроорганизмов, например, бактерии E.coli или метилотрофные дрожжи Hansenida polymorpha, затем экспрессирующие желаемый ферментный продукт.

Основными недостатками известных природных и рекомбинантных оксидаз D-аминокислот дикого типа и их мутантных форм являются:

1) во-первых, неоптимальный спектр субстратной специфичности, что проявляется или в низкой каталитической активности с рядом природных и неприродных субстратов, или в неоптимальном соотношении активностей между различными D-аминокислотами. Например, с D-аланином большинство оксидаз D-аминокислот проявляют очень близкую или даже более высокую каталитическую активность, чем с D-серином. Поэтому такие ферменты не могут быть использованы в биосенсорах для селективного определения D-серина в сложных биологических объектах (например, в спинномозговой жидкости) в присутствии сравнимых концентраций D-аланина. В случае с цефалоспорином С каталитической активностью обладают только ферменты из дрожжей T.variabilis и Rhodotorula gracilis, причем в случае последнего фермента эта активность не очень высока (Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G. et al. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin С bioconversion: a comparison between proteins from different sources. Biotechnol. Prog., 2004, v.20, №2, p.467-473).

2) вторым важным недостатком является невысокая температурная и операционная стабильность ферментов. Среди известных оксидаз D-аминокислот наиболее стабильным при высоких температурах является фермент из дрожжей T.variabilis (TvDAAO) (Тишков В.И., Хороненкова С.В. Оксидаза D-аминокислот: структура, механизм действия и практическое применение. Биохимия, 2005, т.70, №1, с.51-67).

Благодаря наилучшей среди оксидаз D-аминокислот каталитической активности с цефалоспорином С наиболее перспективной для практического применения в процессах синтеза цефалоспориновых антибиотиков в настоящее время является оксидаза D-аминокислот из T.variabilis. Однако для практического применения фермента необходимо улучшать его каталитические характеристики с цефалоспорином С и стабильность. Одним из подходов для решения поставленной задачи является мутагенез аминокислотных остатков целевого белка.

В настоящее время наибольшее количество экпериментов по мутагенезу оксидазы D-аминокислот выполнено для рекомбинантного фермента из дрожжей R.gracilis (см. обзор Pollegioni, L., Sacchi, S., Caldinelli, L., Boselli, A., Pilone, M.S., Piubelli, L., Molla, G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolution approach. Curr. Protein Pept. Sci., 2007, v.8, p.600-618.). Для фермента из T.variabilis подобных работ опубликовано немного. В двух работах с использованием метода направленного мутагенеза изучали роль консервативных остатков His324 и Asp206 в катализе и связывании FAD (Lin L.L., Wang W.C., Ju S.S. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase. FEMS Microbiol. Lett., 1999, v.176, №2, p.443-448; Ju S.S., Lin L.L., Wang W.C., Hsu W.H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis. FEBS Lett, 1998, v.436, №1, p.119-122). Замены по остаткам His324 и Asp206 сильно ухудшали кинетические свойства или приводили к полной потере активности. В третьей работе направленный мутагенез в молекуле TvDAAO шести остатков метионина на остаток лейцина показал, что эти замены повышают стабильность фермента против инактивации пероксидом водорода (Ju S.S., Lin L.L., Chien H.R., Hsu W.H. Substitution of the critical methionine residues in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide. FEMS Microbiol. Lett., 2000, v.186, №2, p.215-219). Однако четыре мутации (Met104Leu, Met226Leu, Met245Leu и Met339Leu) приводили к резкому ухудшению кинетических свойств с D-аланином в качестве субстрата. В случае мутации Met209Leu ухудшилась константа Михаэлиса К_М (увеличение в 3,3 раза).

