КОВАЛЕНТНЫЕ КОНЪЮГАТЫ МЕЖДУ РОДСТВЕННЫМИ АРТЕМИЗИНИНУ ЭНДОПЕРОКСИДАМИ И ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩИМИ БЕЛКАМИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК A61K31/366 A61K31/555 A61P35/00 A61P31/00 A61P33/00 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Данная заявка испрашивает защиту пользы предварительной заявки на патент США №60/386928, поданной 6 июня 2002 г., в соответствии с §119 35-го Свода законов США.

Область изобретения

Изобретение относится к ковалентным конъюгатам между относящимися к артемизинину эндопероксидами и несущими железо белками и к применению указанных конъюгатов для лечения злокачественной опухоли и инфекций, вызванных патогенами, которые связывают несущие железо белки.

Предпосылки изобретения

Артемизинин представляет собой полуторатерпеновый лактон, выделенный из растения Artemisia annua L., экстракты которого применяли для лечения малярии в течение, по меньшей мере, 1600 лет. Молекула артемизинина содержит эндопероксидную мостиковую связь, которая взаимодействует с атомом железа для образования свободных радикалов, вызывая гибель клеток. Противомалярийное действие артемизинина связано с его взаимодействием с гемом внутри паразита для генерирования свободных радикалов, вызывая гибель клеток. Злокачественные клетки имеют значительно более высокий входящий ток железа, чем нормальные клетки. Соответственно, было показано, что артемизинин и аналоги артемизинина оказывают цитотоксическое действие на укоренившиеся опухоли и линии опухолевых клеток (см., например, Woerdenbag et al. (1993) J. Nat. Prod. 56(6)849:56; Lai & Singh (1995) Cancer Lett. 91:41-6; Efferth et al. (2001) Int. J. Oncol. 18:767-73; Li et al. (2001) Bioorg. Med. Chem. Lett. 11:5-8; Singh & Lai (2001) Life Sci. 70:49-56; Efferth et al. (2002) Biochem. Pharmacol. 64:617-23; Efferth et al. (2002) Blood Cells, Molecules & Diseases 28(2):160-8; Sadava et al. (2002) Cancer Lett. 179:151-6).

Было описано множество аналогов артемизинина и других соединений, содержащих эндопероксидную мостиковую связь, которые являются биологически активными (см., например, патент США №5180840; патент США №5216175; патент США №5225,427; Cumming et al. (1998) J. Med. Chem. 41(6):952-64; Posner et al. (1999) J. Med. Chem. 42:300-4; Li et al. (2001) Bioorg Med. Lett. 11:5-8; Wu et al. (2001) Eur. J. Med. Chem. 36:469-79; Posner et al. (2003) J. Med. Chem. 46:1060-5). Аналоги артемизинина, которые использовали при лечении малярии, включают дигидроартемизинин, артемэфир, артесунат, артеэфир, пропикарбонат дигидроартемизинина и артелиновую кислоту.

Артемизинин является сравнительно безопасным препаратом с небольшим количеством и незначительными побочными эффектами даже в высоких дозах. Пероральные дозы 70 мг/кг/сутки в течение 6 суток применяли у людей для лечения малярии. Очевидные побочные эффекты не наблюдали после лечения страдающего злокачественной опухолью пациента артесунатом (пероральная доза 50 мг/сутки; внутримышечная доза 60 мг/сутки, в течение периода 9 месяцев) (Singh & Verma (202) Arch. Oncol. 10(4):279-80). Артемизинин и аналоги артемизинина применяли при лечении кожных заболеваний, таких как псориаз, вызывающие образование пузырей кожные заболевания, вирусные бородавки, контагиозный моллюск и геморрой (см., например, патент США №4978676, патент США №5219880). Артемизинин и аналоги артемизинина применяли также для профилактики малярии.

Было показано, что введение солей железа или несущего железо белка голотрансферрина увеличивает восприимчивость злокачественных клеток и имплантированных опухолей к артемизинину и его аналогам (Lai & Singh (1995) Cancer Lett. 91:41-46; Moore et al. (1995) Cancer Lett. 98:83-7; Singh & Lai (2001) Lai (2001) Life Sci. 70:49-56; Sadava et al. (2002) Camcer Lett. 1179:151-6).

Было также показано, что определенные патогены получают железо связыванием с несущими железо белками-хозяевами. Например, Neisseria meningitidis, возбудитель бактериального менингита, экспрессирует рецепторы клеточной поверхности для несущих железо соединений, таких как трансферрин и лактоферрин (Evans & Oakhill (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):705-7). В настоящее время нет вакцины для штамма В N. Meningitides, самого распространенного штамма в западном мире. Кроме того, было показано, что Helicobacter pylori, этиологический агент гастрита, язв желудка и двенадцатиперстной кишки и аденокарциномы у людей, получает железо связыванием лактоферрина человека (Husson et al. (1993) Infect. Immun. 61(6):2694-7).

В данной области существует необходимость в композициях артемизинина с увеличенной эффективностью для лечения злокачественной опухоли и заболеваний, вызванных патогенами, которые связывают несущие железо белки-хозяева. Существует также необходимость в лечении злокачественной опухоли и инфекций, вызванных патогенами, которые получают железо интернализацией несущих железо белков-хозяев. Настоящее изобретение направлено на указанные нужды.

Сущность изобретения

В одном аспекте изобретение предоставляет новые соединения и композиции, включающие ковалентные конъюгаты между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком. Относящийся к артемизинину эндопероксид может быть связан с несущим белок соединением гидразидной частью, гидразиновой частью или аминоксичастью. В некоторых вариантах осуществления относящийся к артемизинину эндопероксид имеет структуру:

где n=1-3, m=0-3, Ar = арил и Y=-(C=O)NH-, -NH- или -О-. Репрезентативные относящиеся к артемизинину эндопероксиды, присутствующие в ковалентных конъюгатах изобретения, включают артелинат и дигидроартемизинин.

