СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ Российский патент 2008 года по МПК A61K39/145 A61K31/722 A61P31/12 

Описание патента на изобретение RU2323742C1

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивированной гриппозной вакцины.

Существующие инактивированные гриппозные вакцины обладают относительно низкой иммуногенностью и профилактической эффективностью для лиц пожилого возраста и детей до 5-ти лет и не способны защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа, изменяющих антигенность, которые появляются практически в каждый новый эпидемический сезон. При однократном парентеральном введении существующих инактивированных гриппозных вакцин непраймированным лицам (т.е. лицам, не болевшим гриппом и невакцинированным) защищается от заболевания гриппом не более 5-10% вакцинированных, что осложняет борьбу с гриппом, особенно в случае пандемии (Гендон Ю.З., 2004; 2006).

Известен способ (US 6534065) получения интраназальной мукозальной вакцины при использовании в качестве мукозо-адгезивного адъюванта хитозана деацетилированного на 80-90%) с молекулярным весом от 10000 до 100000 Da и при концентрации хитозана в вакцине до 5%. Использовали соли хитозана со следующими карбоновыми кислотами: молочной, яблочной, малеиновой, янтарной, фумаровой, глютаминовой и аспарагиновой. Однако интраназальное применение инактивированной гриппозной вакцины с мукозо-адгезивным адъювантом приводило к серьезным осложнениям в виде паралича некоторых лицевых мышц, в связи с чем применение такой вакцины было прекращено (Mutsch et al., 2004).

Техническим результатом заявленного изобретения является создание инактивированной гриппозной вакцины, вводимой парентерально, обладающей повышенной иммуногенностью. Для достижения указанного технического результата способ приготовления инактивированных гриппозных вакцин (цельновирионных, расщепленных, субъединичных и др.), вводимых парентерально, характеризуется тем, что при приготовлении инактивированной вакцины к ней одновременно добавляют препараты высокополимерного хитозана и ограниченно деполимеризованного низкополимерного хитозана, молекулы которого несут на одном из своих концов свободные альдегидные группы, при этом добавляемые препараты хитозана имеют степень деацетилирования в пределах 60-90% и молекулярную массу в пределах 100-500 кБа (высокополимерный хитозан) и 0,5-20 кВа (низкополимерный хитозан).

Известно, что препараты высокополимерного хитозана растворимы только при рН ниже 6,5 (рК протонирования свободных аминогрупп хитозана). В этом случае они представляют собой поликатионы, легко образующие ионные комплексы с биополимерами различного происхождения. В подкожной и мышечной тканях человека и животных в норме поддерживается рН не ниже 7,0, поэтому в месте инъекции комплекс хитозан-компоненты вакцины выпадает в виде геля. Большинство низкомолекулярных фрагментов хитозана, полученных ограниченной деполимеризацией с использованием азотистой кислоты, на одном своем конце несут остаток ангидроманнозы, имеющей свободную альдегидную группу. При рН выше 7,0 алифатические альдегидные группы образуют с первичными аминогруппами слабые ковалентные азометиновые связи, т.е. получаются так называемые Шиффовы основания. Поэтому низкополимерный хитозан оказывается также иммобилизованным в месте инъекции.

Вследствие медленной деполимеризации молекул хитозана под действием лизоцима и некоторых других гидролитических ферментов, присутствующих в месте инъекции, комплекс медленно рассасывается и фрагменты хитозана и вирусные антигены постепенно освобождаются из геля. Это влечет за собой замедленное и постепенное поступление компонентов вакцины в кровоток, что и приводит к усилению иммунного ответа.

Принимая во внимание опубликованные в научной литературе сведения, что хитозан с молекулярной массой в пределах 0,6-15 кДа стимулирует систему клеточного иммунитета, мы проводили ограниченную деполимеризацию хитозана азотистой кислотой и последующее фракционирование так, чтобы получить фракцию молекул с массой 2-20 кДа (низкомолекулярный хитозан - НПХ). Данная фракция обладает также бактериостатическим и/или бактерицидным действием, что должно содействовать консервации вакцины при хранении.