В результате замены Met156Leu значение К_М возросло в 1,5 раза, однако за счет увеличения каталитической константы k_cat в 3 раза общая каталитическая эффективность (отношение k_cat/К_М) повысилась в два раза. Влияние замен в TvDAAO остатка Phe258 на остатки Tyr, Ser и Ala на свойства фермента недавно были изучены в работе (Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Чубарь Т.А., Тишков В.И. Инженерия субстратной специфичности оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis: направленный мутагенез остатка Phe258. Биохимия, 2012, т.77, N10, с.1424-1433). Введение вышеуказанных аминокислотных замен приводит как к небольшой стабилизации (Phe258Tyr), так и дестабилизации фермента (Phe258Ser), причем изменение величины периода полуинактивации составляет не более 2 раз. В то же время эти замены привели к резкому изменению спектра субстратной специфичности. Увеличение размера боковой группы за счет замены Phe258Tyr приводит к ухудшению каталитической эффективности практически со всеми изученными D аминокислотами.

Наиболее значимые результаты были получены при замене остатка Cys108 на остатки Phe, Ser и А1а (Тишков В.И., Хороненкова С.В., Савина Л.И. Мутантные оксидазы D аминокислот. Патент РФ RU 2362806 от 23.07.2007, опубликовано 27.07.2009, Бюллетень "Изобретения. Полезные модели", 2009, №21). В результате введенных замен произошло изменение спектра субстратной специфичности, причем с рядом D-аминокислот наблюдалось улучшение каталитической эффективности по сравнению с ферментом дикого типа до 279%. Мутантные TvDAAO с заменами Cys108Phe и Cys108SAla были более чем в 3 раза эффективны в реакции окисления цефалоспорина С по сравнению с ферментом дикого. Среди трех полученных мутантов наиболее перспективным был фермент с заменой Cys108Phe, поскольку эта мутация также приводила и к повышению температурной стабильности. Поэтому для получения новых мутантных оксидаз D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью в качестве исходного фермента была использована мутантная TvDAAO с заменой Cys108Phe, которая в дальнейшем будет обозначаться как TvDAAO_C108F.

Техническая задача, решаемая посредством предлагаемого технического решения, состоит в получении новых мутантных форм оксидазы D-аминокислот из T.variabilis с субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности фермента дикого или его мутанта DAAO_C108F.

Технический результат, получаемый при реализации предлагаемого технического решения, состоит в изменении субстратной специфичности полученной формы оксидазы D-аминокислот по отношению к ряду D-аминокислот и их производных.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать мутантную оксидазу D-аминокислот из T.variabilis, характеризующуюся аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из T.variabilis TvDAAO_C108F с заменой природного остатка фенилаланина в положении 54 или остатком тирозина, или остатком серина. Введение в 54-е положение мутантной TvDAAO_C108F вышеперечисленных остатков обеспечивает изменение субстратной специфичности модифицированного фермента по отношению к ряду D-аминокислот и их производных. Кроме того, помимо вышеуказанных замен аминокислотная последовательность мутантной оксидазы D-аминокислот из T.variabilis может содержать, по меньшей мере, одну дополнительную замену, обеспечивающую улучшение термостабильности, химической стабильности, изменение кинетических свойств, попарное или одновременное улучшение всех вышеуказанных свойств по сравнению с аминокислотной последовательностью оксидазы D-аминокислот из T.variabilis дикого типа.

В дальнейшем способ получения и преимущества полученных новых модифицированных оксидаз D-аминокислот будут рассмотрены с использованием примеров его реализации.

Пример 1.

Получение новой мутантной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis за счет введения в исходный фермент TvDAAO_C108F замены Phe54Tyr методом направленного мутагенеза.

Все генно-инженерные манипуляции, если не оговорено особо, осуществлены в соответствии с Манниатис Е., Фрич. Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984 или в соответствии с инструкциями фирм-производителей приборов, наборов и других реагентов. Все эти методы хорошо известны специалистам в данной области.