Репрезентативные несущие железо белки, присутствующие в ковалентных конъюгатах изобретения, включают трансферриновое семейство белков, липокалин, ассоциированный с нейтральной желатиназой (NGAL), гемопротеины и другие связывающие железо белки. Таким образом, ковалентные конъюгаты могут включать, например, конъюгаты артелината и голотрансферрина, артелината и гололактоферрина или артелината и гемоглобина. Изобретение также предоставляет композиции, включающие ковалентные конъюгаты изобретения и фармацевтически приемлемый носитель. Ковалентные конъюгаты изобретения можно применять для лечения злокачественной опухоли и инфекций патогенами, которые связывают несущие железо белки.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы введения ковалентных конъюгатов изобретения нуждающемуся в них субъекту. Иллюстративные ковалентные конъюгаты, подходящие для введения в данном аспекте изобретения, включают, например, ковалентные конъюгаты между артелинатом и голотрансферрином, между артелинатом и гололактоферрином и между артелинатом и гемоглобином.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет способы лечения злокачественной опухоли введением нуждающемуся в нем человеку или животному эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком нуждающемуся в нем субъекту. Ковалентные конъюгаты можно вводить местно, системно или их можно инъецировать непосредственно в опухоль. Ковалентные конъюгаты можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более дополнительных терапевтических средств. Например, ковалентные конъюгаты можно вводить со средством, которое увеличивает транспорт железа в клетки, например, увеличением количества рецепторов клеточной поверхности для несущих железо белков в конъюгате.

Изобретение также предоставляет способы лечения инфекций патогенами, которые связывают несущие железо белки, введением нуждающемуся в нем человеку или животному эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком. В одном варианте осуществления патоген включает Helicobacter pylori, причем несущий железо белок включает лактоферрин человека, и причем относящийся к артемизинину эндопероксид выбирают из группы, состоящей из артелината и дигидроартемизинина. В других иллюстративных вариантах осуществления патоген включает Neisseria meningitidis, причем несущий железо белок включает трансферрин человека, и причем относящийся к артемизинину эндопероксид выбирают из группы, состоящей из артелината и дигидроартемизинина.

Еще одни варианты осуществления предоставляют способы лечения инфекций H. Pylori введением нуждающемуся в нем человеку или животному эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

В одном аспекте изобретение предоставляет композиции, включающие ковалентные конъюгаты между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущими железо белками. Используемый здесь термин «ковалентный конъюгат» относится к соединению, в котором относящийся к артемизинину эндопероксид ковалентно связан с несущим железо белком. Термин «относящийся к артемизинину эндопероксид» относится к соединению, имеющему эндопероксидную мостиковую связь, которая взаимодействует с атомом железа для образования свободных радикалов, вызывающих гибель клеток. Относящиеся к артемизинину эндопероксидные соединения могут также образовывать свободные радикалы в присутствии меди и марганца. Репрезентативные относящиеся к артемизинину эндопероксиды представлены здесь, хотя будет очевидно, что для данной цели можно применять другие эндопероксиды.

Обычно относящийся к артемизинину эндопероксид выбирают из группы, состоящей из полуторатерпеновых лактонов и спиртов, карбонатов, сложных эфиров, простых эфиров и их сульфонатов, артефлена, 1,2,4-триоксанов и 1,2,4,5-тетраоксанов. Относящийся к артемизинину эндопероксид может иметь структуру:

где R представляет собой или , где R₁ представляет собой водород, гидроксил, алкил или имеет формулу:

, , , , , или ,

где R₂ представляет собой алкил или арил и n=1-6, или его фармацевтически приемлемые соли. Используемый здесь термин «алкил» означает низший алкил, имеющий от 1 до 6 атомов углерода, предпочтительно, от 1 до 4 атомов углерода. Алкильные группы изобретения могут представлять собой группы с прямой или разветвленной цепью. Термин «арил» относится к моноциклическим и полициклическим ароматическим группам, содержащим от 4 до 14 каркасных углеродов или гетероатомов, и включает и карбоциклические арильные группы, и гетероциклические арильные группы. Карбоциклические арильные группы представляют собой арильные группы, в которых все атомы кольца представляют собой углерод. Гетероциклические арильные группы имеют от 1 до 4 гетероатомов в качестве кольцевых атомов, причем остальные кольцевые атомы представляют собой углерод. Репрезентативные арильные группы включают, например, фенил и бензил. Фармацевтически приемлемые соли включают соли щелочных или щелочноземельных металлов, предпочтительно, натрия или калия.

Например, эндопероксидные соединения по изобретению включают артемизинин, где R представляет собой , дигидроартемизинин (R₁=-OH), артезуновую кислоту (R₁=-ОСО(СН₂)₂СО₂Н) и артезунат, артемэфир (R₁=-ОСН₃) и артеэфир (R₁=-ОС₂Н₅). Другие репрезентативные эндопероксидные соединения по изобретению включают артелиновую кислоту, пропилкарбонат дигидроартемизинина, артефлен (Ro. 42-1611) и его аналоги (Biirgen et al. (1994) Sixth Int. Cong. Infect. Dis. Abst. 427, p.152, Prague), 1,2,4-триоксаны (Peters et al. (1993) Ann. Trop.Med. Parasit. 87(1):9-16) и 1,2,4,5-тетраоксаны (Vennerstrom et al. (1992) J. Med. Chem. 35(16):3023-3027). Другие подходящие структурные аналоги артемизинина описаны, например, в патентах США №№5216175 и 5180840; Cumming et al. (1998) J. Med. Chem. 41(6):952-64 и патентных заявках РСТ WO 97/01548, WO 99/33461 и WO 00/42046.

Источник относящихся к артемизинину эндопероксидов может быть естественным (например, выделенным из растений), синтетическим или полусинтетическим. Например, средства, генерирующие свободные радикалы, можно получить экспрессированием ферментов для релевантных синтетических путей у микробного хозяина (см., например, Martin et al. (2003) Nature Biotechnol., published online: 1 June 2003, doi:10.1038/nbt833).