Примеры осуществления способа

Пример 1. Получение хитозанового адъюванта

Препарат высокополимерного хитозана (ВПХ) (фирма Сонат, РФ, Москва), имеющий среднюю молекулярную массу 300 кДа, степень деацитилирования 85% и содержащий лишь следовые количества тяжелых металлов (Pb, Hg, Cu, Cd)-4ppm, золы - менее 0,01%, белка - менее 0,02%, подвергали ограниченной деполимеризации с использованием методики, приведенной в патенте США №5312908. Процесс проводили в течение 4-х часов при температуре 5°С. Реакцию останавливали, добавляя водный раствор NaOH до конечного рН 9,0, что приводило к выпадению фрагментов хитозана в осадок. Для полного удаления низкомолекулярных продуктов реакции проводили три цикла растворения препарата подкислением до рН 4 с последующим щелочным осаждением. Затем раствор НПХ в минимальном количестве 0,05 м уксусной кислоты диализовали 2 раза против 0,05 м АсОН и 1 раз против деионизованной воды, используя ультрафильтрационную мембрану фирмы "Sigma" (США), пропускающую молекулы только менее 0,5 кДа. Затем препарат подвергали истощающему диализу, используя целлюлозную диализную мембрану, задерживающую молекулы с массой более 20 кДа. Раствор, содержащий молекулы, прошедшие сквозь мембрану, подвергали сублимационной сушке - получали сухой препарат НПХ (фиг.1).

Для приготовления концентрата адъюванта ВПХ/НПХ навеску сухого препарата ВПХ смешивали с навеской кристаллической глутаминовой кислоты в соотношении 0,99 моль кислоты на 1 моль аминогрупп хитозана. Затем при постоянном перемешивании добавляли деионизованную воду в количестве, необходимом для получения 2% раствора глутамата хитозония. По достижении максимального растворения раствор отфильтровывали от следовых количеств нерастворенного хитозана и подвергали сублимационной сушке. После растворения необходимой навески глутамата хитозония в деионизованной воде (рН полученного раствора = 6,1-6,4) раствор стерилизовали автоклавированием. К полученному раствору (после его охлаждения) добавляли предварительно простерилизованный фильтрованием через мембрану с порами 0,2 мкм раствор НПХ в деионизованной воде и стерильный раствор 3 моль/литр хлорида натрия так, чтобы получить 1% ВПХ, содержащий 0,1% НПХ и 0,15 моль/литр NaCl (концентрат ВПХ/НПХ). Таким образом, препарат ВПХ/НПХ представляет собой смесь двух солей хитозония: 90% глютамата и 10% ацетата.

Пример 2

К расщепленным или субъединичным инактивированным гриппозным вакцинам добавляли концентрат ВПХ/НПХ, разведенный в стерильном растворе хлорида натрия так, чтобы получить конечную концентрацию соли хитозония с глютаминовой кислотой - ВПХ = 0,5%, НПХ = 0,05%, хлорида натрия = 0,9% и 3 мкг вакцины в общем объеме = 0,2 мл. Мышей вакцинировали двукратно, вводя внутримышечно по 3 мкг вакцины с хитозаном или без него. Наблюдалось увеличение образования антител, задерживающих гемагглютинацию, для вируса гриппа серотипа А/Н1 в 4-16 раз, серотипа А/Н3 - в 4-8 раз и серотипа В - в 4-8 раз, а нейтрализующих антител к серотипу А/Н1 - в 8-32 раза, серотипу А/Н3 - в 8-16 раз и серотипу В - в 8-32 раза. Этот эффект проявляется как при иммунизации расщепленной, так и субъединичной, инактивированной вакцинами (фиг.2).