Направленный мутагенез в гене daao из T.variabilis проводили с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве матрицы для проведения направленного мутагенеза использовали плазмиду pKanDAAO_C108F, в которой под контролем сильного промотора РНК-полимеразы фага Т7 находится ген исходной мутантной оксидазы D-аминокислот с заменой Cys108Phe. Плазмида pKanDAAO_C108F получена из коммерчески доступной плазмиды pET33b (Novagen, США), в которую по сайтам рестрикции NcoI и BamHI встроен ген daao из T.variabilis с мутацией Cys108Phe (подробно получение этой плазмиды описано в примере 2 патента RU 2362806). Плазмида была выделена из клеток E.coli с использованием набора для выделения плазмид NucleoSpin® Plus согласно инструкции фирмы-производителя (Macherey-Nagel GmbH & Со. KG).

Для введения мутации в ген daao из T.variabilis с применением ПЦР использовали праймеры на начало и конец гена:

DAOFor1

5'-ata tac cat ggc taa aat cgt tgt tat tgg tgc-3'

DAORev4

5'-gga aga gag ttt cga аса agg acg ac-3',

а также прямой и обратный праймеры, несущие требуемую замену в триплете, кодирующем в гене daao остаток Phe в положении 54:

DAO_F54Yfor

5'-gcc aac tgg etc аса t a t tac gat gga ggca agt tag cc-3'

DAO_F54Yrev

5'-ctt gcc tec ate gta a t a tgt gag cca gtt ggc ace t-3'.

Подчеркиванием и жирным шрифтом выделен нуклеотид, обеспечивающий мутацию Phe54Tyr.

Реакцию ПЦР проводили в тонкостенной пластиковой пробирке объемом 0,5 мл (Eppendorf, Германия). Для предотвращения испарения реакционной смеси и ее конденсации на крышке в пробирку добавляли 30 мкл минерального масла. Пробирку прогревали 5 мин при 95°C и затем проводили реакцию ПЦР по следующей программе: 1-я стадия - 95°C, 60 с; 2-стадия - 56°C, 60 с и 3-я стадия - 72°C, 2 мин, всего 25-35 циклов. После этого реакционную смесь выдерживали еще 10 мин при 72°C. Температуру на второй стадии выбирали на 3-5 градусов ниже T_m температуры плавления дуплексов, образуемых праймерами.

Реакционная смесь для проведения ПЦР имела следующий состав (таблица 1):

Таблица 1 Условия проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Количество Компонент 2,5 мкл 10-кратный буфер для PFU Turbo ДНК-полимеразы (Stratagene, США) 2,5 мкл смесь dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), концентрация 2,5 мМ 1 мкл ДНК-матрица, концентрация ~10 нг/мкл 2 мкл праймер 1, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия) 2 мкл праймер 2, концентрация 5 нмоль/мл (Синтол, Россия) 1 мкл PFU Turbo ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл) (Stratagene, США) до 25 мкл деионизованная вода, очищенная с использованием системы MilliQ (Millipore, США)

На первом этапе проводили две полимеразные цепные реакции с использованием следующих пар праймеров: 1) DAOFor1 + DAO_F54Yrev и 2) DAO_F54Yfor + DAORev4. В качестве матрицы использовали плазмиду pKanDAAO_C108F. Полученные продукты ПЦР, фрагмент 1 и фрагмент 2 очищали с использованием предназначенного для этого набора, например, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). Затем проводили третью объединяющую ПЦР с праймерами DAOFor1 и DAORev4, где в качестве ДНК-матрицы использовали полученные ранее фрагменты 1 и 2.