Используемый здесь термин «несущий железо белок» относится к белку, который подходит для транспортировки железа к клетке или в нее. Несущий железо белок в ковалентных конъюгатах изобретения может представлять собой белок млекопитающего, такой как человеческий белок. Иллюстративные несущие железо белки включают трансферриновое семейство белков, липокалин, ассоциированный с нейтральной желатиназой (NGAL), гемопротеины и другие связывающие железо белки. Железо играет жизненно важную роль в клеточном росте. Трансферриновое семейство белков включает трансферрин, лактоферрин, овотрансферрин и меланотрансферрин (Aisen & Harris (1989) in Iron Carriers and Iron Proteins (ed. Loehr, VCH, New York) pages 273-320; Baker (1994) Adv. Inorg. Chem. 41:389-463). Все указанные белки представляют собой структурно связанные одноцепочечные гликопротеины, содержащие 670-690 аминокислот. Трансферрин транспортирует железо и гем из циркуляции в клетки. Нагруженная железом форма трансферрина (голотрансферрин) связывается с рецепторами трансферрина на поверхности клеток и принимается внутрь клетки через опосредованный рецепторами эндоцитоз, где высвобождается железо. Лактоферрин играет ключевую роль при всасывании железа из человеческого молока. Другой функцией трансферрина является удерживать железо из инфекционных агентов. Лактоферрин, в отличие от трансферрина, устойчиво связывает железо при низком рН и всасывается в кишечник.

NGAL представляет собой несущий железо белок, который не связан с белками семейства трансферрина, и он предложен для доставки железа к дифференцирующимся эпителиальным клеткам (Kaplan (2002) Cell 111:603-6). Гемопротеины представляют собой белки, такие как гемоглобин, миоглобин, гемопексин, цитохромы, каталазы и пероксидазы, которые несут гем в качестве протезной группы. Например, гемопексин представляет собой сывороточный гликопротеин 60 кДа, который секвестрирует гем с очень высоким сродством из потока крови и транспортирует его к печени (Baker et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(7):3579-83).

В ковалентных конъюгатах изобретения относящиеся к артемизинину эндопероксиды связаны с несущим железо белком любым путем, который сохраняет и активность несущего железо белка, и активность относящегося к артемизинину эндопероксида. Например, относящийся к артемизинину эндопероксид может быть связан с гликозилированным несущим железо белком, во-первых, получением гидразидного производного относящегося к артемизинину эндопероксида, который затем связывается с одной или более окисленных полисахаридных групп на несущем железо белке, как описано в примере 1. Для получения гидразидного производного относящегося к артемизинину эндопероксида сначала можно образовать сложный эфир относящегося к артемизинину эндопероксида добавлением 1-гидроксибензтриазола (HOBt) к относящемуся к артемизинину эндопероксиду с последующим добавлением диметилэтилкарбодиимида этила. Сложный эфир HOBt может затем взаимодействовать с гидразином для образования гидразидного производного. Гидразидное производное может затем ковалентно связываться с несущим железо белком, в котором полисахаридные группы были окислены окисляющим агентом, таким как перйодат натрия. Любой относящийся к артемизинину эндопероксид с группой -(C=O)NH- можно использовать для получения гидразидного производного, которое может быть связано с трансферрином или с другими несущими железо гликопротеинами (см., например, Cumming et al. (1998) J. Med. Chem. 41(6):952-64).

Относящийся к артемизинину эндопероксид можно также связать с гликозилированным несущим железо белком сначала получением гидразинового или аминоксипроизводного относящегося к артемизинину эндопероксида. Для получения гидразинового или аминоксипроизводного относящегося к артемизинину эндопероксида, галид, относящийся к артемизинину эндопероксид можно сначала получить добавлением галоид-спирта к относящемуся к артемизинину эндопероксиду с последующим добавлением трифторэтерата бора. Затем галид или относящийся к артемизинину эндопероксид может взаимодействовать с гидразином или гидроксиламином для образования соответственно гидразинового или аминоксипроизводного. Галидная группа может быть замещена пара-толуолсульфонильной или метансульфонильной группой для взаимодействия. Гидразиновое или аминоксипроизводное может затем быть ковалентно связано с несущим железо белком, в котором полисахаридные группы были окислены окисляющим агентом, таким как перйодат натрия. Любой относящийся к артемизинину эндопероксид с группой -(C=O)NH-, группу -NH- или группу -О- можно использовать для получения гидразинового производного или аминоксипроизводного, которое может быть связано с трансферрином или другими несущими железо гликопротеинами.

Относящиеся к артемизинину эндопероксиды, которые подходят для связывания указанным образом, включают соединения, из которых гидразидное, гидразиновое или аминоксипроизводное можно получить без разрушения активности эндопероксидной мостиковой связи. В целом, гидразидная, гидразиновая или аминоксигруппа отделяется от эндопероксидной мостиковой связи вставочным соединением, таким как углеводородная цепь. Простые эфиры, сложные эфиры, амиды, сульфиды и дисульфиды можно также использовать в качестве вставочного соединения. Например, бензольное кольцо может отделять эндопероксидную мостиковую связь от гидразидной, гидразиновой или аминоксигруппы, как в артелинате. Соответственно, относящиеся к артемизинину эндопероксиды, подходящие для применения в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются, эндопероксиды структуры:

где n=1-3, m=0-3, Ar = арил, например, фенил, нафтил, пиренил, пиридил или пиримидинил, и Y=-(C=O)NH-, -NH- или -О-. Репрезентативные относящиеся к артемизинину эндопероксиды, присутствующие в ковалентных конъюгатах изобретения, включают артелинат и дигидроартемизинин.

Другие способы связывания относящегося к артемизинину эндопероксида с несущим железо гликопротеином включают опосредованные боратом связи с углеводородными остатками на несущем железо гликопротеине (см., например, патент США №5919708). Так, относящийся к артемизинину эндопероксид с боратной группой будут взаимодействовать с 1,2-диоловой частью углеводородных остатков на поверхности белка.