Пример 3

К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли препараты соли хитозония с глютаминовой кислотой (ВПХ) + НПХ (как описано в примере 1) и двукратно вакцинировали мышей, вводя по 3 мкг вакцины внутримышечно. В контрольных опытах мышей вакцинировали без хитозана. Наличие антител в сыворотках исследовали в реакции задержки гемагглютинации и в реакции нейтрализации со штаммами вируса гриппа, содержащимися в вакцине, а также с дрейфовыми антигенными вариантами вирусов серотипов А и В. В сыворотках мышей, вакцинированных без хитозана, титр антител к дрейфовым вариантам вируса был в 2-4 раза ниже чем к вакцинным штаммам. При вакцинации препаратами, содержащими ВПХ/НПХ, наблюдалось не только существенное увеличение титров антител к штаммам вирусов, содержащихся в вакцинах, но также значительное образование антител, ингибирующих гемагглютинацию, а также нейтрализующих антител к дрейфовым вариантам вируса гриппа серотипов А и В, которые превосходили титры антител, ингибирующих гемагглютинацию, и нейтрализующих антител для штаммов А/Н3 в 2-8 раз, и для штаммов вируса гриппа В в 2-4 раза в сравнении с соответствующими титрами антител к дрейфовым вариантам, индуцируемых вакцинами без хитозана, и были равны или превышали титры антител, индуцируемых вакцинами без хитозана к вирусам, содержащимся в вакцинах (фиг.3).

Пример 4

К инактивированной гриппозной вакцине (расщепленной) добавляли соли хитозония с глютаминовой кислотой (ВПХ) до 0,5% и НПХ до 0,05% и двукратно вакцинировали внутримышечно различными дозами вакцины (3,0 мкг, 1,5 мкг и 0,75 мкг) с препаратом хитозана и без него. Хитозан способен увеличивать титры антител в 4 раза даже при значительном снижении дозы антигена. В сравнении с вакцинацией без хитозана титры антител при вакцинации с хитозаном при дозе вакцины 3 мкг увеличиваются в 4-5 раз, при 1,5 мкг в 3-5 раз и при 0,75 мкг в 3-5 раз в зависимости от серотипа вируса (фиг.4).

Подписи к чертежам

Фиг.1. Схема деполимеризации хитозана нитритом натрия при рН 3,0-4,0:

А - препарат высокополимерного хитозана, растворенного в разбавленной уксусной кислоте (ацетат хитозония);

GlcN - остаток глюкозамина;

GlcNAc - остаток ацетилглюкозамина;

Б - продукт деполимеризации ацетата хитозония с помощью азотистой кислоты.

Фиг.2. Влияние хитозана на образование антител к трем серотипам вируса гриппа. Мышей иммунизировали двукратно субъединичными и расщепленной инактивированными трехвалентными вакцинами с хитозаном или без него. Анализ титров антител проводили со штаммами вируса, соответствующими содержащимся в вакцинах:

А - титры антител, ингибирующих гемагглютинацию; В - титры нейтрализующих антител;

H1, Н3, В - серотипы вируса гриппа; Х - титры при раздельном введении вакцины и хитозана;

а - субъединичная вакцина MG; b - вакцина Vaxigrip; с - субъединичная вакцина Influvac.

- вакцина без хитозана, - вакцина с хитозаном.

По оси ординат - разведения сывороток.

Все наблюдавшиеся различия между титрами антител, индуцированных вакцинами с хитозаном и без него, были статистически значимыми (Р<0,01).

Фиг.3. Образование антител к дрейфовым вариантам вируса гриппа при вакцинации вакцинами с хитозаном.

Мышей иммунизировали двукратно вакцинами Vaxigrip на эпидсезон 2004/05 и на эпидсезон 2005/06 с хитозаном или без него. Анализ титров антител проводили со штаммами вирусов, содержащихся в вакцинах, и с дрейфовыми вариантами вирусов гриппа A/H3N2 и В;

А - титры антител, ингибирующих гемагглютинацию, В - титры нейтрализующих антител;

а - штамм A/H3N2, соответствующий вакцинному штамму на эпидсезон 2004/05, b - дрейфовый вариант A/H3N2 для вакцины эпидсезона 2004/05, рекомендованный на эпидсезон 2005/06, с - дрейфовый вариант A/H3N2 для вакцины эпидсезона 2004/05, рекомендованный на эпидсезон 2003/2004, d - штамм В, соответствующий вакцинному штамму на эпидсезон 2004/05, е - дрейфовый вариант вируса В для вакцины эпидсезона 2004/05, рекомендованный на эпидсезон 2003/04, f - штамм A/H3N2, соответствующий вакцинному штамму на эпидсезон 2005/06, g - дрейфовый вариант A/H3N2 для вакцины эпидсезона 2005/06, рекомендованный на эпидсезон 2004/05, h - дрейфовый вариант A/H3N2 для вакцины эпидсезона 2005/06, рекомендованный на эпидсезон 2003/04, i - штамм В, соответствующий вакцинному штамму на эпидсезон 2005/06, j - дрейфовый вариант вируса В для вакцины эпидсезона 2005/06, рекомендованный на эпидсезон 2003/04;

- вакцина без хитозана; - вакцина с хитозаном.