Продукт третьей ПЦР очищали с использованием препаративного электрофореза в агарозном геле с использованием предназначенных для этого наборов (например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG)). Очищенный ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазой Bsp19 в течение 2 часов при 37°C, затем инкубировали рестрикционную смесь для инактивации рестриктазы в течение 20 минут при 65°C и обрабатывали рестриктазой Bso31 в течение 2 часов при 55°C. В эксперименте были использованы рестриктазы и буфера фирмы Сибэнзим (Россия). Затем полученные фрагменты ДНК очищали от коротких фрагментов препаративным электрофорезом в агарозном геле с последующей экстракцией нужной полосы из агарозы с использованием предназначенного для этого набора, например, NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG) и лигировали с фрагментом исходной плазмиды pKanDAAO_C 108F, из которой расщеплением по тем же сайтам рестрикции Bspl9 и Bso31 был удален фрагмент гена daao из T.variabilis дикого типа. Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали клетки E.coli TG1 (генотип supE hsdΔ5 thi Δ (lac-proAB) F'[traD36 proAB⁺ lacI^q lacZΔM15]} и выращивали в течение ночи при 37°С на твердой агаризованной среде LB, содержащей канамицин в концентрации 30 мкг/мл (плазмида pKanDAAO содержит ген устойчивости к канамицину).

Выросшие колонии инокулировали в 6-8 мл среды 2YT, содержащей 30 мкг/мл канамицина, и растили при 37°C в течение 8-10 часов при аэрировании. Плазмидную ДНК выделяли из полученной культуры клеток с использованием предназначенного для этого набора, например, QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Для контроля введения требуемых мутаций проводили секвенирование плазмидной ДНК с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 (Perkin Elmer Applied Biosystems), который основан на дидезокситерминационном методе [Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, №12, pp.5463-5467], с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. В результате из 5 выделенных плазмид все 5 содержали только требуемую замену Phe54Tyr. Таким образом, был получен новый мутант TvDAAOC108F Phe54Tyr (плазмида pKanDAAO_C 108FJF54Y).

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS{rW nuT) dcm Tef gal 'k(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO_C108A и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 2. Получение новой мутантной оксидазы D-аминокислот Trigonopsis variabilis за счет введения в исходный фермент TvDAAO_C108F замены Phe54Ser методом направленного мутагенеза.

Данный пример идентичен примеру 1 за исключением того, что в качестве прямого и обратного праймеров, несущих требуемую замену в положении 108 гена daao, использовали следующие дезоксирибоолигонуклеотиды:

DAO_F54Sfor

5'- ggc ggt tgt t ct caa ccc aac aac tgg tea tc -3'

DAO_F54SFrev

5'- gtt gtt ggg ttg ag a аса асе gcc aat gat aga agt ac -3'. Подчеркиванием и жирным шрифтом выделен азотистые основания, обеспечивающий мутацию Phe548Ser.

Плазмида pKanDAAO_C108F с нуклеотидными заменами, обеспечивающими в гене фермента мутацию Phe54Ser, получила название pKanDAAO_C 108F_F54S.

Для получения мутантного фермента клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus (генотип E.coli В F^- ompT hsdS(rB^- mB^-) dcm⁺ Tet⁺ gal λ(DE3)pLysS endA Hte [argU proL Cam^r]) трансформировали плазмидой pKanDAAO_C108F и проводили их культивирование (см. ниже).

Пример 3. Изучение субстратной специфичности мутантных оксидаз D-аминокислот и фермента дикого типа.

Для точной оценки эффекта изменения субстратной специфичности оксидаз D-аминокислот за счет введения точечных замен Phe548Tyr и Phe548Ser новые мутантные ферменты, исходный мутант и оксидазу D-аминокислот дикого типа выделяли в высокоочищенном состоянии и определяли константы Михаэлиса и максимальные скорости взаимодействия ферментов с различными субстратами.