Для негликозилированных несущих железо белков относящиеся к артемизинину эндопероксиды могут быть связаны с поверхностью белка использованием боковых цепей аминокислот, как описано в примере 2. Например, и артесунат, и артелинат имеют свободную группу карбоновой кислоты, которая может быть активирована N-гидроксизаместителем (см., например, Lewis et al. (1994) Bioconj. Chem. 5(6):655-76) и растворимым в воде карбодиимидным реагентом, таким как N-этил-N′-диметиламиноэтилкарбодиимид, для образования активного сложного эфира. Данный активный сложный эфир можно смешивать с водным раствором негликозилированного несущего железо белка для соединения относящегося к артемизинину эндопероксида с лизиновыми остатками на поверхности белка.

Ковалентные конъюгаты можно очистить использованием стандартных способов в данной области, например, использованием гель-фильтрационной хроматографии, обмена ионов и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенной фазе или гидрофобного взаимодействия. Количество молекул относящихся к артемизинину эндопероксидов, связанных с одной молекулой несущего железо белка, можно определить использованием стандартных способов в данной области, например, масс-спектрометрией распылением ионов. Соотношение между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущими железо белками в ковалентных конъюгатах будет зависеть от используемого несущего железо белка и способа образования конъюгата. Например, ковалентные конъюгаты, содержащие от 1 до 10 молекул относящегося к артемизинину эндопероксида на молекулу голотрансферрина. Можно получить с использованием способов, описанных в примере 1.

Изобретение также предоставляет композиции, включающие ковалентные конъюгаты изобретения. В некоторых вариантах осуществления композиции изобретения включают ковалентные конъюгаты между артелинатом и человеческим голотрансферрином, как описано в примере 1. В других вариантах осуществления композиции включают ковалентные конъюгаты между артелинатом и человеческим гололактоферрином.

Ковалентные конъюгаты изобретения можно применять для лечения злокачественной опухоли. Благодаря быстрой скорости их деления, большинство злокачественных клеток имеют высокие скорости поглощения железа и экспрессируют более высокие концентрации рецепторов трансферрина на поверхности клеток, чем нормальные клетки. Было показано, что введение солей железа или голотрансферрина увеличивает восприимчивость злокачественных клеток к артемизинину и его аналогам (Moore et al. (1995) Cancer Lett. 98:83-7; Singh & Lai (2001) Life Sci. 70:49-56; Sadava et al. (2002) Cancer Lett. 1179:151-6). Таким образом, эффективность и селективность относящихся к артемизинину эндопероксидов против злокачественной опухоли увеличивается ковалентным связыванием относящихся к артемизинину эндопероксидов с несущими железо белками, такими как голотрансферрины, потому что и эндопероксид, и железо транспортируются к одной и той же клетке или в нее в одно и то же время.

Ковалентные конъюгаты изобретения можно также применять для лечения инфекций патогенными организмами, которые имеют рецепторы для несущего железо белка в ковалентных конъюгатах. Для установления успешной инфекции патоген должен преодолеть строгие ограничения в железе, налагаемые хозяином. Для преодоления указанного ограничения многие патогены получают железо из несущих железо белков-хозяев (см., например, Cornelissen, (2003) Front. Biosci. 8:D836-47). Например, Neisseria meningitides, возбудитель бактериального менингита, экспрессирует рецепторы клеточной поверхности для несущих железо белков трансферрина и лактоферрина (Evans & Oakhill (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):705-7). Helicobacter pylori, этиологический агент гастрита и пептической язвенной болезни у людей, экспрессирует рецептор для человеческого лактоферрина (Husson et al. (1993) Infect. Immun. 61(6):2694-7) и Staphylococcus aureus экспрессирует рецептор для гемоглобина (Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9). Таким образом, ковалентные конъюгаты изобретения можно применять для уничтожения патогенных организмов, которые имеют рецепторы для несущих железо белков в конъюгате. Например, ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и человеческим галотрансферрином можно применять для лечения бактериального менингита, вызванного N. meningitides, или гастрита и пептической язвенной болезни, вызванной Helicobacter pylori.

В соответствии со способами по изобретению ковалентные конъюгаты между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком обладают более высокой цитотоксической активностью при введении в злокачественные клетки, по сравнению с отдельным введением относящегося к артемизинину эндопероксида и несущего железо белка. Кроме того, ковалентные конъюгаты изобретения эффективны при уничтожении патогенов с рецепторами для несущих железо белков.

Во втором аспекте изобретение предоставляет способы введения композиций, включающих ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком, нуждающемуся в них субъекту. Ковалентные конъюгаты между относящимися к артемизинину эндопероксидами и несущими железо белками представляют собой описанные выше. Например, некоторые варианты осуществления предоставляют ковалентные конъюгаты между артелинатом и голотрансферрином, как описано в примере 1.

Данные способы применимы к любому животному, такому как человек. Например, субъект, нуждающийся в композициях, включающих ковалентные конъюгаты между относящимися к артемизинину эндопероксидами и несущим железо белком, может представлять собой больного злокачественной опухолью. Как описано выше, быстро пролиферирующие клетки, такие как злокачественные клетки, в целом обладают более высокими концентрациями рецепторов трансферрина на клеточной поверхности. Способы предоставляют механизм для селективной доставки и эндопероксидной части, и железа, с которым она взаимодействует, к быстро пролиферирующим клеткам, таким как злокачественные клетки. Соответственно, изобретение предоставляет способы лечения злокачественной опухоли введением нуждающемуся в нем человеку или животному эффективного количества соединения, включающего ковалентный конъюгат между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком. Другие состояния, при которых имеется повышенная пролиферация клеток и которые можно лечить ковалентными конъюгатами изобретения, включают, но не ограничиваются, рестеноз, аутоиммунные заболевания, артрит, отторжение трансплантата, воспалительные кишечные заболевания или пролиферацию, вызванную после медицинских процедур. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение ковалентного конъюгата между артелинатом и человеческим голотрансферрином.