По оси ординат - разведения сывороток.

Все наблюдаемые различия между титрами антител к дрейфовым вариантам вирусов при вакцинации с хитозаном и без него были статистически значимыми (Р<0,05-0,01).

Фиг.4. Влияние хитозана на образование антител, ингибирующих гемагглютинацию при снижении дозы антигена.

Мышей иммунизировали двукратно расщепленной вакциной Vaxigrip, вводя внутримышечно 3,0, 1,5 и 0,75 мкг антигена с хитозаном или без него:

I - вакцина без хитозана, II - вакцина с хитозаном;

а - 3,0 мкг антигена, b - 1,5 мкг антигена, с - 0,75 мкг антигена.

Литература

1.Гендон Ю.З. Преимущества и недостатки инактивированной и живой вакцин против гриппа. Вопр. вирусол. 2004, 49, №4, стр 4-12.

2.Гендон Ю.З. Проблемы профилактики гриппа у маленьких детей. Вопр. вирусол. 2006, 51, №2, стр.4-10.

3.Mutsch M., Zhou W., Rhodes P. at al. Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's - Palsy in Switzerland. N.Engl. G.Med. 2004, 350, p.896-903.

4.US 6534065 - Influenza vaccine composition with chitosan adjuvant.

Похожие патенты RU2323742C1

название год авторы номер документа
ПРОИЗВОДНЫЕ ОЛИГОХИТОЗАНА В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТОВ ДЛЯ ВАКЦИН 2015
  • Тихонов Владимир Евгеньевич
  • Благодатских Инэса Васильевна
  • Маркушин Станислав Георгиевич
  • Акопова Ирина Ивановна
RU2589702C1
СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННОЙ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ 2010
  • Гендон Юрий Захарович
  • Маркушин Станислав Георгиевич
  • Акопова Ирина Ивановна
  • Кривцов Георгий Георгиевич
  • Переверзев Александр Димитриевич
  • Сухно Анатолий Сергеевич
RU2465006C2
СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА У ПАЦИЕНТОВ С ОБЩЕЙ ВАРИАБЕЛЬНОЙ ИММУННОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ 2022
  • Хаитов Муса Рахимович
  • Свитич Оксана Анатольевна
  • Костинова Аристица Михайловна
  • Латышева Елена Александровна
  • Ахматова Нэлли Кимовна
  • Костинов Михаил Петрович
  • Латышева Татьяна Васильевна
RU2800858C1
ВАКЦИНА ПРОТИВ ГРИППА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2010
  • Алсынбаев Махамат Махаматуллович
  • Загидуллин Наиль Виленович
  • Кедик Станислав Анатольевич
RU2446824C2
Способ получения антигена или антигенов для производства противогриппозной вакцины и вакцина на его основе 2019
  • Трухин Виктор Павлович
  • Евтушенко Анатолий Эдуардович
  • Красильников Игорь Викторович
  • Савина Наталья Николаевна
  • Уйба Станислав Валентинович
  • Васильев Андрей Николаевич
  • Рыськова Елена Владимировна
  • Быков Дмитрий Геннадьевич
  • Начарова Елена Петровна
  • Аракелов Сергей Александрович
RU2710239C1
Способ получения четырехвалентной вакцины для профилактики гриппа 2020
  • Катлинский Антон Викентьевич
  • Шкунова Наталья Борисовна
  • Вандышев Павел Евгеньевич
  • Афанасьев Станислав Вадимович
RU2754398C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРАВАЛЕНТНОЙ СУБЪЕДИНИЧНОЙ ПРОТИВОГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ 2019
  • Красильников Игорь Викторович
  • Иванов Александр Викторович
  • Белякова Ольга Валерьевна
  • Николаева Алевтина Максимовна
  • Погодин Павел Игоревич
RU2740751C1
ВАКЦИНА ГРИППОЗНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ РАСЩЕПЛЕННАЯ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2015
  • Трухин Виктор Павлович
  • Петровский Станислав Викторович
  • Аракелов Сергей Александрович
  • Быков Дмитрий Геннадьевич
  • Евтушенко Анатолий Эдуардович
  • Уйба Станислав Валентинович
  • Грановский Виталий Николаевич
  • Савина Наталья Николаевна
RU2584594C1
Пентавалентная субъединичная вакцина против респираторных инфекций и способ ее получения 2022
  • Красильников Игорь Викторович
  • Исаев Артур Александрович
  • Иванов Александр Викторович
  • Кудрявцев Александр Викторович
  • Фролова Мария Евгеньевна
  • Вахрушева Анна Владимировна
RU2804948C2
АТТЕНУИРОВАННЫЙ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/КРАСНОДАР/101/59/35 (H2N2) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ 2007
  • Гендон Юрий Захарович
  • Маркушин Станислав Георгиевич
  • Акопова Ирина Ивановна
  • Коптяева Ирина Борисовна
  • Цфасман Татьяна Михайловна
RU2354695C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 323 742 C1