Методика получения и очистки была одинакова как для мутантных TvDAAO, так и для фермента дикого типа. Клетки E.coli BL21 (DE3) pLysS Codon Plus, содержащие одну из плазмид (pKanDAAO, или pKanDAAO_C108F, или pKanDAAO_C108F_F54Y, или pKanDAAO_C108F_F54S) и синтезирующие целевой фермент, получали культивированием единичной колонии в колбах объемом 1 л, содержащих 150 мл среды 2YT и 30 мкг/мл канамицина при 37°C при непрерывном перемешивании (140 об/мин). По достижении поглощения среды на 600 нм величины А₆₀₀ 0,6-0,9 в колбы добавляли изопропил-бета-D-тиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ и культивировали в течение 24 часов при 25°C. Клетки собирали центрифугированием (7000 об/мин, 20 мин, 4°C) и ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 для получения 20% суспензии. Для предварительного разрушения клетки подвергали замораживанию-размораживанию и далее обрабатывали ультразвуком при охлаждении льдом, каждые 5 минут отбирая пробы для измерения активности фермента. По достижении постоянного значения активности полученный раствор центрифугировали (18000 об/мин, 30 мин, 4°C) для удаления осадка. Полученный супернатант нагревали в течение 10 мин при 45°C для инактивации каталазы и некоторых других белков, осадок удаляли центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин, 4°C).

Ионообменную FPLC хроматографию проводили на установке фирмы Pharmacia (Швеция). Раствор фермента наносили на колонку Source 15Q объемом 40 мл (Pharmacia Biotech, Швеция), уравновешенную 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5 (буфер А). После нанесения образца колонку промывали тем же буфером до нулевого поглощения на 280 нм выходящего из колонки раствора. Фермент элюировали с колонки со скоростью 10 мл/мин линейным градиентом 0-1 М NaCl в буфере А. Собирали фракции, обладающие оксидазной активностью, объединяли их и концентрировали на мембране РМ10 в ячейке для концентрирования объемом 50 мл (мембрана и ячейка производства Amicon, США) до объема 5 мл. Полученный фермент наносили на колонку 2,5×100 см с Sephacryl S-200 (Pharmacia Biotech, Германия), уравновешенную 0,1 М фосфатным буфером, рН 8,0. Собирали фракции по 5 мл, определяли их поглощение на длине волны 280 нм А₂₈₀ на спектрофотометре Shimadzu 1800PC (Shimadzu GmBH, Германия) и измеряли величину ферментативной активности с использованием пероксидазной реакции (методику см. ниже). Отбирали фракции, имеющие постоянное отношение (активность/А₂₈₀). Чистота полученных препаратов составляла не менее 95% согласно данным аналитического электрофореза в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Электрофорез проводили на приборе BioRad (Англия) согласно инструкции фирмы-производителя.

Активность ферментов определяли по образованию пероксида водорода, для чего использовали пероксидазу из корней хрена (ПХ) фирмы Reanal (Венгрия) и ее субстрат АБТС (2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)) фирмы Sigma (США). В качестве субстратов для мутантной DAAO и фермента дикого типа использовали различные D-аминокислоты. В кювету спектрофотометра (рабочий объем 1 мл, оптический путь 1 см) добавляли раствор D-аминокислоты в 50 мМ натрий- или калий-фосфатном буфере (ФБ), 20 мкл раствора АБТС (16 мг/мл) в воде, 10 мкл раствора пероксидазы в 50 мМ ФБ (1000 Ед/мл) и насыщенный кислородом 50 мМ ФБ (рН 8,0) до общего объема 980 мкл. После термостатирования в течение 10 мин при 30°C в реакционную смесь добавляли 20 мкл фермента. Накопление продукта окисления АБТС регистрировали на длине волны 414 нм (ε₄₁₄=36000 М^-1 см^-1).

Для определения величин максимальной скорости реакции и константы Михаэлиса оксидазы D-аминокислот дикого типа и мутантных ферментов концентрацию соответствующей D-аминокислоты варьировали в диапазоне 0,5-5 К_М. Приблизительное значение К_М определяли в отдельном эксперименте, измеряя скорость реакции при концентрациях D-аминокислоты 0,1, 0,5, 1,0, 5,0, 10 мМ. Значения активности при каждой концентрации измеряли не менее 3 раз, а на границах и в середине диапазона определение проводили 5 раз. Величины V_m и Км определяли из зависимости скорости реакции от концентрации D-аминокислоты с использованием нелинейной регрессии, используя программу "Origin Pro 7.0". Программа также позволяет оценить ошибки расчета параметров.