Соединения и композиции, включающие ковалентные конъюгаты между относящимся к артемизинину эндопероксидом и несущим железо белком, можно также вводить для лечения инфекции патогеном, экспрессирующим рецепторы клеточной поверхности для несущих железо белков в ковалентном конъюгате. Используемый здесь термин «лечение инфекции патогеном» относится к ингибированию роста патогена и/или предотвращения или облегчения симптомов заболевания, связанных с инфекцией.

Иллюстративные патогены с рецепторами для несущих железо белков описаны выше и включают Neisseria meningitides, которая экспрессирует рецептор для человеческого трансферрина, и H. pylori, которая экспрессирует рецептор для человеческого лактоферрина. Было показано, что S. aureas экспрессирует рецептор для гемоглобина (Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9), и аналогичные белки также экспрессируются Listeria monocytogenes и Bacillus anthracis (Cabanes et al. (2002) Trends. Microbiol. 10(5):238-45). Иллюстративный перечень патогенов, которые экспрессируют рецепторы для несущих железо белков, показан в таблице 1. Как только несущий железо белок связан с рецептором, экспрессируемым патогеном, железо или гем в целом высвобождается из несущего железо белка и транспортируется в клетку (см., например, Gray-Owens & Schryvers (1996) Trends Microbiol. 4(5):185-91; Wandersman & Stojiljkovic (2000) Curr. Op.Microbiol. 3:215-20).

Рецепторы для несущих железо белков в патогенах человека и животныхПатогенХозяинЗаболеваниеРецепторMoraxella bovisКороваКератоконъюнктивитТрансферрин, лактоферрин¹Moraxella catarrhalisЧеловекСредний отитТрансферрин, лактоферрин¹Moraxella lacunataЧеловекКератоконъюнктивитТрансферрин, лактоферрин¹Neisseria meningitidisЧеловекМенингитТрансферрин, лактоферрин, гемоглобин^{1, 19}Neisseria gonorrheaeЧеловекГонореяТрансферрин, лактоферрин, гемоглобин^{1, 18}Actinobacillus actinomycetecomitansЧеловекЮношеский периодонтитТрансферрин¹Actinobacillus equuliЛошадьСептицемияТрансферрин¹Actinobacillus pleuropneumoniaeСвиньяПневмонияТрансферрин¹Haemophilus agniiОвцаСептицемияТрансферрин¹Haemophilus aviumДомашняя птицаСинуситТрансферрин¹Haemophilus influenzaeЧеловекМенингит, средний отитТранферрин, гемоглобин^{1, 20}Haemophilus paragallinarumДомашняя птицаИнфекционный острый ринитТрансферрин¹Haemophilus somnusКороваТромбоэмболический менингоэнцефалитТрансферрин¹Haemophilus parasuisСвиньяБолезнь ГлассьеТрансферрин¹Haemophilus ducreyiЧеловекЯзвенная болезнь половых органовГемоглобин¹⁵Pasteurella haemolyticaКорова, овца, козаСыпной тиф, пастереллезТрансферрин¹Pasteurella multocidaКороваПневмония, септицемияТрансферрин¹Staphylococcus aureusЧеловекБактеремия, пневмония, эндокардит, септический артрит, остеомиелит, глубокие абсцессы, пищевое отравлениеТрансферрин, гемоглобин^{2, 13}Staphylococcus epidermidisЧеловекЭндокардит, эндофтальмит, септицемия, циститТрансферрин²    Staphylococcus pneumoniaeЧеловекПневмония, менингит, бактеремия, средний отитЛактоферрин³Leishmania chagasiЧеловекЛейшманиозТрансферрин, лактоферрин⁴Eischerichia coli K88СвиньяЭнтеропатогенезТрансферрин⁵Tritrichomonas foetusКрупный рогатый скотТрихомонозЛактоферрин, гемоглобин⁶Treponema pallidumЧеловекСифилисЛактоферрин⁷Mycoplasma pneumoniaЧеловекПневмонияЛактоферрин⁸Bordetella pertussisЧеловекКоклюшЛактоферрин⁹Trichomonas vaginalisЧеловекВагинозЛактоферрин¹⁰Aeromonas salmonicidaРыбаФурункулезТрнасферрин, лактоферрин¹¹Helicobacter pyloriЧеловекГастрит, язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, аденокарцинома, лимфома желудкаЛактоферрин¹²Yersinia enterocoliticaЧеловекЭнтеритГемоглобин, миоглобин, гемопексин, каталаза, альбумин-гем¹⁴Vibrio vulnificusУгорьПищевое отравление, септицемия, раневые инфекцииГемоглобин¹⁶Porphyromonas gingivalisЧеловекЗаболевания периодонтаГемоглобин¹⁷

1Gray-Owen & Schryvers (1996) Trends Microbiol. 4(5):185-912Modun et al. (1999) Infect. Immun. 66(8):3591-63Hammerschmidt et al. (1999) Infect. Immun. 67(4):1683-74Briigan et al. (1998) Adv. Exp. Med. Biol. 443:135-405Grange et al. (1997) Adv. Exp. Med. Biol. 412:357-616Tachezy et al. (1996) Exp. Parazitol. 83(2):216-287Alderete et al. (1988) Genitourin. Med. 64(6):359-638Tryon & Baseman (1987) Microb. Pathog. 3(6):437-439Redhead et al. (1987) J. Gen. Microbiol. 133(4):891-810Peterson & Alderete (1984) J. Exp. Med. 160(2):398-41011Chart & Trust (1983) J. Bacteriol. 156(2):758-6412Dhaenens et al. (1997) Infect. Immun. 65(2):514-813Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-914Bracken et al. (1999) J. Bacteriol. 181(19):6063-7215Al-Twafinq et al. (2000) J. Infect. Dis. 181(3):1049-5416Fouz et al. (1997) Microbiol. Lett. 156(2):187-9117Simpson et al. (2000) J. Bacteriol. 182(10):5737-4818Chen et al. (1996) Infect. Immun. 64:5008-1419Stojiljkovic et al. (1996) J. Bacteriol. 179(15):4670-7820Frangipane et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 118:243-8