Реферат патента 2008 года СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается производства вирусных вакцин, в частности инактивированной гриппозной вакцины. Технической задачей изобретения является повышение иммуногенности инактивированной гриппозной вакцины. Сущность изобретения: к инактивированной гриппозной вакцине в качестве адъюванта добавляют смесь глутамата хитозония, полученного из высокомолекулярного хитозана с молекулярной массой 100-500 кДа и ограниченно деполимеризованного низкополимерного хитозана с молекулярной массой 0,5-20 кДа; при этом молекулы хитозана и глутамата хитозония несут на одном из своих концов свободные альдегидные группы и имеют степень деацетилирования в пределах 60-90%; концентрацию высокомолекулярного хитозана в вакцине доводят до 0,5% и низкополимерного хитозана до 0,05%, а вакцинацию осуществляют парентеральным способом. 4 ил.

Формула изобретения RU 2 323 742 C1

Способ повышения иммуногенности инактивированной гриппозной вакцины, включающий добавление к вакцине в качестве адъюванта высокополимерного глутамата хитозония, отличающийся тем, что в качестве адъюванта используют смесь глутамата хитозония, полученного из высокомолекулярного хитозана с молекулярной массой 100-500 кДа и ограниченно деполимеризованного низкополимерного хитозана с молекулярной массой 0,5-20 кДа; при этом молекулы хитозана и глутамата хитозония несут на одном из своих концов свободные альдегидные группы и имеют степень деацетилирования в пределах 60-90%; концентрацию высокомолекулярного хитозана в вакцине доводят до 0,5% и низкополимерного хитозана до 0,05%, а вакцинацию осуществляют парентеральным способом.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2008 года RU2323742C1

US 6534065, 18.03.2003
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ 1993
  • Чубарова Н.И.
  • Клейменова С.В.
  • Никоноров И.Ю.
  • Розаева Н.Р.
  • Бичурина М.А.
RU2082431C1
US 6048536, 11.04.2000
СПОСОБ КОНТРОЛЯ ВНУТРЕННИХ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ЦЕПЕЙ ЭЛЕКТРОДОВ ЭЛЕКТРОВАКУУМНОГО ПРИБОРА 2001
  • Березин А.И.
  • Мещеряков В.М.
  • Мотов Ю.В.
  • Чаплыгин В.Г.
RU2201598C2
BACON A
et al
Carbohydrate Biopolymers Enhance Antibody Responses to Mucosally Delivered Vaccine Antigens
Infection and Immunity
ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР 1922
  • Гебель В.Г.
SU2000A1
Способ получения смеси хлоргидратов опийных алкалоидов (пантопона) из опийных вытяжек с любым содержанием морфия 1921
  • Гундобин П.И.
SU68A1

RU 2 323 742 C1

Авторы

Гендон Юрий Захарович

Маркушин Станислав Георгиевич

Кривцов Георгий Георгиевич

Акопова Ирина Ивановна

Зверев Виталий Васильевич

Колышкин Владимир Михайлович

Даты

2008-05-10Публикация

2007-02-15Подача