В таблице 2 приведены относительные значения констант Михаэлиса ((Км)мут/(Км)^дт* 100%), максимальных скоростей ((k_cat)^мут/(k_ct)^дт*100%) и общей каталитической эффективности ((k_cat/К_М)^мут/(k_cat/К_М)^дт*100%) с различными субстратами для новых мутантных TvDAAO_C108F Phe54Tyr и TvDAAO-_C108F Phe54Ser, исходного мутанта TvDAAO_C108F относительно таковых для оксидазы D-аминокислот дикого типа. В случае константы Михаэлиса, уменьшение Км соответствует относительным величинам менее 100%, а увеличение k_cat и k_cat/К_М соответствует относительным величинам более 100%.

Таблица 2 Кинетические параметры новых мутантных оксидаз D-аминокислот и исходного мутантного фермента относительно таковых для фермента дикого типа* Форма фермента Новые мутантные TvDAAO Исходный мутант TvDAAO_C108F TvDAAO_C108F Phe54Tyr TvDAAO_C108F Phe54Ser D-аминокислота k_cat, % K_M % k_cat/К_М, % k_cat, % K_M, % k_cat/К_М, % k_cat, % K_M, % k_cat/К_М, % D-метионин 60 1110 5 40 309 13 151 1060 14 D-аланин 3 138 3 2 56 4 НЕТ РЕАКЦИИ D-серин НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ 36 149 21 D-валин 5 271 2 3 35 8 58 207 28 D-тирозин 31 118 42 156 30 528 59 27 214 D-триптофан 71 5082 1 61 218 28 81 59 136 D-лейцин 27 82 32 55 15 360 295 108 274 D-фенилаланин 93 1059 9 247 178 137 312 135 231 D-аспарагин 42 159 26 139 34 407 249 114 218 D-треонин НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ 160 64 254 D-лизин НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ НЕТ РЕАКЦИИ * Кинетические параметры для мутантных ферментов (мут) выражены в процентах относительно соответствующих значений для TvDAAO дикого типа (дт), т.е. в случае Км, k_cat и k_cat/КМ - это будут соответственно отношения (Км)^мут/(Км)^дт*100%, (k_cat)^мут/(k_cat/K_M)^мут/(kcat/K_M)^дт*100% и (k_cat/К_М)^мут/(k_cat/KM)^дт*100%.
Погрешности измерения констант не превышали 10%.

Из таблицы следует, что введение замены Phe54Tyr и особенно Phe54Ser существенно изменило профиль субстратной специфичности полученной мутантной формы оксидазы D-аминокислот по сравнению с профилем субстратной специфичности как фермента дикого типа, так и исходного мутанта TvDAAO_C108F. Например, новые мутантные оксидазы D-аминокислот перестала катализировать окисление D-серина, который являлся "хорошим субстратом" (высокое значение отношения k_cat/К_М) для фермента дикого типа и исходного мутанта TvDAAO_C108F, т.е. полученные мутанты являются идеальным для использования в биосенсорах для селективного определения в клетках нервной системы D-аланина в присутствии высоких концентраций эндогенного D-серина. Природные оксидазы D-аминокислот с таким соотношением активностей с D-серин - D-аланин в литературе не описаны. В плане улучшения каталитических свойств с природными D-аминокислотами наиболее эффективной оказалась замена Phe54Ser. Для сравнения каталитических свойств ферментов используют величину каталитической эффективности (отношение k_cat/К_М).

Как следует из таблицы 2, максимальное увеличение величины каталитической эффективности с рядом D-аминокислот по сравнению с ферментом дикого типа в случае исходного мутанта TvDAAO_C108F Phe54Ser no сравнению с ферментом дикого типа с тремя аминокислотами составляет максимум 360-528%.

Таким образом, полученные мутантные формы оксидазы D-аминокислот обладают субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности, как фермента дикого типа, так и исходного мутанта TvDAAO_C108F по отношению к ряду D-аминокислот и их производных.