Способы данного аспекта изобретения предоставляют механизм селективной доставки эндопероксидной части и железа, с которым она взаимодействует, непосредственно к клеточной мембране патогенных организмов связыванием ковалентного конъюгата к рецептору для несущего железо белка. В соответствии со способами по изобретению эндопероксидная часть в связанном ковалентном конъюгате взаимодействует с железом или гемом, высвобождаемыми из несущего железо белка, продуцируя вредные свободные радикалы в непосредственной близости к патогену. Соответственно, изобретение предоставляет способы лечения заболеваний, вызванных Helicobacter pylori, введением эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат между связанным с артемизинином эндопероксидом и человеческим гололактоферрином, нуждающемуся в нем человеку. Изобретение также предоставляет способы лечения заболеваний, вызванных Neisseria meningitides, введением эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат между связанным с артемизинином эндопероксидом и человеческим гололактоферрином, нуждающемуся в нем человеку.

Другие иллюстративные инфекции, которые можно лечить введением эффективного количества композиции, включающей ковалентный конъюгат изобретения, включают местные бактериальные инфекции, такие как гингивит, кожные и глазные инфекции.

Эффективные количества ковалентных конъюгатов будут в целом находиться в диапазоне до максимально переносимой дозировки, но концентрации не имеют решающего значения и могут широко варьироваться. Точные количества, используемые лечащим врачом, будут конечно варьироваться в зависимости от соединения, пути введения, физического состояния пациента и других факторов. Суточную дозировку можно ввести в виде однократной дозы, или ее можно разделить на множественные дозы для введения.

Действительно введенное количество конъюгатов изобретения будет представлять собой терапевтически эффективное количество, причем этот термин используется здесь для обозначения количества, необходимого для того, чтобы вызвать существенный благоприятный эффект. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости реакции от дозы, полученных на модельных системах тестирования in vitro или у животных. Экспериментальная модель также обычно используется для определения желательного диапазона дозировки и пути введения. Такая информация используется для определения полезных доз и путей введения у людей или других млекопитающих. Определение эффективной дозы находится в полной компетенции специалистов в данной области. Таким образом, действительно вводимое количество будет зависеть от конкретного субъекта, у которого предстоит применить лечение, и предпочтительно будет представлять собой оптимизированное количество, с тем, чтобы желательный эффект достигался без значительных побочных эффектов.

Терапевтическую эффективность и возможную токсичность ковалентных конъюгатов можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или у экспериментальных животных (например, ED₅₀, дозу, терапевтически эффективную у 50% популяции; и LD₅₀, дозу, летальную для 50% популяции). Соотношение доз между терапевтическим и токсическим эффектами представляет собой терапевтический показатель, и его можно выразить в виде отношения LD₅₀ к ED₅₀. Ковалентные конъюгаты, которые проявляют большие терапевтические показатели, особенно подходят при осуществлении способов по изобретению. Данные, полученные из анализов клеточных культур и экспериментальных исследований, можно использовать при составлении композиций диапазона дозировок для использования у людей или других млекопитающих. Дозировка таких конъюгатов лежит предпочтительно в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с небольшой или отсутствующей токсичностью. Дозировка обычно варьируется в пределах диапазона, зависящего от используемой лекарственной формы, чувствительности пациента и пути введения. Таким образом, оптимальные количества будут варьироваться в зависимости от способа ведения, и в целом будут соответствовать количествам обычных лекарственных средств, вводимых в такой же или аналогичной форме.

Ковалентные конъюгаты изобретения можно вводить отдельно или в комбинации с одним или более дополнительных терапевтически активных средств. Например, при лечении злокачественной опухоли конъюгаты можно вводить в комбинации с терапевтическими средствами, включающими, но не ограничивающимися, ингибиторы андрогена, такие как флутамид и лупролид; антиэстрогены, такие как томоксифен; антиметаболиты и цитотоксические средства, такие как даунорубицин, фторурацил, флоксуридин, интерферон альфа, метотрексат, пликамицин, меркаптопурин, тиогуанин, адриамицин, кармустин, ломустин, цитарабин, циклофосфамид, доксорубицин, эстрамустин, алтретамин, гидроксимочевина, ифосфамид, прокарбазин, мутамицин, бусулфан, митоксантрон, карбоплатин, цисплатин, стрептозоцин, блеомицин, дактиномицин и идамицин; гормоны, такие как медроксипрогестерон, эстрамустин, этинилэстрадиол, эстрадиол, лейпролид, мегестрол, остреотид, диэтилстилбестрол, хлортрианисен, этопозид, подофиллотоксин и госерелин; производные иприта, такие как мелфалан, хлорамбуцил, метлоретамин и тиотепа, стероиды, такие как бетаметазон; и другие противоопухолевые средства, такие как живая Mycobacterium bovis, дикарбазин, аспарагиназа, лейковорин, митотан, винкристин, винбластин и таксотер. Соответствующие количества в каждом случае будут варьироваться в зависимости от конкретного средства и будут или вполне известны специалистам в данной области, или будут легко определяемы обычным экспериментированием.

Ковалентные конъюгаты изобретения можно также вводить в комбинации с соединением, которое увеличивает транспорт железа в клетки, например, увеличением на поверхности клеток количества рецепторов для несущего железо белка в конъюгате. Например, было показано, что инсулин, подобный инсулину фактор роста I, и эпидермальный фактор роста вызывают увеличение количества рецепторов трансферрина на поверхности клеток (см., например, Davis et al. (1987) J. Biol. Chem. 261(19):8708-11; Davis et al. (1986) J. Biol. Chem. 262(17):13126-34). Поэтому в некоторых вариантах осуществления ковалентные конъюгаты изобретения вводят в комбинации с инсулином, подобным инсулину фактором роста I, или эпидермальным ростовым фактором.

Введение ковалентных конъюгатов изобретения осуществляется любым эффективным путем, например, перентерально или перорально. Способы введения включают местное (например, в виде трансдермальных систем), ингаляционное, внутриартериальное, подкожное, интрамедуллярное, внутривенное, интраназальное, интраректальное, внутриглазное введение и другие обычные средства. Например, ковалентные конъюгаты можно инъецировать непосредственно в опухоль, вблизи опухоли или в кровеносный сосуд, который снабжает кровью опухоль.

Ковалентные конъюгаты изобретения можно составить в композицию, которая дополнительно включает подходящие фармацевтически приемлемые носители, включая эксципиенты и другие соединения, которые способствуют введению ковалентного конъюгата млекопитающему. Дополнительные детали по методикам составления композиций и введению можно найти в самом последнем издании (Maack Publishing Co, Easton PA).

Композиции для перорального введения можно составить с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в дозировках, подходящих для перорального введения. Такие носители обеспечивают возможность составлять композиции, содержащие ковалентные конъюгаты изобретения, в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, кашицеобразных составов, суспензий и т.д., подходящих для приема внутрь субъектом. Композиции для перорального применения можно составлять. Например, в комбинации с твердым эксципиентом, необязательно измельчая полученную смесь, и перерабатывая смесь гранул. При желании, после добавления подходящих дополнительных соединений для получения ядер таблеток или драже. Подходящие эксципиенты включают углеводородные или белковые наполнители. Они включают, но не ограничиваются, сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит, крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия; и смолы, включая гумарабик и трагакант; а также белки, такие как желатин и коллаген. При желании, можно добавить разрыхляющие или солюбилизирующие вещества, такие как поперечносшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.

Ядра драже предоставляются с подходящими покрытиями, такими как концентрированные сахарные растворы, которые могут также содержать гумарабик, тальк, поливинилпирролидон, гель карбопола, полиэтиленгликоль и/или двуокись титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты можно добавить к покрытиям таблеток или драже для идентификации изделия или для характеристики количества активного соединения (т.е. дозировки).

Ковалентные конъюгаты для перорального введения можно включить в композиции, например, в виде капсул из половин, насаживаемых сдавливанием, изготовленных из желатина, а также мягких, запаянных капсул, изготовленных из желатина и покрытия, такого как глицерин или сорбит. Капсулы из половин, насаживаемых сдавливанием, могут содержать эндопероксидные соединения, смешанные с наполнителем или связывающими агентами, такими как лактоза или крахмалы, смазывающие вещества, такие как тальк или стеарат магния, и, необязательно, солюбилизирующие агенты. В мягких капсулах ковалентные конъюгаты могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них.

Композиции для парентерального введения включают водные растворы одного или более ковалентных конъюгатов изобретения. Для инъекции ковалентные конъюгаты могут быть составлены в композиции в водных растворах, таких как физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хэнка, раствор Рингера или солевой раствор с приданными физиологическими буферными свойствами. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии ковалентных конъюгатов можно получить в виде соответствующих маслянистых суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло или синтетические, сложные эфиры жирных кислот, такие как олеат этила или триглицериды, или липосомы. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость ковалентных конъюгатов, для обеспечения возможности получения высоко концентрированных растворов.

Для местного или интраназального введения в композиции обычно используют усиливающие проникновение вещества, целесообразные для конкретного барьера, через который предстоит проникнуть. Примерами указанных веществ являются 2-пирролидон, N-метил-2-пирролидон, диметилацетамид, диметилформамид, пропиленгликоль, метиловый или изопропиловый спирт, диметилсульфоксид и азон. Кроме того, можно включить дополнительные вещества для того, чтобы сделать композицию косметически приемлемой. Примерами указанных веществ являются жиры, воски, масла, красители, отдушки, консервирующие агенты, стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. Можно также включить кератолитические вещества, такие как вещества, известные в данной области. Примерами являются салициловая кислота и сера. Для местного применения композиция может быть в виде трансдермальной мази или накладки для системной доставки соединения, и ее можно получить обычным путем (см., например, Drugs and the Pharmaceutical Sciences-Dekker); Harrys Cosmeticology (Leonard Hill Books).

Для ректального введения композицию можно вводить в виде суппозиториев или удерживающих клизм. Такие композиции можно получить смешиванием ковалентных конъюгатов с подходящим не раздражающим эксципиентом, который является твердым при обычных температурах, но жидким при ректальной температуре, и поэтому будет таять в прямой кишке для высвобождения препарата. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются, масло какао и полиэтиленгликоли.

Количества каждого из указанных различных типов добавок будет вполне очевидно для специалистов в данной области, причем оптимальные количества являются такими же, как в других, известных композициях, предназначенных для того же типа введения. Например, вещества, повышающие проникновение через ороговевающий слой кожи, обычно должны включаться на уровнях в пределах диапазона от около 0,1% до около 15%.

Композиции, содержащие ковалентные конъюгаты настоящего изобретения, можно изготовить способом, аналогичным способу, который известен в данной области (например, посредством способов обычного смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в жидкой среде, эмульгирования, инкапсуляции, улавливания или лиофилизации). Композиции можно также модифицировать для обеспечения соответствующих характеристик высвобождения, например, пролонгированного высвобождения или прицельного высвобождения обычными средствами (например, покрытием).

Композиции, содержащие ковалентные конъюгаты, могут быть предоставлены в виде соли и могут быть образованы со многими кислотами, включая, но не ограничиваясь, хлористоводородную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и т.д. Соли имеют тенденцию быть боле растворимыми в водных или других протонных растворителях, которые представляют собой соответствующие формы свободного основания.

После того, как были получены такие композиции, составленные для включения ковалентных конъюгатов и приемлемого носителя, их можно поместить в соответствующий контейнер и снабдить этикеткой для применения.