Пример 4. Каталитическая активность новой и исходной мутантных оксидаз D-аминокислот и фермента дикого типа с цефалоспорином С.

Для определения эффективности взаимодействия TvDAAO дикого типа, исходного мутанта и новых мутантных форм с цефалоспорином С в пробирке объемом 2,0 мл (Eppendorf, Германия) смешивали 20 мМ цефалоспорина С и предварительно насыщенный кислородом 0,1 М ФБ, рН 8,0.

Для определения эффективности взаимодействия TvDAAO дикого типа, исходного мутанта и новых мутантных форм с цефалоспорином С в качестве субстрата ферментативную реакцию проводили в открытой 2 мл пластиковой пробирке при перемешивании (1000 об/мин, 30°C). Реакционная смесь (общий объем 500 мкл) содержала 20 мМ цефалоспорин С в 0,1 М КФБ, рН 8,0, насыщенном кислородом. Реакцию запускали добавлением одинаковых количеств мутантных TvDAAO или фермента дикого типа (5 мкг). Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали пробы объемом 50 мкл, останавливали реакцию 50 мкл 0,1 М HCl и анализировали их состав с использованием ВЭЖХ на колонке Силасорб С-18 (125 мм × 4,0 мкм; "ХроМасс", Россия). В качестве элюента использовали 20 мМ CH₃COONa, 2 об.% ацетонитрил, рН 4,9. Уменьшение концентрации субстрата цефалоспорина С в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически по поглощению раствора на выходе из колонки на длине волны 260 нм. Содержание цефалоспорина С в реакционной смеси определяли из полученных хроматограмм по величине площади пика, отвечающего исходному субстрату.

Кинетика окисления цефалоспорина С с использованием полученных мутантных TvDAAO и исходного мутанта и фермента дикого типа представлена на чертеже. Во всех случаях в реакцию вводили одинаковые по массе количества фермента. Из приведенного чертежа хорошо видно, что новые мутантные TvDAAO_C108FPhe54Tyr и TvDAAO C108F Phe54Ser проявляют гораздо более высокую каталитическую активность в реакции окисления цефалоспорина С по сравнению с исходным мутантом TvDAAO_C108F и особенно по сравнению с ферментом дикого типа. В случае новых мутантов 100% конверсия субстрата происходит за 26-30 мин, в то время как через 30 мин после начала реакции конверсия субстрата в случае исходного мутанта и фермента дикого типа составляет 14 и 49% соответственно. Следует отметить, что в реакции окисления цефалоспорина С мутант TvDAAO_C108F Phe54Tyr немного более эффективен, чем второй новый мутант TvDAAO C108F Phe54Ser.

Изобретение относится к области генной инженерии и может быть использовано для детекции D-аминокислот в сложных образцах и в процессах ферментативного синтеза оптически активных веществ, альфа-кетокислот, цефалоспориновых антибиотиков и других органических соединений с использованием оксидаз. Получены новые мутантные формы оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. В качестве исходного фермента использована мутантная оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis с заменой Cys108Phe. Предложенные новые мутантные формы отличаются тем, что аминокислотный остаток фенилаланина в положении, соответствующем положению 54 в последовательности вышеуказанной оксидазы D-аминокислот, замещен одним из следующих остатков - тирозина или серина. Изобретение позволяет получить мутантные оксидазы D-аминокислот, характеризующиеся улучшенными по сравнению с исходным мутантом и соответствующим ферментом дикого типа каталитическими свойствами. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Мутантная оксидаза D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis с остатком фенилаланина в 108 положении, отличающаяся тем, что в ней дополнительно остаток фенилаланина в положении 54 замещен остатком тирозина.

2. Мутантная оксидаза D-аминокислот с измененной субстратной специфичностью по отношению к ряду D-аминокислот и их производных, характеризующаяся аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности мутантной оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis с остатком фенилаланина в 108 положении, отличающаяся тем, что в ней дополнительно остаток фенилаланина в положении 54 замещен остатком серина.