Следующие примеры просто иллюстрируют лучший способ, предусмотренный в настоящее время для осуществления изобретения, но их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.

Пример 1

В данном примере описан способ изготовления репрезентативной композиции изобретения, содержащей одну или более молекул относящегося к артемизинину эндопероксида, ковалентно связанных с молекулой голотрансферрина.

Синтез гидразида артелиновой кислоты (ART-NH-NH₂): Попытки получить гидразидное производное артезуната были неуспешными и привели к образованию дигидроартемизинина вследствие реакции циклизации. Артелинат синтезировали из дигидроартемизинина, как описано ранее (Shrimali et al. (1998) Indian J. Chem. 37B:1161-1163). Артелиновую кислоту (0,1 г, 0,24 ммоль) растворяют в безводном ацетонитриле (0,48 мл). К данному раствору добавляют 1-гидроксибензтриазол (HOBt) (0,038 г, 0,29 ммоль) с последующим добавлением этилдиметилэтилкарбодиимида (0,055 г, 0,29 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре и контролируют тонкослойной хроматографией (ТСХ, TLC) до тех пор, пока кислота не превратится в сложный HOBt эфир.

Раствор гидразина (0,46 мл, 0,48 ммоль) в ацетонитриле (0,48 мл) охлаждают до 0°С, и указанную выше реакционную смесь добавляют к нему, в то же самое время поддерживая температуру в диапазоне от 0 до 10°С. Реакция завершается через 10 минут, по данным измерения ТСХ. Реакционную смесь выливают в воду (5 мл), экстрагируют этилацетатом (3×10 мл) и промывают соляным раствором. Органическую фазу отделяют, сушат над безводным сульфатом натрия и выпаривают досуха. Неочищенный продукт очищают хроматографией на силикагеле с использованием градиента метанол/хлороформ для получения чистого продукта (0,078 г) при выходе 76%.

Синтез конъюгата артелината-голотрансферрина: Голотрансферрин (2 мг), растворенный в 1 мл 0,1 моль/л ацетата натрия с рН 5,5, окисляют на уровне его гликанов при комнатной температуре в течение 30 минут 10 ммоль/л перйодата натрия. Раствор наносят на короткую колонку Sephadex G-25, оборудованную УФ монитором. Колонку элюируют 0,1 моль/л ацетата натрия при рН 5,5 и собирают белковые фракции. Раствор избыточного ART-NH-NH₂ добавляют к окисленному голотрансферрину, и реакционную смесь держат в течение ночи при комнатной температуре при осторожном встряхивании. Затем раствор конъюгата артелината-голотрансферрина наносят на колонку Sephadex G-25 для удаления избыточного ART-NH-NH₂. Колонку элюируют буфером 0,1 моль/л Tris-HCl при рН 7,5 и собирают белковые фракции. Конъюгат хранят при 4°С.

Конъюгат артелината-голотрансферрина очищают ВЭЖХ гидрофобного взаимодействия для получения однородного белкового конъюгата. Количество молекул артелината на молекулу голотрансферрина определяют масс-спектрометрией распылением ионов.

Хотя был проиллюстрирован и описан предпочтительный вариант осуществления изобретения, следует понимать, что в него можно внести различные изменения без отхода от сущности и диапазона изобретения.

Пример 2

В данном примере описан способ изготовления репрезентативной композиции изобретения, содержащей одну или более молекул относящегося к артемизинину эндопероксида, ковалентно связанных с молекулой гемоглобина.

Для ковалентной модификации не гликозилированных белков, таких как гемоглобин с производными артемизинина, производные карбоновых кислот артемизинина, такие как артелиновая кислота, сначала активируют в виде сложного эфира N-гидроксисукцинимида (HOSu) для взаимодействия с остатками лизина на поверхности белка. Артелиновую кислоту (4,2 мг, 0,01 ммоль) растворяют в диметилформамиде (ДМФ, DMF) (0,5 мл) и раствор охлаждают в ледяной бане. В данный раствор добавляют карбодиимид N-этил-N′-диметиламиноэтила (EDC) (1,5 мг, 0,01 ммоль) и HOSu (1,1 мг, 0,01 ммоль). Реакционную смесь держат, перемешивая, в течение 2 часов при 0°С для завершения образования сложного эфира HOSu артелиновой кислоты.

Гемоглобин (10 мг) растворяют в 0,1 М фосфатном буфере при рН 7,0 (5 мл). Раствор в ДМФ сложного эфира HOSu артелиновой кислоты медленно добавляют при перемешивании при 0°С к раствору гемоглобина. Реакционную смесь держат, перемешивая, в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь наносят на колонку Sephadex G-25, которая уравновешена 0,1 М фосфатным буфером при рН 7, и колонку элюируют тем же буфером. Модифицированный гемоглобин элюируется при объеме опорожнения. Фракции, содержащие гемоглобин, объединяют и затем очищают ВЭЖХ гидрофобного взаимодействия. Количество молекул производных артемизинина, прикрепленных к белку, определяют масс-спектрометрией распылением ионов.

Данное изобретение относится к медицине и фармакологии и может быть использовано для лечения злокачественной опухоли и инфекций, вызванных патогенами, которые связывают несущие железо белки. Настоящее изобретение представляет собой ковалентный конъюгат, относящийся к артемизинину эндопероксида и железосодержащего белка. Изобретение обеспечивает увеличение эффективности лечения злокачественной опухоли и инфекций, вызванных патогенами, которые получают железо интернализацией несущих железо белков-хозяев. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Ковалентный конъюгат относящегося к артемизинину эндопероксида и железосодержащего белка.2. Коньюгат по п.1, в котором относящийся к артемизинину эндопероксид включает артелинат.3. Коньюгат по п.1, в котором относящийся к артемизинину эндопероксид представляет собой гидразидное производное.4. Коньюгат по п.2, в котором относящийся к артемизинину эндопероксид имеет структуру

где n=1-3, m=0-3, Ar = арил и Y=-(C=O)NH-, -NH- или -О-.